Nhận xét chung:
- Mẫu mô được sinh thiết và xử lý làm tiêu bản đúng cách.
- Tổn thương của các vết thương bên phải và bên trái là tương tự nhau. - Các tế bào lớp biểu bì, chân bì, các nang lông,tuyến mồ hôi bị hoại tử, (tế bào trương to, nhân và bào tương bị thoái và đông vón đồng thời bắt màu hồng thuần nhất. Các tế bào sợi và sợi tạo keo ở lớp chân bì mất thớ sợi và bắt màu kiềm nhạt, các mao mạch máu dãn rộng nơi thành mạch máu bị hoại tử đông, mô liên kết ở vùng lân cận bị phù (các tế bào tách rời nhau). Trong lớp chân bì còn thấy hình ảnh phù nề
- Căn cứ hình ảnh Giải Phẫu Bệnh tổn thương của bỏng do cùng một tác nhân gây ra ở cùng một vị trí (da ở vùng lưng thỏ), tổn thương bỏng ở trên thuộc độ III sâu.
3.2.2.2. Kết quả gây nhiễm trực khuẩn mủ xanh lên vết thương bỏng
Kết quả lấy mẫu trước khi gây nhiễm không có vết bỏng nào có TKMX mọc, chứng tỏ điều kiện gây bỏng thực nghiệm không có tạp lẫn TKMX vào vết thương bỏng.
Sau khi gây nhiễm 24 giờ với số lượng 0,5x108
vi khuẩn/vết bỏng, cả 32/32 (100%) vết bỏng đều có TKMX phát triển. Tuy nhiên, số lượng TKMX ở một số vết thương thấp dưới 2x107
vi khuẩn/cm2
.
Những thỏ có ít nhất 1 vết thương có số lượng TKMX dưới 2x107
vi khuẩn/cm2
bị loại ra khỏi nhóm nghiên cứu, kết quả chỉ còn 13 thỏ với 26 vết thương gây nhiễm đạt yêu cầu với số lượng trung bình (1,79 ± 1,43)x109
/cm2 bề mặt vết bỏng. Tỷ lệ gây nhiễm thành công TKMX lên vết bỏng thực nghiệm đạt 13/16 thỏ (81%).
3.2.2.3. Số lượng trực khuẩn mủ xanh trên vết bỏng gây nhiễm trực
khuẩn mủ xanh trước và sau điều trị
Kết quả xét nghiệm số lượng TKMX trên vết bỏng gây nhiễm TKMX trước và sau điều trị bằng chế phẩm IgY kháng TKMX được trình bày trong Hình 3.17 và Bảng 3.3.
Hình 3.17: Biến động số lượng vi khuẩn trực khuẩn mủ xanh ở vết bỏng trước và sau điều trị.
Nhận xét:
- Số lượng vi khuẩn trung bình của TKMX ở nhóm các vết bỏng trước khi được điều trị bằng chế phẩm IgY là (1,76 ± 1,67)x109
/cm2 và trước điều trị bằng nước muối sinh lý là (1,82 ± 1,22)x109
/cm2 là tương đương nhau (p>0,05).
