2.3.15. Phương pháp xử lý số liệu
Số liệu thu thập được xử lý thống kê bằng phần mềm MicroSoft Excel, phân tích số liệu dựa trên các nguyên lý thống kê y học. Các chỉ số đưa ra trong quá trình phân tích: tỷ lệ phần trăm, giá trị trung bình, độ lệch chuẩn, p.
2.4. ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU
Toàn bộ nội dung nghiên cứu được thực hiện tại các Bộ môn và Trung tâm nghiên cứu y dược của Học viện Quân y:
- Nuôi cấy TKMX, chế tạo sinh khối TKMX và các xét nghiệm vi sinh được thực hiện tại Bộ môn Vi sinh y học, Bệnh viện 103.
- Chế tạo kháng nguyên và gây miễn dịch, thử nghiệm in vitro và kiểm định chất lượng chế phẩm IgY được tiến hành tại Bộ môn Miễn dịch và Phòng protein-Độc chất-Tế bào, Trung tâm nghiên cứu y dược học quân sự.
- Xét nghiệm mô bệnh học được thực hiện tại Bộ môn Giải phẫu bệnh, Bệnh viện 103.
2.5. ĐẠO ĐỨC NGHIÊN CỨU
Đây là nghiên cứu thực nghiệm trên các đối tượng gà mái và thỏ nhằm mục tiêu chế tạo các sản phẩm thuốc phục vụ cho mục đích chữa bệnh ở người. Các động vật thí nghiệm luôn được chăm sóc trong điều kiện vệ sinh sạch sẽ, cung cấp thức ăn và nước uống dư thừa. Các thao tác lấy máu, tạo vết bỏng, thay băng, gây mê, sinh thiết... được thực hiện theo qui định chung cho động vật thí nghiệm.
CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ
3.1. CHẾ TẠO GLOBULIN MIỄN DỊCH TỪ LÒNG ĐỎ TRỨNG GÀ KHÁNG TRỰC KHUẨN MỦ XANH KHÁNG TRỰC KHUẨN MỦ XANH
3.1.1. Kết quả gây miễn dịch tạo kháng thể IgY đặc hiệu với trực khuẩn mủ xanh mủ xanh
3.1.1.1 Phát hiện kháng thể IgY đặc hiệu với trực khuẩn mủ xanh trong
máu gà
Kết quả xét nghiệm ELISA phát hiện IgY đặc hiệu trong máu gà trước khi gây miễn dịch lần 1 và sau các lần gây miễn dịch từ lần 2 đến lần 5 phản ứng với hỗn hợp kháng nguyên siêu nghiền của 7 chủng TKMX được thể hiện trong Hình 3.1.
Hình 3.1: Biến động hiệu giá IgY đặc hiệu trực khuẩn mủ xanh trong máu gà trước và sau khi gây miễn dịch ở các lô gà thí nghiệm.
Nhận xét:
- Trước khi gây miễn dịch không có phản ứng của kháng thể IgY kháng TKMX trong máu của cả 3 lô gà.
- Sau lần gây miễn dịch thứ hai đã xuất hiện kháng thể IgY kháng TKMX trong máu cả 3 lô gà, trong đó hiệu giá kháng thể ở lô 3 đạt cao nhất (64.000) và duy trì liên tục sau các lần gây miễn dịch nhắc lại. - Hiệu giá kháng thể ở các lô 1 và 2 tăng chậm hơn và chỉ đạt 64.000 sau
lần gây miễn dịch thứ 5. - Gây miễn dịch ở nồng độ 108
vi khuẩn/mL (lô 3) kích thích sinh kháng thể nhanh và mạnh hơn so với gây miễn dịch ở nồng độ 106
(lô1) và 107 (lô 2) vi khuẩn/mL được khảo sát.
