khuẩn mủ xanh sau 10 ngày được điều trị (10X).
Chú thích: Tẩm đắp nước muối sinh lý (A); Tẩm đắp chế phẩm IgY kháng
Nhận xét chung:
- Vết thương được điều trị bằng NMSL: Bề mặt vết thương bỏng phủ một lớp dầy chất hoại tử lẫn các tế bào mủ và tơ huyết lẫn bạch cầu trung tính, đại thực bào nền vết thương là tổ chức hạt non với một số mạch máu tân sinh, một số mạch máu lòng chứa cục nghẽn mạch, các nguyên bào sợi thưa thớt, dịch rỉ viêm nhiều đồng thời bị xâm nhiễm nhiều bạch cầu (hình ảnh này chứng tỏ vi khuẩn mủ xanh đã kích thích mạnh gây ra viêm mủ ở tại vết thương làm cản trở sự hình thành tổ chức hạt, hiện tượng biểu mô hóa ở mép vết thương chậm, đồng thời có hiện tượng hoại tử thứ phát sau bỏng).
- Vết thương được điều trị bằng IgY kháng TKMX: Bề mặt vết bỏng phủ một lớp mỏng chất hoại tử lẫn tơ huyết bạch cầu, dịch rỉ viêm ít, bạch cầu trung tính nhiều. Nền vết thương là tổ chức hạt non có nhiều mạch máu tân sinh nhiều nguyên bào sợi, biểu mô ở bờ vết thương tăng sản, biểu mô dày lên và bò vào vết thương, phủ lên bề mặt tổ chức hạt theo hướng từ ngoại vi vào trung tâm. Các tế bào biểu mô đã biệt hóa thành biểu mô gai, mô hạt còn thấy xâm nhiễm nhiều tế bào lympho, tương bào. (Hình ảnh cho thấy sự kích thích của TKMX yếu, chất hoại tử đã bị loại bỏ và đào thải một phần, có sự cản trở viêm mủ sự xâm nhiễm nhiều lympho, tương bào cho thấy đã có sự đáp ứng miễn dịch của cơ thể và kích thích sự hình thành tổ chức hạt và biểu mô hóa để sửa chữa vết thương).
CHƯƠNG 4 BÀN LUẬN
4.1. CHẾ TẠO GLOBULIN MIỄN DỊCH TỪ LÒNG ĐỎ TRỨNG GÀ KHÁNG TRỰC KHUẨN MỦ XANH
4.1.1. Về gây miễn dịch tạo kháng thể IgY đặc hiệu ở gà mái đẻ trứng
4.1.1.1 Lựa chọn loài gà và cách chăm sóc gà
Cho đến nay, chưa thấy nghiên cứu nào so sánh khả năng sinh kháng thể của các loài gà khác nhau với cùng một kháng nguyên trong cùng một điều kiện gây miễn dịch. Các nghiên cứu được triển khai thường sử dụng loài gà theo cách chọn loài thuận tiện, có sẵn tại địa phương nghiên cứu. Tuy nhiên, lựa chọn thời điểm gây miễn dịch và cách chăm sóc sao cho thời gian đẻ trứng hợp lý và trứng cho tỷ lệ lòng đỏ lớn là các khuyến cáo thường được đề cập [34], [89]. Trong nghiên cứu này, loài gà mái trắng giống Ai Cập chuyên đẻ trứng được Viện chăn nuôi Quốc gia nhập khẩu, nhân nuôi giống và phân phối tại nước ta được lựa chọn làm đối tượng nghiên cứu để gây miễn dịch tạo IgY đặc hiệu theo cách chọn đối tương nghiên cứu thuận tiện.