Bảng 3.3: Tỷ lệ % các loài vi khuẩn phân lập trên vết bỏng thỏ nhiễm trực
khuẩn mủ xanh chủng 6P11
(với liều gây nhiễm 0,5 x 108
vi khuẩn/mL) Thời điểm lấy mẫu (ngày thứ) Vết thương đối chứng (n = 13)
Vết thương điều trị bằng IgY (n = 13)
Loài vi khuẩn nhiTỷ lệ ễm Số lượng/cm2
Loài vi khuẩn nhiTỷ lệ ễm lượng/cmSố 2
2 P. aeruginosa 0/13 0 P. aeruginosa 0/13 0 S. aureus 10/13 <104 S. aureus 7/13 <104 3 P. aeruginosa 13/13 (1,82 ± 1,22) x109 P. aeruginosa 13/13 (1,76 ± 1,67) x109 S. aureus 8/13 <104 S. aureus 6/13 <104 S. epidermides 1/13 <104 S. epidermides 2/13 <104 6 P. aeruginosa 13/13 (7,22 ± 8,95) x108 P. aeruginosa 13/13 (3,45 ± 7,37) x109 S. aureus 7/13 <104 S. aureus 6/13 <104 S. epidermides 1/13 <104 S. epidermides 2/13 <104 9 P. aeruginosa 13/13 (1,50 ± 5,33) x109 P. aeruginosa 13/13 (1,80 ± 5,49)x105 S. aureus 6/13 <104 S. aureus 6/13 <104 S. epidermides 1/13 <104 S. epidermides 2/13 <104 12 P. aeruginosa 11/13 (3,24 ± 7,45) x107 P. aeruginosa 5/13 (1,55 ± 5,54) x104 S. aureus 4/13 <104 S. aureus 5/13 <104 S. epidermides 2/13 <104 S. epidermides 8/13 <104
- Sau khi điều trị bằng thay băng và tẩm đắp kháng thể IgY kháng TKMX, số lượng TKMX ở các vết thương có xu hướng giảm dần và giảm rõ
rệt sau ngày thứ 6. Đến ngày thứ 9 sau điều trị một số vết thương đã không còn TKMX phát triển, đây cũng là thời điểm một số vết thương được biểu mô hóa và co kéo kín (Bảng 3.3).
- Ở nhóm đối chứng, các vết thương được thay băng và tẩm đắp nước muối sinh l ý, số lượng TKMX cao nhất vào ngày thứ 6 sau đó có xu hướng giảm dần. Tuy nhiên tốc độ giảm chậm hơn so với nhóm được điều trị bằng kháng thể IgY kháng TKMX. Điều này cho thấy, chế phẩm IgY có tác dụng ức chế TKMX trên các vết bỏng thực nghiệm nhiễm TKMX.
3.2.2.4. Chủng loại và số lượng các vi khuẩn khác ở vết bỏng
Kết quả xét nghiệm số lượng và chủng loại một số vi khuẩn khác trên vết bỏng gây nhiễm TKMX trước và sau điều trị bằng chế phẩm IgY kháng TKMX được trình bày trong Bảng 3.3.
Ngày thứ hai sau gây bỏng, ngay trước khi gây nhiễm TKMX, có 17/26 (65%) vết thương có tụ cầu vàng (S. aureus) mọc.
Kết quả xét nghiệm 1 ngày sau gây nhiễm với TKMX vẫn có 18/26 vết thương có tụ cầu vàng mọc đồng thời có thêm 3/26 vết thương có tụ cầu trắng (S. epidermides) mọc. Tuy nhiên, số lượng của các loại vi khuẩn này đều thấp dưới 104
vi khuẩn/cm2
diện tích vết bỏng.
Kết quả xét nghiệm các ngày 6, 9 và 12 sau điều trị vẫn thấy các vết thương có hai loại vi khuẩn này mọc. Mặc dù số lượng của các vi khuẩn này vẫn duy trì ở mức độ thấp dưới 104
vi khuẩn/cm2
bề mặt vết thương, nhưng các vi khuẩn xuất hiện đều cả ở các vết thương được điều trị bằng kháng thể IgY kháng TKMX và vết thương được điều trị bằng nước muối. Điều này cho thấy kháng thể IgY kháng TKMX không có tác dụng lên các loài vi khuẩn này.
3.2.2.5. Tổn thương mô học ở vết bỏng nhiễm trực khuẩn mủ xanh được
điều trị bằng kháng thể IgY kháng trực khuẩn mủ xanh
Kết quả đánh giá tổn thương mô học các vết thương bỏng nhiễm TKMX sau đó được điều trị bằng thay băng đắp gạc tẩm chế phẩm IgY kháng
TKMX hoặc nước muối sinh lý trong 10 ngày được thể hiện trong Hình 3.18 (chi tiết được trình bày trong Phụ lục ảnh) và Bảng 3.4.
Bảng 3.4: Tổn thương mô học vết thương bỏng thực nghiệm gây nhiễm
trực khuẩn mủ xanh sau 10 ngày được điều trị
Số Thỏ Nhóm chứng (Đắp gạc tẩm NMSL) Nhóm nghiệm (Đắp gạc tẩm IgY kháng TKMX)
1 Hoại tử xâm nhiễm viêm có nơi là tổ chức mủ, nhiều bạch cầu trung tính.
Bề mặt vết thương phủ một lớp chất hoại tử, đáy vết thương là tổ chức hạt non, nhiều nguyên bào sợi và mạch máu tân sinh, kèm theo xâm nhiễm viêm bán cấp, có hình ảnh biểu mô hóa tại vùng dìa vết thương.