3.1.1.2. Phát hiện kháng thể IgY đặc hiệu với trực khuẩn mủ xanh trong trứng gà
Hoạt tính kháng thể IgY trong trứng do các gà mái đẻ ra sau lần gây miễn dịch thứ 5 được khảo sát bằng cách tách chiết IgY từ lòng đỏ trứng được hoàn nguyên về thể tích lòng đỏ ban đầu, sau đó pha loãng với các mức pha loãng khác nhau và tiến hành phản ứng ELISA với hỗn hợp kháng nguyên siêu nghiền của 7 chủng vi khuẩn được thể hiện trong Hình 3.2. Trứng do gà mái không gây miễn dịch được nuôi trong cùng điều kiện thí nghiệm đẻ ra được sử dụng làm chứng âm.
Hình 3.2: Hoạt tính IgY đặc hiệu trực khuẩn mủ xanh trong lòng đỏ trứng gà được đẻ ra sau lần gây miễn dịch thứ 5 ở các lô gà thí nghiệm. Nhận xét:
- Không có hoạt tính kháng thể IgY kháng TKMX trong trứng do gà không gây miễn dịch đẻ ra (chứng âm).
- Các mẫu trứng thu được ở cả 3 lô gà sau khi gây miễn dịch với kháng nguyên TKMX lần 5 đều cho phản ứng dương tính, trong đó hoạt tính kháng thể mạnh nhất ở lô 3. Điều này chứng tỏ IgY đặc hiệu với TKMX đã được chuyển từ máu gà sang tích luỹ trong lòng đỏ trứng gà, đồng thời gây miễn dịch ở nồng độ 108
vi khuẩn/gà/lần tiêm (lô 3) cho hoạt tính kháng thể trong trứng là mạnh nhất, tương ứng với hiệu giá kháng thể IgY trong máu gà cao nhất.
3.1.1.3. Hoạt tính IgY kháng từng chủng trực khuẩn mủ xanh riêng rẽ
Các trứng gà ở lô 3 là lô có hoạt tính IgY kháng TKMX trong máu và trong trứng gà cao nhất được lựa chọn cho các nghiên cứu tiếp theo của đề tài. Hoạt tính của chế phẩm kháng thể IgY tách chiết từ lòng đỏ trứng gà ở lô số 3 phản ứng với kháng nguyên siêu nghiền của từng chủng TKMX riêng rẽ, phân tích bằng xét nghiệm ELISA được thể hiện trong Hình 3.3.
Hình 3.3: Hoạt tính IgY trong lòng đỏ trứng gà kháng từng chủng trực khuẩn mủ xanh riêng rẽ. Nhận xét:
- Hoạt tính IgY kháng đa giá với 7 chủng TKMX khi thử riêng rẽ với từng chủng đều có phản ứng đặc hiệu. Tuy nhiên mức độ phản ứng
không giống nhau giữa các chủng TKMX đã được sử dụng để làm kháng nguyên gây miễn dịch.
- Mức độ phản ứng mạnh nhất với các chủng 1100P2 và 36P8; Mức độ phản ứng trung bình với các chủng 6 P11, 9HP13, 79P16 và 7P8; và thấp nhất đối với chủng M27P11.
- Chế phẩm IgY tách chiết từ lòng đỏ trứng gà nuôi trong cùng điều kiện nhưng không gây miễn dịch với kháng nguyên TKMX cho kết quả âm tính.
3.1.1.4. Phân tích kháng thể IgY đặc hiệu với trực khuẩn mủ xanh bằng kỹ thuật Western blot
Protein kháng nguyên siêu nghiền của từng chủng vi khuẩn được phân tách bằng điện di SDS-PAGE 12% trong điều kiện biến tính theo phương pháp của Laemmli sau đó được chuyển qua màng nitrocellulose bằng điện di và ủ với chế phẩm kháng thể IgY tách chiết từ lòng đỏ trứng gà ở lô số 3 là lô có hiệu giá kháng thể cao nhất. Hoạt tính kháng thể kháng các thành phần protein của từng chủng TKMX riêng rẽ đã được phân tách bằng phương pháp điện di SDS-PAGE được thể hiện trong Hình 3.4.
Hình 3.4: Kết quả phân tích hoạt tính kháng thể IgY đặc hiệu với các kháng nguyên của từng chủng trực khuẩn mủ xanh bằng kỹ thuật Western blot.
