Bước 1: Loại lipid bằng phương pháp gây kết tủa lạnh lòng đỏ trứng gà với nước cất.
-Pha loãng lòng đỏ trứng với nước cất theo tỷ lệ khác nhau về thể tích từ 1:5 đến 1:11
-Đánh tan huyền dịch (dùng máy khuấy từ, ở 4O
C )
-Để lắng qua đêm ở 4o
C
- Thu phần dịch nổi bằng ly tâm loại bỏ cặn lắng
Bước 2: Tủa phân đoạn IgY bằng (NH4)2SO4
- (NH4)2SO4 sẽ tủa các protein khác nhau ở các nồng độ khác nhau.
- Dịch nổi thu được ở bước 1 được tủa bằng (NH4)2SO4 nồng độ từ 20% đến 60% độ bão hòa ở 4o
C trong 2 giờ.
- Ly tâm bỏ dịch nổi, thu cặn chứa IgY.
- Hòa tan cặn trong dung dịch đệm phosphat (PBS).
- Thẩm tích loại nước trong 48 giờ với dung dịch PBS. Bước 3: Tinh sạch IgY bằng sắc ký trao đổi ion
- Sử dụng cột anion thu các phân đoạn bám cột và có hoạt tính kháng TKMX.
- Sử dụng cột anion trên hệ thống sắc ký áp suất thấp Biologic-LP do hãng BioRad cung cấp với hệ đệm gồm:
o Dung dịch đệm A: dung dịch Tris-HCl pH 7,94
o Dung dịch đệm B: đệm A + 0,5M NaCl
• IgY thu được sau thẩm tích ở bước 2 được pha trong 2mL dịch đệm A, sau đó cho vào hệ thống cột. Protein bám vào cột được tách bằng cách tăng dần đều nồng độ của dịch đệm B, tốc độ dòng 1mL/ph. Toàn bộ các phân đoạn sắc ký được thu hồi bằng hệ thống thu mẫu tự động, thể tích mỗi phân đoạn là 1mL.
• Sản phẩm protein thu được ở mỗi bước đều được phân tích nồng độ bằng phương pháp Bradford; điện di SDS-PAGE; xét nghiệm ELISA tìm sự có mặt của kháng thể IgY đặc hiệu với kháng nguyên đã dùng để gây miễn dịch.
Hình 2.3: Hệ thống sắc ký trao đổi ion (BioRad, Mỹ).