Một trong các lý do đưa ra trong việc lựa chọn loài gà thuận tiện là tính sinh miễn dịch của gà tương đối mạnh. Gà có khả năng sinh kháng thể chống lại các kháng nguyên có nguồn gốc từ vi sinh vật cũng như từ động vật có vú, thậm chí cả các phân tử nhỏ như các hapten. Do thời gian sinh kháng thể của gà nhanh, để tránh phải chờ đợi khi đã có kháng thể trong máu gà mà gà chưa đẻ trứng, thời điểm gây miễn dịch thường được lựa chọn với gà ở độ tuổi chuẩn bị hoặc bắt đầu đẻ trứng [89], [101]. Nghiên cứu này cũng lựa chọn và tiếp nhận gà ở độ tuổi chuẩn bị đẻ để rút ngắn thời gian nuôi và gây miễn dịch.
Thời gian trung bình từ khi bắt đầu đẻ trứng đến khi ngừng đẻ của một gà công nghiệp chuyên đẻ trứng thường kéo dài khoảng 12 - 18 tháng, để
bảo đảm sức khỏe của gà trong thời gian sinh kháng thể đặc hiệu, việc gây miễn dịch với các mầm bệnh thường gặp như các bệnh do virus ở gà thường được tiến hành trước khi gây miễn dịch chính thức để sản xuất kháng thể đặc hiệu [89], [101]. Đối tượng nghiên cứu của đề tài này cũng đã được Viện chăn nuôi Quốc gia gây miễn dịch với một số loài virus thường gây bệnh ở gà, trong đó có virus cúm gia cầm H5N1.
Nhờ cân nhắc các yếu tố giống, tuổi và dự phòng bệnh thường gặp ở gia cầm, kết quả cho thấy toàn bộ các gà nghiên cứu đều sống và đẻ trứng đều đặn cho đến hết thời gian thí nghiệm ở thời điểm 12 tháng kể từ khi gây miễn dịch lần đầu.
4.1.1.2. Lựa chọn và chế tạo kháng nguyên
Các nghiên cứu cho thấy, các kháng nguyên dùng để gây miễn dịch cho gà rất đa dạng. Nhìn chung các kháng nguyên dùng để gây miễn dịch cho gà đều được chế tạo theo nguyên tắc chung của các loại vắc-xin sử dụng cho người và động vật.
- Với các kháng nguyên là vi khuẩn, đã có nghiên cứu sử dụng vi khuẩn sống giảm độc lực, vi khuẩn bất hoạt bởi nhiệt hoặc hóa chất, kháng nguyên vi khuẩn siêu nghiền, độc tố của vi khuẩn và protein tái tổ hợp của vi khuẩn [12], [31], [45], [67], [71], [74], [78], [92].
- Với virus đã có kháng nguyên virus giảm độc lực, virus bất hoạt và kháng nguyên tái tổ hợp của virus [57], [61], [75], [88], [105].
- Nọc rắn độc [28], [33], [62].
- Protein có nguồn gốc từ người [111], [112].
Nghiên cứu này tiến hành với kháng nguyên là vi khuẩn được bất hoạt bằng phenol. Đây cũng là cách làm được các nghiên cứu trước đây trong và ngoài nước đã tiến hành với loại vắc-xin toàn tế bào: loại bỏ các thành phần kháng nguyên khác (kháng nguyên lông, kháng nguyên pili…) chỉ giữ lại kháng nguyên O.
4.1.1.3. Cách gây miễn dịch
Cách gây miễn dịch có ảnh hưởng quan trọng đến hiệu quả sinh kháng thể đặc hiệu. Nhìn chung, mỗi nghiên cứu đều tối ưu hóa qui trình gây miễn dịch cho phù hợp với loại kháng nguyên và cân nặng của gà cần gây miễn dịch
Bảng 4.1: Khuyến cáo cách gây miễn dịch
Yếu tố liên quan Khuyến cáo
Tá chất Tá chất Freund, Specol, Lipopeptide Liều kháng nguyên 10 ng – 1,0 mg (tốt nhất là 10 – 100 µg) Đường tiêm Trong cơ ngực (gà non, gà thả sân vườn)
Dưới da cổ (gà già) Thể tích tiêm < 1,0 Ml
Số lần tiêm 2 – 3 lần, sau đó tiêm nhắc lại trong thời gian thu hoạch trứng
Tần suất tiêm 3 – 8 tuần
Thời gian sử dụng gà Suốt thời gian đẻ trứng (khoảng 1 năm)
*Nguồn: Schade và CS, 2005 [89].