Chủ thích: Từ 1-7: Các chủng TKMX M27P11; 6P11; 79P16;
Nhận xét:
- Kết quả phân tích bằng điện di SDS-PAGE cho thấy các thành phần protein kháng nguyên của 7 chủng TKMX thuộc 5 type huyết thanh đã thử tương đối giống nhau (ảnh trên). Các protein kháng nguyên của vi khuẩn siêu nghiền thu được bao gồm rải rác cả các protein có kích thước lớn > 100 KDa cho đến các protein có kích thước nhỏ < 20 KDa. - Với kỹ thuật phân tích SDS-PAGE hiện tại chưa có khả năng phát hiện
được những khác biệt đáng kể về các thành phần kháng nguyên protein của các chủng TKMX khác nhau.
- Kết quả phân tích bằng kỹ thuật Western blot (ảnh dưới) cho thấy các băng màu xuất hiện rải rác ở tất cả các vị trí tương ứng với từng chủng TKMX. Hình ảnh xuất hiện các băng màu cả ở những protein kháng nguyên có kích thước lớn > 100 KDa cũng như nhỏ < 20 KDa. Chứng tỏ các protein này đều có tính sinh miễn dịch khi được đưa vào cơ thể gà mái.
- Chế phẩm IgY được khảo sát có phản ứng với các thành phần kháng nguyên protein siêu nghiền của cả 7 chủng TKMX được nghiên cứu.
3.1.2. Tách chiết, tinh sạch IgY từ lòng đỏ trứng gà
3.1.2.1. Ảnh hưởng các tỉ lệ pha loãng lòng đỏ trứng/nước đến hiệu quả
tách chiết IgY
Lòng đỏ trứng được pha loãng với nước cất lạnh ở các tỷ lệ khác nhau từ 1:5 đến 1:11, sau đó để lắng và thu hoạch dịch nổi như mô tả ở bước 1 mục 2.3.3. Sản phẩm thu được điều chỉnh về cùng thể tích và đánh giá hoạt tính của kháng thể bằng phản ứng ELISA trong cùng điều kiện thí nghiệm. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ pha loãng lòng đỏ trứng/nước đến hiệu quả tách chiết IgY được thể hiện trong Hình 3.5.
Hình 3.5: Ảnh hưởng các tỉ lệ pha loãng lòng đỏ trứng/nước đến hiệu quả tách chiết IgY.
Nhận xét:
- Trong các điều kiện để tách chiết IgY được khảo sát, tỷ lệ pha loãng lòng đỏ trứng 1:9 trong nước cất lạnh là thu được kháng thể IgY với hoạt tính cao nhất.
- Ở các tỷ lệ thấp hơn hoặc cao hơn, sự chênh lệch về lượng protein thu được không đáng kể nhưng hoạt tính kháng thể không cao bằng tỷ lệ 1:9.
- Điều này có thể giải thích là do ở độ pha loãng thấp lượng nước không đủ để hoà tan hết lượng kháng thể có trong lòng đỏ trứng, còn ở các tỷ lệ cao hơn kháng thể thu hồi bị pha loãng quá lớn mặc dù số lượng kháng thể thu được lớn nhưng sẽ phải mất nhiều công đoạn để thu hồi sản phẩm dẫn đến giảm hoạt tính cũng như hao hụt mất kháng thể.
3.1.2.2. Ảnh hưởng của pH đến hiệu quả tách chiết IgY
Lòng đỏ trứng gà được pha loãng theo tỷ lệ 1:9 với nước có pH từ 3,0 tới 9,0. Sản phẩm thu được định lượng protein và kiểm tra độ đặc hiệu bằng phản ứng ELISA trong cùng điều kiện thí nghiệm. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của pH đến hiệu quả tách chiết IgY được trình bày trong Hình 3.6.
