2.2.1. Trực khuẩn mủ xanh
Các chủng TKMX được sử dụng để chế tạo kháng nguyên gây miễn dịch là sản phẩm của các công trình nghiên cứu trước đây do Bộ môn Khoa Vi sinh y học, Học viện Quân y cung cấp, bao gồm 07 chủng có ký hiệu:
- TKMX: M 27P11; - TKMX: 6P11; - TKMX 7P8; - TKMX 36P8; - TKMX: 79 P16; - TKMX: 9HP13; - TKMX: 1100P2
Đây là các chủng TKMX thuộc 5 type huyết thanh gây bệnh chủ yếu ở các bệnh viện thuộc 3 miền Bắc – Trung – Nam, Việt Nam. Các chủng được bảo quản đông lạnh trong ngân hàng chủng được hoạt hóa, kiểm tra đặc điểm sinh vật học và huyết thanh học trước khi được nuôi cấy tăng sinh sử dụng làm kháng nguyên để chế tạo huyết thanh kháng TKMX bằng phương pháp gây miễn dịch cho gà.
2.2.2. Hoá chất sinh phẩm
- Các môi trường, sinh phẩm: Môi trường nuôi cấy tăng sinh TKMX: BHI broth, Nutrient agar (Biorad).
- Các hóa chất, dung môi: Tá chất Freund hoàn chỉnh và Freund không hoàn chỉnh, cộng hợp kháng thể gắn enzym peoxidase (anti chicken IgY), cơ
chất OPD (Sigma), Protein chuẩn, Acrylamide, APS, TEMED, (NH4)2SO4, Phenol, PBS, BSA (Merck), Kit Bradford (Biorad), ... và các hóa chất dung môi khác đều đạt tiêu chuẩn thí nghiệm.
- Các dụng cụ vật tư tiêu hao để tách chiết kháng thể IgY từ trứng gà: Cột Sắc ký trao đổi Ion (BioRad), màng thẩm tích, màng lọc Whatman No1, Plate ELISA 96 giếng.
2.2.3. Thiết bị máy móc
- Cân điện tử, máy khuấy từ, máy đo pH, pipetman các loại.
- Máy ly tâm lạnh (Hiteach, Đức).
- Máy đo độ đục chuẩn Mc-Farland của hãng BioMerieux (Pháp).
- Máy lắc Vortex của hãng Satorius (Đức).
- Máy sắc ký trao đổi ion áp suất thấp Biologic-LP (Bio-Rad, Mỹ).
- Máy đo quang phổ DTX 880 (Beckman Coulter, Mỹ).
- Máy điện di SDS-PAGE và chuyển màng (Bio-Rad, Mỹ)
- Tủ nuôi cấy vi sinh ( Trung quốc).
- Kính hiển vi quang học (Carl Zeiss, Đức).
- Tủ Lạnh -20o
C (Sanyo, Nhật).
- Bộ dụng cụ chuyên dụng để gây bỏng cho thỏ
2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.1. Chế tạo kháng nguyên tế bào trực khuẩn mủ xanh từ các chủng dự tuyển
Kháng nguyên tế bào TKMX được chế tạo theo phương pháp dùng phenol của Sonnenwirth (1970) [theo 11]. Mục đích của phương pháp này là bất hoạt vi khuẩn với các bước tiến hành gồm:
- Tạo sinh khối các chủng TKMX, thu hoạch sinh khối.
- Xử lý bất hoạt TKMX với dung dịch phenol 0,5% trong nước muối sinh lý ở 37 °C trong 24 giờ và điều chỉnh về nồng độ 109
- Kiểm tra tiêu chuẩn của kháng nguyên tế bào TKMX về độ vô trùng, an toàn, độc tính, tính sinh miễn dịch, khả năng gây sốt.
- Trộn đều các chủng vi khuẩn theo tỷ lệ tương đương về thể tích và số lượng vi khuẩn. Hỗn hợp vi khuẩn bất hoạt được trộn với tá chất Freund theo tỷ lệ 1:1 về thể tích để tạo thành huyền dịch kháng nguyên để gây miễn dịch.
2.3.2. Gây miễn dịch
Sau khi nuôi cho gà thích nghi với điều kiện chuồng nuôi mới trong 2 tuần, tiến hành gây miễn dịch theo qui trình gây miễn dịch đã được các tác giả ở Bộ môn Miễn dịch, Học viện Quân y thử nghiệm: tiêm 0,5 mL kháng nguyên/gà dưới da ngực chia làm nhiều mũi và tiêm nhắc lại 5 lần. Khoảng cách giữa các lần tiêm là 3 tuần với nồng độ kháng nguyên gây miễn dịch là:
- Lô 1 (03 gà): 106 vi khuẩn/ gà/ lần tiêm.