Bảng 4.1 liệt kê các khuyến cáo được nhóm chuyên gia của Trung tâm phê chuẩn phương pháp mới của Châu Âu (European Centre for the Validation of Alternative Methods: ECVAM) do Schade và cộng sự đề xuất [89].
Đa số các nghiên cứu sử dụng tá chất Freund hoàn chỉnh cho mũi tiêm đầu còn các mũi sau sử dụng tá chất Freund không hoàn chỉnh. Tuy nhiên, tùy theo đặc điểm của kháng nguyên, có nghiên cứu sử dụng tá chất Freund không hoàn chỉnh cho mũi đầu còn các mũi sau không dùng tá chất. Nghiên cứu này lựa chọn sử dụng tá chất Freund hoàn chỉnh cho mũi tiêm đầu còn các mũi sau sử dụng tá chất Freund không hoàn chỉnh cũng là cách làm phổ
biến cho hiệu quả kích thích miễn dịch sinh kháng thể mạnh ở gà mái. Kết quả này cũng phù hợp với các nghiên cứu trước của các nhóm nghiên cứu ở Học viện Quân y [9], [12].
Do kích thước cơ thể của gà không lớn, thể tích kháng nguyên trong mỗi lần tiêm đều khống chế dưới 1,0mL, trong đó nồng độ kháng nguyên rất giao động tùy vào bản chất của khác nguyên. Nghiên cứu này sử dụng thể tích tiêm 0,5mL cho một lần tiêm là thể tích trung bình được khuyến cáo cũng như nhiều nhóm nghiên cứu đã áp dụng.
Do sản phẩm cần thu thập là kháng thể IgY đặc hiệu trong trứng gà, ngoài yếu tố hiệu giá kháng thể cao trong máu gà, các nghiên cứu đều quan tâm đến số lượng trứng do gà gây miễn dịch đẻ ra. Nếu hiệu giá kháng thể trong máu cao nhưng gà bị ức chế không đẻ trứng sẽ không được coi là qui trình tối ưu. Điều này cũng đã được Hoàng Trung Kiên và CS (2010) [12], Trương Quý Kiên và CS (2010) [13] ghi nhận. Dựa trên kết quả nghiên cứu của các tác giả này, đề tài tiến hành khảo sát khư trú xung quanh các nồng độ vi khuẩn từ 106 đến 108
vi khuẩn/lần tiêm. Kết quả cho thấy lô gà tiêm với liều 108
vi khuẩn/lần tiêm cho hiệu giá kháng thể đặc hiệu tăng ngay sau mũi tiêm thứ 2 và duy trì liên tục ở mức cao trong suốt quá trình gây miễn dịch (Hình 3.1). Mặc dù liều 108
vi khuẩn/lần tiêm sớm cho hiệu giá kháng thể cao nhưng ở liều tiêm này không ghi nhận thấy hiện tượng ức chế đẻ trứng của gà. Có lẽ ngoài yếu tố liêu lượng vi khuẩn, yếu tố cơ địa của gà mái và cách xử lý kháng nguyên cũng có ảnh hưởng đến việc ức chế gà đẻ trứng. Điều này cần có các nghiên cứu tiếp theo so sánh cách bất hoạt vi khuẩn, và tiêm với những liều cao hơn mới cho câu trả lời thỏa đáng. Trong khuôn khổ đề tài nghiên cứu này, chúng tôi tạm ghi nhận liều 108
vi khuẩn/lần tiêm là liều tối ưu trong số 3 liều tiêm được khảo sát.
4.1.1.4. Phát hiện kháng thể IgY đặc hiệu
Kháng thể IgY đặc hiệu kháng nguyên xuất hiện trong máu và trong trứng gà thường được phát hiện bằng các kỹ thuật miễn dịch cơ bản như ELISA và Western blot.