Hình 3.6: Ảnh hưởng của pH đến hiệu quả tách chiết IgY. Nhận xét: Nhận xét:
- Chế phẩm IgY thu được với hoạt tính mạnh nhất ở pH 6,0. Điều này cũng phù hợp với đặc tính ổn định của IgY trong điều kiện pH từ 3,5 đến 11,0.
- Ở pH 3,0 hoạt tính của IgY rất yếu có thể do pH quá acid này làm biến tính IgY.
- Ở pH cao hơn (8,0 đến 9,0) cũng làm ảnh hưởng tới hoạt tính của IgY. - pH 6,0 tỏ ra là pH tối ưu để tách chiết IgY từ lòng đỏ trứng. Điều này cũng phù hợp với những qui tắc chung trong thao tác với các phân tử kháng thể.
3.1.2.3. Ảnh hưởng của nồng độ sulphat amoni bão hòa đến hiệu quả tách chiết IgY
Lòng đỏ trứng gà sau khi được tách chiết bằng nước với tỷ lệ 1:9, pH 6,0 được tủa với muối sulphat amoni ở các nồng độ từ 20% đến 60%. Chế phẩm thu được tiến hành phản ứng ELISA trong cùng điều kiện thí nghiệm. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nồng độ muối sulphat amoni đến hiệu quả tách chiết IgY được thể hiện trong Hình 3.7.
Hình 3.7: Ảnh hưởng của nồng độ sulphat amoni bão hòa đến hiệu quả tách chiết IgY.
Nhận xét:
- Kết tủa IgY bằng muối sulphat amoinở nồng độ 40% bão hoà cho hoạt tính kháng thể thu được là mạnh nhất.
- Ở nồng độ muối thấp (20 đến 30%) có thể chưa kết tủa hết IgY còn ở nồng độ muối cao (50 đến 60%) lại có thể tạp lẫn các protein khác không phải IgY vào hỗn hợp protein thu được.
3.1.2.4. Phân tích và tinh sạch sản phẩm IgY bằng sắc ký trao đổi ion
Phân đoạn protein tủa ở 40% sulphat amoni bão hòa sau thẩm tích loại muối được phân tách tiếp bằng sắc ký trao đổi ion. Sắc ký đồ sắc ký trao đổi ion của chế phẩm kháng thể thu được sau kết tủa với sulphat amoni được trình bày trong Hình 3.8. Hoạt tính kháng thể IgY đặc hiệu với TKMX trong các phân đoạn sắc ký được kiểm tra bằng kỹ thuật ELISA và được trình bày trong Hình 3.9.
Hình 3.8: Sắc ký đồ trao đổi ion sản phẩm sau tủa bằng sulphat amoni.
Nhận xét:
- Sắc ký đồ ở Hình 3.8 cho thấy có 2 đỉnh protein. Đỉnh 1 là các protein không bám vào cột và được đẩy ra cùng với dung dịch đệm ở giai đoạn nạp mẫu và rửa cột với dung dịch đệm A có nồng độ muối thấp. Đỉnh 2 là phân đoạn protein được đẩy ra khỏi cột bằng dung dịch đệm B có nồng độ muối cao.
Hình 3.9: Kết quả phân tích bằng ELISA kiểm tra hoạt tính kháng thể ở các phân đoạn sắc ký. Mỗi phân đoạn được pha loãng ở một hàng theo
chiều từ trên xuống dưới
Nhận xét:
- Kết quả khảo sát hoạt tính kháng thể đặc hiệu kháng TKMX ở Hình 3.9 cho thấy phân đoạn ở đỉnh 1 không có hoạt tính kháng thể, có thể thấy đây là các protein tạp. Phân đoạn ở đỉnh 2 có hoạt tính kháng thể mạnh với TKMX tương ứng với phần chứa kháng thể IgY.
- So sánh tỷ lệ tương đối giữa đỉnh 1 và đỉnh số 2 cho thấy sản phẩm IgY thu được sau tủa phân đoạn với sulphat amoni 40% bão hoà còn chưa sạch.