- Lô 2 (03 gà): 107 vi khuẩn/ gà/ lần tiêm.
- Lô 3 (03 gà): 108 vi khuẩn/ gà/ lần tiêm.
- Lô chứng âm (03 gà): không gây miễn dịch.
Mũi gây miễn dịch lần đầu tiên sử dụng tá chất Freund hoàn chỉnh, các mũi tiêm sau sử dụng tá chất Freund không hoàn chỉnh theo qui trình đã được Bộ môn Miễn dịch, Học viện Quân y đã khảo sát ứng dụng và tối ưu hóa [12].
Hình 2.2: Gây miễn dịch cho gà mái với kháng nguyên trực khuẩn mủ xanh
Ngay trước khi gây miễn dịch mũi 1, lấy máu tĩnh mạch cánh gà tách huyết thanh để làm mẫu chứng trước khi gây miễn dịch. Sau mỗi lần gây miễn dịch 7 ngày, lấy máu tĩnh mạch cánh gà, tách huyết thanh để làm xét nghiệm ELISA phát hiện kháng thể đặc hiệu với TKMX trong máu gà.
Song song với thu thập máu gà, toàn bộ các trứng do gà đẻ ra trong suốt quá trình làm thí nghiệm đều được thu thập, đánh giá ghi nhận số lượng trứng do mỗi lô gà đẻ ra và mối tương quan giữa số lượng trứng với qui trình gây miễn dịch cũng như xét nghiệm ELISA tìm kháng thể đặc hiệu TKMX trong lòng đỏ trứng.
2.3.3. Tách chiết, tinh sạch IgY từ trứng gà
Bước 1: Loại lipid bằng phương pháp gây kết tủa lạnh lòng đỏ trứng gà với nước cất.
-Pha loãng lòng đỏ trứng với nước cất theo tỷ lệ khác nhau về thể tích từ 1:5 đến 1:11
-Đánh tan huyền dịch (dùng máy khuấy từ, ở 4O
C )
-Để lắng qua đêm ở 4o
C
- Thu phần dịch nổi bằng ly tâm loại bỏ cặn lắng
Bước 2: Tủa phân đoạn IgY bằng (NH4)2SO4
- (NH4)2SO4 sẽ tủa các protein khác nhau ở các nồng độ khác nhau.
- Dịch nổi thu được ở bước 1 được tủa bằng (NH4)2SO4 nồng độ từ 20% đến 60% độ bão hòa ở 4o
C trong 2 giờ.
- Ly tâm bỏ dịch nổi, thu cặn chứa IgY.
- Hòa tan cặn trong dung dịch đệm phosphat (PBS).
- Thẩm tích loại nước trong 48 giờ với dung dịch PBS. Bước 3: Tinh sạch IgY bằng sắc ký trao đổi ion
- Sử dụng cột anion thu các phân đoạn bám cột và có hoạt tính kháng TKMX.
- Sử dụng cột anion trên hệ thống sắc ký áp suất thấp Biologic-LP do hãng BioRad cung cấp với hệ đệm gồm:
o Dung dịch đệm A: dung dịch Tris-HCl pH 7,94
o Dung dịch đệm B: đệm A + 0,5M NaCl
• IgY thu được sau thẩm tích ở bước 2 được pha trong 2mL dịch đệm A, sau đó cho vào hệ thống cột. Protein bám vào cột được tách bằng cách tăng dần đều nồng độ của dịch đệm B, tốc độ dòng 1mL/ph. Toàn bộ các phân đoạn sắc ký được thu hồi bằng hệ thống thu mẫu tự động, thể tích mỗi phân đoạn là 1mL.
• Sản phẩm protein thu được ở mỗi bước đều được phân tích nồng độ bằng phương pháp Bradford; điện di SDS-PAGE; xét nghiệm ELISA tìm sự có mặt của kháng thể IgY đặc hiệu với kháng nguyên đã dùng để gây miễn dịch.
Hình 2.3: Hệ thống sắc ký trao đổi ion (BioRad, Mỹ).
2.3.4. Điện di SDS-PAGE phân tích thành phần protein kháng nguyên của trực khuẩn mủ xanh và độ tinh sạch của chế phẩm IgY của trực khuẩn mủ xanh và độ tinh sạch của chế phẩm IgY
Kỹ thuật điện di SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis) được thực hiện theo phương pháp của Laemmli trên hệ thống Mini-PROTEIN II Cell (BioRad).