Trong kỹ thuật ELISA, kháng nguyên gây miễn dịch thường được gắn lên các phiến xét nghiệm ELISA 96 giếng đáy phẳng. Huyết thanh gà trước và sau khi gây miễn dịch hoặc chế phẩm kháng thể sau tinh chế từ trứng gà được pha loãng thành nhiều nồng độ giảm dần rồi cho vào các giếng ELISA để cho phản ứng với kháng nguyên đã gắn ở các giếng. Rửa loại bỏ các thành phần không gắn vào giếng rồi cho cộng hợp kháng thể kháng IgY gắn enzym (thường dùng horseradish peroxidase: HRP) để phát hiện sự có mặt của IgY đặc hiệu đã gắn vào kháng nguyên. Sau khi rửa loại bỏ các kháng thể không gắn vào giếng, hoạt tính của enzym trong mỗi giếng tương ứng với sự có mặt nhiều hay ít của kháng thể đặc hiệu trong giếng được phát hiện bằng cơ chất đặc hiệu của enzym [4].
Trong kỹ thuật Western blot, để biết IgY từ gà sau khi gây miễn dịch phản ứng với các thành phần nào của kháng nguyên, kháng nguyên đã dùng gây miễn dịch được tách bằng phương pháp điện di SDS-PAGE sau đó được chuyển lên màng nitrocellulose. Huyết thanh gà sau khi gây miễn dịch hoặc chế phẩm kháng thể sau tinh chế từ trứng gà được pha loãng với nồng độ thích hợp rồi cho phản ứng với kháng nguyên đã được chuyển lên màng. Sự có mặt của IgY đặc hiệu đã gắn vào các kháng nguyên sau khi đã tách bằng SDS-PAGE được phát hiện bằng cộng hợp kháng thể kháng IgY gắn enzym và cơ chất hiện mầu đặc hiệu của enzym gắn vào kháng thể kháng IgY [4].
Trong nghiên cứu này, hoạt tính IgY đặc hiệu TKMX được khảo sát bằng cả hai phương pháp ELISA và Western blot. Kết quả nghiên cứu ở các Hình 3.3 và Hình 3.4 bổ xung cho nhau đã cho thấy mặc dù kháng nguyên được dùng để gây miễn dịch là kháng nguyên đa giá gồm hỗn hợp với số
lượng tương đương nhau của 7 chủng vi khuẩn bất hoạt. Tuy nhiên, khi thử với các kháng nguyên siêu nghiền chứa cả các thành phần kháng nguyên protein của vỏ cũng như kháng nguyên nội bào đã cho thấy kháng thể IgY phản ứng với hầu hết các thành phần kháng nguyên của TKMX, dao động từ các kháng nguyên có kích thước lớn > 100 KDa đến kháng nguyên có kích thước bé < 20 KDa. Điều này cho thấy, mặc dù là vi khuẩn bất hoạt nhưng hệ thống miễn dịch của gà đã xử lý các vi khuẩn, làm bộc lộ các thành phần kháng nguyên khác nhau cho hệ thống miễn dịch của gà nhận diện để sinh ra các kháng thể đặc hiệu chống lại nhiều kháng nguyên khác nhau của vi khuẩn. Rất có thể trong số các thành phần này có cả các nội độc tố của vi khuẩn và các thành phần gây bệnh khác liên quan đến các biểu hiện nhiễm độc trong nhiễm TKMX. Điều này cũng cần có thêm các nghiên cứu khác để làm sáng tỏ hơn giả thuyết này.