3.1.2.5. Kết quả điện di SDS-PAGE sản phẩm IgY sau các bước tách chiết,
tinh sạch
Độ tinh sạch của chế phẩm IgY sau các bước tách chiết và tinh sạch bằng sắc ký trao đổi ion được đánh giá tiếp bằng kỹ thuật điện di SDS-PAGE trong điều kiện biến tính. Kết quả điện di SDS-PAGE được trình bày trong Hình 3.10.
Hình 3.10: Kết quả điện di SDS-PAGE trong điều kiện biến tính các sản
phẩm sau mỗi bước tách chiết tinh sạch IgY từ lòng đỏ trứng gà.
Ghi chú:
1) Protein toàn phần tách bằng nước cất;
2) Protein sau kết tủa bằng sulphat amoni 40% bão hoà ; 3) Phân đoạn bám cột sắc ký trao đổi ion (đỉnh 2);
M) Protein marker;
Nhận xét:
- Protein toàn phần từ lòng đỏ trứng sau tách bằng nước cất chứa rất nhiều protein tạp. Các protein này được loại bỏ lần lượt bằng tủa phân đoạn với sulphat amoni và sắc ký trao đổi ion. Qui trình tinh sạch này tương đối đơn giản, cho IgY có độ tinh sạch cao hơn, trên SDS-PAGE thành phần protein tạp ít.
- Phân tích bằng SDS – PAGE cho thấy sản phẩm thu được sau sắc ký là tinh sạch nhất. Tuy nhiên sản phẩm thu được sau tủa với sunphat amoni là tinh sạch và có hoạt tính cao hơn. Với kích thước khoảng 70 kDa và 42 kDa, phù hợp với kích thước chuỗi nặng (H) và chuỗi nhẹ (L) của IgY, khẳng định sản phẩm thu được là IgY.
3.1.2.6. Hiệu suất tách chiết IgY từ lòng đỏ trứng
Hiệu suất tách chiết IgY từ lòng đỏ trứng được tính toán dựa trên sản lượng protein thu được sau mỗi bước tách chiết, tinh sạch so với tổng lượng protein có trong mẫu dịch pha loãng lòng đỏ trứng ban đầu. Kết quả được trình bày trong Bảng 3.1.
Bảng 3.1: Hiệu suất tách chiết IgY từ lòng đỏ trứng.
TT Các bước tách chiết thu được (mg/1 Lượng protein lòng đỏ trứng)
Hiệu suất (%)
Độ tinh sạch kháng thể
1 Dịch thu được sau tủa lipid bằng nước cất
1863,03 100 Tạp lẫn một số thành phần khác 2 Tủa sulphat amoni 202,01 10,84 Tương đối tinh
khiết 3 Sắc ký trao đổi ion 139,98 7,51 Tinh khiết
Nhận xét:
- Hiệu suất thu hồi protein tổng số trong đó có chứa IgY qua các bước có sự khác biệt lớn.
- Sau lọc, mặc dù thu được protein tổng số lớn nhưng kháng thể thu được có hoạt tính thấp do chứa nhiều protein tạp khác.
- Sản phẩm thu được sau tủa với muối sulphat amoni và sắc ký trao đổi ion với số lượng kháng thể thấp nhưng hoạt tính của kháng thể mạnh, độ tinh sạch cao hơn.
3.1.3. Độ ổn định của chế phẩm kháng thể IgY trong các điều kiện bảo quản khác nhau quản khác nhau
Để kiểm tra chế phẩm kháng thể IgY thu được sau quá trình tách chiết, tinh sạch và việc bảo quản kháng thể như thế nào để kháng thể không mất đi hoạt tính ức chế đối với TKMX, cần khảo sát điều kiện bảo quản chế phẩm kháng thể IgY ở các điều kiện bảo quản khác nhau: Nhiệt độ phòng; 4ºC và - 20ºC. Độ ổn định của kháng thể IgY trong các điều kiện bảo quản khác nhau được khảo sát thông qua đánh giá hoạt tính kháng thể IgY kháng TKMX bằng phản ứng ELISA với hỗn hợp kháng nguyên siêu nghiền của 7 chủng TKMX