2 Ổ mủ trên bề mặt vết thương xâm nhiễm
Hình ảnh hoại tử thứ phát (không thấy biểu mô hóa)
3 Chân bì có nhiều ổ xuất huyết và xâm nhiễm cấp tính các mạch máu xung huyết
Hình ảnh hoại tử bề mặt vết thương hình thành tổ chức hạt ở đáy vết thương không thấy biểu mô hóa
4 Bề mặt vết thương bị hoại tử xâm nhiễm rải rác bạch cầu
Hình ảnh mô hạt xâm nhiễm mạn tính không thấy hoại tử
5 Bề mặt hoại tử nhiều bạch cầu trung tính hình thành mủ
Hình ảnh dưới biểu bì có nơi hoại tử đến chân bì không thấy
Một hạt chân bì viêm mạn tính 6 Xâm nhiễm mãn tính ở
chân bì nhiều bạch cầu trung tính
Hình ảnh viêm mạn, không thấy lớp mô hạt, hoại tử thấy lớp cơ
7 Xâm nhiễm ở chân bì nhiêu bạch cầu lympho và các ổ mủ
Xuất huyết hoại tử trong lớp cơ và thấy các tổ chức biểu mô bò vào lớp cơ
8 Xâm nhiễm hoại tử mủ Hình ảnh biểu mô ở màng vết thương …
Hình 3.18: Đặc điểm mô học vết thương bỏng thực nghiệm gây nhiễm trực
khuẩn mủ xanh sau 10 ngày được điều trị (10X).
Chú thích: Tẩm đắp nước muối sinh lý (A); Tẩm đắp chế phẩm IgY kháng
Nhận xét chung:
- Vết thương được điều trị bằng NMSL: Bề mặt vết thương bỏng phủ một lớp dầy chất hoại tử lẫn các tế bào mủ và tơ huyết lẫn bạch cầu trung tính, đại thực bào nền vết thương là tổ chức hạt non với một số mạch máu tân sinh, một số mạch máu lòng chứa cục nghẽn mạch, các nguyên bào sợi thưa thớt, dịch rỉ viêm nhiều đồng thời bị xâm nhiễm nhiều bạch cầu (hình ảnh này chứng tỏ vi khuẩn mủ xanh đã kích thích mạnh gây ra viêm mủ ở tại vết thương làm cản trở sự hình thành tổ chức hạt, hiện tượng biểu mô hóa ở mép vết thương chậm, đồng thời có hiện tượng hoại tử thứ phát sau bỏng).
- Vết thương được điều trị bằng IgY kháng TKMX: Bề mặt vết bỏng phủ một lớp mỏng chất hoại tử lẫn tơ huyết bạch cầu, dịch rỉ viêm ít, bạch cầu trung tính nhiều. Nền vết thương là tổ chức hạt non có nhiều mạch máu tân sinh nhiều nguyên bào sợi, biểu mô ở bờ vết thương tăng sản, biểu mô dày lên và bò vào vết thương, phủ lên bề mặt tổ chức hạt theo hướng từ ngoại vi vào trung tâm. Các tế bào biểu mô đã biệt hóa thành biểu mô gai, mô hạt còn thấy xâm nhiễm nhiều tế bào lympho, tương bào. (Hình ảnh cho thấy sự kích thích của TKMX yếu, chất hoại tử đã bị loại bỏ và đào thải một phần, có sự cản trở viêm mủ sự xâm nhiễm nhiều lympho, tương bào cho thấy đã có sự đáp ứng miễn dịch của cơ thể và kích thích sự hình thành tổ chức hạt và biểu mô hóa để sửa chữa vết thương).