4.1.2. Về tách chiết, tinh sạch kháng thể IgY từ lòng đỏ trứng gà
Cho đến nay đã có một số phương pháp tách chiết IgY từ lòng đỏ trứng gà được mô tả [52]. Tuy nhiên việc lựa chọn phương pháp nào là phù hợp nhất có liên quan đến nhiều yếu tố như: sản lượng và độ tinh sạch kháng thể, mục đích sản xuất IgY, hóa chất sử dụng, điều kiện phòng thí nghiệm và quan trọng hơn cả là tính kinh tế của sản phẩm tạo ra. Trong nghiên cứu này lựa chọn phương pháp tách phân đoạn bằng nước và muối sulphat amoni vì những lý do sau: Quy trình đơn giản, nhanh, dễ thực hiện, không đòi hỏi trang thiết bị quá hiện đại. Hiệu suất tách chiết và độ tinh sạch cao; Có thể ứng dụng sản xuất với quy mô lớn, giá rẻ và đặc biệt là có thể sử dụng như là nguồn thực phẩm không độc hại do không sử dụng các dung môi hữu cơ.
Kết quả ở Bảng 3.1 cho thấy hiệu suất thu hồi protein tổng số trong đó có chứa IgY qua các bước có sự khác biệt lớn. Sau bước loại lipid bằng tủa với nước cất lạnh, mặc dù thu được protein tổng số lớn nhưng kháng thể thu được có hoạt tính thấp do chứa nhiều protein tạp khác. Sản phẩm thu được
sau tủa với muối sulphat amoni và sắc ký trao đổi ion với số lượng kháng thể thấp nhưng hoạt tính của kháng thể mạnh, độ tinh sạch cao hơn. Như vậy với qui trình được xây dựng trong nghiên cứu này cho phép tùy theo mục đích và yêu cầu chất lượng của kháng thể cần sử dụng có thể lựa chọn áp dụng đến bước nào trong cả quá trình.
Đánh giá chung qui trình tách chiết, tinh sạch kháng thể IgY kháng TKMX từ lòng đỏ trứng gà được thể hiện qua Bảng 3.1. Từ một quả trứng với trung bình 20 mL lòng đỏ, sau bước sắc ký ái lực thu nhận được gần 140mg chế phẩm chứa IgY tương đối tinh khiết. Hàm lượng IgY nhận được trong nghiên cứu này cao hơn so với một số tác giả khác đã báo cáo sản lượng IgY thu được trung bình từ 14,5-72 mg/1 lòng đỏ trứng [89]. Tuy nhiên khi xem xét kỹ kết quả điện di SDS-PAGE cho thấy mặc dù điện di trong điều kiện biến tính nhưng băng tương ứng với phân tử IgY nguyên vẹn không biến mất hoàn toàn. Theo Lê Văn Đông và Dương Hương Giang (2011) [9], sản phẩm protein của trứng gà sau một lần sắc ký ái lực vẫn còn tạp lẫn các protein khác có cùng kích thước và đặc tính mang điện tương tự như IgY. Điều này có thể là nguyên nhân khiến cho sản lượng protein chứa IgY thu được trong nghiên cứu này cao hơn so với ghi nhận của các tác giả khác đã công bố.
4.1.3. Về độ ổn định của chế phẩm kháng thể IgY
Tính ổn định của IgY phụ thuộc vào các yếu tố như nhiệt độ, pH và tác động của các enzym thủy phân protein [34], [89].
-pH: Ở môi trường pH acid hoạt tính của IgY bị giảm một phần khi pH = 3,5 hoặc thấp hơn và bị thay đổi hoàn toàn ở pH = 3,0; Trong môi trường pH kiềm, hoạt tính của IgY gần như không thay đổi cho tới pH = 11.
-Nhiệt độ: IgY không bị mất hoạt tính trong quá trình tiệt trùng bằng phương pháp Pasteur ở 60ºC. IgY bền vững trong điều kiện xử lý nhiệt từ 60 - 65ºC trong 30 phút. Hoạt tính của IgY sẽ giảm khi tăng nhiệt độ lên tới 75ºC. IgY mất hoàn toàn hoạt tính ở 80 ºC trong 20 phút. Tuy nhiên, lạnh và khô
không làm ảnh hưởng đến hoạt tính của IgY, trừ khi quá trình đông lạnh được lặp đi lặp lại nhiều lần, làm thay đổi cấu trúc cũng như khả năng bám dính của protein.
-Các enzym thủy phân protein: IgY có khả năng chịu đựng rất cao với