CHƯƠNG 4 BÀN LUẬN
4.1. CHẾ TẠO GLOBULIN MIỄN DỊCH TỪ LÒNG ĐỎ TRỨNG GÀ KHÁNG TRỰC KHUẨN MỦ XANH
4.1.1. Về gây miễn dịch tạo kháng thể IgY đặc hiệu ở gà mái đẻ trứng
4.1.1.1 Lựa chọn loài gà và cách chăm sóc gà
Cho đến nay, chưa thấy nghiên cứu nào so sánh khả năng sinh kháng thể của các loài gà khác nhau với cùng một kháng nguyên trong cùng một điều kiện gây miễn dịch. Các nghiên cứu được triển khai thường sử dụng loài gà theo cách chọn loài thuận tiện, có sẵn tại địa phương nghiên cứu. Tuy nhiên, lựa chọn thời điểm gây miễn dịch và cách chăm sóc sao cho thời gian đẻ trứng hợp lý và trứng cho tỷ lệ lòng đỏ lớn là các khuyến cáo thường được đề cập [34], [89]. Trong nghiên cứu này, loài gà mái trắng giống Ai Cập chuyên đẻ trứng được Viện chăn nuôi Quốc gia nhập khẩu, nhân nuôi giống và phân phối tại nước ta được lựa chọn làm đối tượng nghiên cứu để gây miễn dịch tạo IgY đặc hiệu theo cách chọn đối tương nghiên cứu thuận tiện.
Một trong các lý do đưa ra trong việc lựa chọn loài gà thuận tiện là tính sinh miễn dịch của gà tương đối mạnh. Gà có khả năng sinh kháng thể chống lại các kháng nguyên có nguồn gốc từ vi sinh vật cũng như từ động vật có vú, thậm chí cả các phân tử nhỏ như các hapten. Do thời gian sinh kháng thể của gà nhanh, để tránh phải chờ đợi khi đã có kháng thể trong máu gà mà gà chưa đẻ trứng, thời điểm gây miễn dịch thường được lựa chọn với gà ở độ tuổi chuẩn bị hoặc bắt đầu đẻ trứng [89], [101]. Nghiên cứu này cũng lựa chọn và tiếp nhận gà ở độ tuổi chuẩn bị đẻ để rút ngắn thời gian nuôi và gây miễn dịch.
Thời gian trung bình từ khi bắt đầu đẻ trứng đến khi ngừng đẻ của một gà công nghiệp chuyên đẻ trứng thường kéo dài khoảng 12 - 18 tháng, để
bảo đảm sức khỏe của gà trong thời gian sinh kháng thể đặc hiệu, việc gây miễn dịch với các mầm bệnh thường gặp như các bệnh do virus ở gà thường được tiến hành trước khi gây miễn dịch chính thức để sản xuất kháng thể đặc hiệu [89], [101]. Đối tượng nghiên cứu của đề tài này cũng đã được Viện chăn nuôi Quốc gia gây miễn dịch với một số loài virus thường gây bệnh ở gà, trong đó có virus cúm gia cầm H5N1.
Nhờ cân nhắc các yếu tố giống, tuổi và dự phòng bệnh thường gặp ở gia cầm, kết quả cho thấy toàn bộ các gà nghiên cứu đều sống và đẻ trứng đều đặn cho đến hết thời gian thí nghiệm ở thời điểm 12 tháng kể từ khi gây miễn dịch lần đầu.
4.1.1.2. Lựa chọn và chế tạo kháng nguyên
Các nghiên cứu cho thấy, các kháng nguyên dùng để gây miễn dịch cho gà rất đa dạng. Nhìn chung các kháng nguyên dùng để gây miễn dịch cho gà đều được chế tạo theo nguyên tắc chung của các loại vắc-xin sử dụng cho người và động vật.
- Với các kháng nguyên là vi khuẩn, đã có nghiên cứu sử dụng vi khuẩn sống giảm độc lực, vi khuẩn bất hoạt bởi nhiệt hoặc hóa chất, kháng nguyên vi khuẩn siêu nghiền, độc tố của vi khuẩn và protein tái tổ hợp của vi khuẩn [12], [31], [45], [67], [71], [74], [78], [92].
- Với virus đã có kháng nguyên virus giảm độc lực, virus bất hoạt và kháng nguyên tái tổ hợp của virus [57], [61], [75], [88], [105].
- Nọc rắn độc [28], [33], [62].
- Protein có nguồn gốc từ người [111], [112].
Nghiên cứu này tiến hành với kháng nguyên là vi khuẩn được bất hoạt bằng phenol. Đây cũng là cách làm được các nghiên cứu trước đây trong và ngoài nước đã tiến hành với loại vắc-xin toàn tế bào: loại bỏ các thành phần kháng nguyên khác (kháng nguyên lông, kháng nguyên pili…) chỉ giữ lại kháng nguyên O.
4.1.1.3. Cách gây miễn dịch
Cách gây miễn dịch có ảnh hưởng quan trọng đến hiệu quả sinh kháng thể đặc hiệu. Nhìn chung, mỗi nghiên cứu đều tối ưu hóa qui trình gây miễn dịch cho phù hợp với loại kháng nguyên và cân nặng của gà cần gây miễn dịch
Bảng 4.1: Khuyến cáo cách gây miễn dịch
Yếu tố liên quan Khuyến cáo
Tá chất Tá chất Freund, Specol, Lipopeptide Liều kháng nguyên 10 ng – 1,0 mg (tốt nhất là 10 – 100 µg) Đường tiêm Trong cơ ngực (gà non, gà thả sân vườn)
Dưới da cổ (gà già) Thể tích tiêm < 1,0 Ml
Số lần tiêm 2 – 3 lần, sau đó tiêm nhắc lại trong thời gian thu hoạch trứng
Tần suất tiêm 3 – 8 tuần
Thời gian sử dụng gà Suốt thời gian đẻ trứng (khoảng 1 năm)
*Nguồn: Schade và CS, 2005 [89].
Bảng 4.1 liệt kê các khuyến cáo được nhóm chuyên gia của Trung tâm phê chuẩn phương pháp mới của Châu Âu (European Centre for the Validation of Alternative Methods: ECVAM) do Schade và cộng sự đề xuất [89].
Đa số các nghiên cứu sử dụng tá chất Freund hoàn chỉnh cho mũi tiêm đầu còn các mũi sau sử dụng tá chất Freund không hoàn chỉnh. Tuy nhiên, tùy theo đặc điểm của kháng nguyên, có nghiên cứu sử dụng tá chất Freund không hoàn chỉnh cho mũi đầu còn các mũi sau không dùng tá chất. Nghiên cứu này lựa chọn sử dụng tá chất Freund hoàn chỉnh cho mũi tiêm đầu còn các mũi sau sử dụng tá chất Freund không hoàn chỉnh cũng là cách làm phổ
biến cho hiệu quả kích thích miễn dịch sinh kháng thể mạnh ở gà mái. Kết quả này cũng phù hợp với các nghiên cứu trước của các nhóm nghiên cứu ở Học viện Quân y [9], [12].
Do kích thước cơ thể của gà không lớn, thể tích kháng nguyên trong mỗi lần tiêm đều khống chế dưới 1,0mL, trong đó nồng độ kháng nguyên rất giao động tùy vào bản chất của khác nguyên. Nghiên cứu này sử dụng thể tích tiêm 0,5mL cho một lần tiêm là thể tích trung bình được khuyến cáo cũng như nhiều nhóm nghiên cứu đã áp dụng.
Do sản phẩm cần thu thập là kháng thể IgY đặc hiệu trong trứng gà, ngoài yếu tố hiệu giá kháng thể cao trong máu gà, các nghiên cứu đều quan tâm đến số lượng trứng do gà gây miễn dịch đẻ ra. Nếu hiệu giá kháng thể trong máu cao nhưng gà bị ức chế không đẻ trứng sẽ không được coi là qui trình tối ưu. Điều này cũng đã được Hoàng Trung Kiên và CS (2010) [12], Trương Quý Kiên và CS (2010) [13] ghi nhận. Dựa trên kết quả nghiên cứu của các tác giả này, đề tài tiến hành khảo sát khư trú xung quanh các nồng độ vi khuẩn từ 106 đến 108
vi khuẩn/lần tiêm. Kết quả cho thấy lô gà tiêm với liều 108
vi khuẩn/lần tiêm cho hiệu giá kháng thể đặc hiệu tăng ngay sau mũi tiêm thứ 2 và duy trì liên tục ở mức cao trong suốt quá trình gây miễn dịch (Hình 3.1). Mặc dù liều 108
vi khuẩn/lần tiêm sớm cho hiệu giá kháng thể cao