- Bước 1: pha gel tách rồi nhỏ vào khoảng giữa 2 phiến kính sao cho cách mép trên của phiến kính khoảng 1cm. Sau đó cho thêm chút nước cất (tạo mặt phẳng cho gel tách). Sau 15-30 phút gel tách sẽ cô lại.
- Bước 2: pha gel cô. Đổ bỏ phần nước cất đã cho thêm trên bề mặt gel tách rồi nhỏ gel cô vừa pha lên trên phần gel tách đã cô. Cài lược chia các giếng lên trên (chú ý khi gel cô lại, nhắc lược lên đều tay tránh làm vỡ giếng).
- Bước 3: Pha mẫu với SDS sample buffer 2X theo tỉ lệ 1:1, mỗi mẫu chứa khoảng 30 mg protein rồi cho lần lượt vào các giếng.
- Bước 5: Nhuộm gel bằng dung dịch staining. Sau đó tẩy gel bằng destaining. Độ tinh sạch của kháng thể được xác định bằng phương pháp điện di biến tính SDS – PAGE với nồng độ12% running gel và 4% stacking gel, Gel được nhuộm bằng Coomassie blue R-250 (Sigma-Aldrich) hòa trong 10% acetic acid và 30% methanol.
2.3.5. Xét nghiệm ELISA phát hiện kháng thể IgY đặc hiệu với trực khuẩn mủ xanh trong máu gà và sản phẩm tách chiết từ trứng gà khuẩn mủ xanh trong máu gà và sản phẩm tách chiết từ trứng gà
2.3.5.1. Chuẩn bị phiến nhựa làm phản ứng ELISA
Kháng nguyên TKMX được xử lý bằng phương pháp siêu nghiền với máy siêu âm sau đó ly tâm với tốc độ 14.000 vòng/phút trong 30 phút ở 4ºC, thu hoạch dịch nổi chứa protein siêu nghiền. Định lượng protein bằng phương pháp nhuộm mầu của Bradford với kít định lượng protein của hãng Bio-Rad cung cấp.
Kháng nguyên siêu nghiền được gắn vào giếng ELISA ở nồng độ 5μg/mL trong dung dịch NaHCO3 nồng độ 0,1M, pH 9,6 và ủ qua đêm ở 4ºC. Rửa plate 5 lần bằng PBS-T (0,15M NaCl; 0,02M NaH2PO4; 0,01%Tween 20, pH 7,4), sau đó che phủ các vị trí không gắn kháng nguyên bằng 150μl /giếng dung dịch albumin huyết thanh bò ( BSA) 1% ở 370
C trong 2 giờ. Rửa plate 5 lần với PBS-T sau đó bảo quản trong túi plastic gắn kín ở -20ºC cho đến khi sử dụng.
2.3.5.2. Tiến hành phản ứng ELISA
Bước 1: Chuẩn bị mẫu thử: Chế phẩm chứa IgY (huyết thanh gà hoặc sản phẩm tách chiết từ lòng đỏ trứng gà) được pha loãng với các nồng độ khác nhau trong dung dịch PBS theo phương thức pha loãng bậc 2.
Bước 2: Tiến hành phản ứng.
- Cho vào các giếng với cùng thể tích 100μl /giếng.
- Ủ ở 37ºC trong 30 phút.
- Thêm vào mỗi giếng 100μl dung dịch cộng hợp kháng thể cừu kháng IgY gà gắn enzym peroxidase.
- Ủ ở 370
C trong 30 phút.
- Rửa bỏ kháng thể không gắn vào giếng.
- Cho vào mỗi giếng 100μl dung dịch cơ chất OPD nồng độ 0,5 mg/mL pha trong dung dịch cơ chất.
Bước 3: Đọc kết quả. Mật độ quang học của các giếng được đo bằng máy đọc DTX 880 (Beckman Coulter, Mỹ) ở bước sóng 450nm. Giá trị OD của các giếng ELISA tỷ lệ thuận với lượng kháng thể đặc hiệu phản ứng với kháng nguyên vi khuẩn đã được gắn vào giếng ELISA.
2.3.6. Phân tích kháng thể IgY đặc hiệu với trực khuẩn mủ xanh bằng kỹ thuật Western blot thuật Western blot
Protein kháng nguyên siêu nghiền của từng chủng vi khuẩn được phân tách bằng điện di SDS-PAGE 12% trong điều kiện biến tính theo phương pháp của Laemmli. Protein đã phân tách trong gel SDS-PAGE sau đó được chuyển qua màng nitrocellulose bằng điện di. Các vị trí không chứa kháng nguyên trên màng được che phủ bằng dung dịch BSA 1% ủ ở 4°C qua đêm. Rửa màng với dung dịch PBS-T rồi ủ với chế phẩm chứa IgY tách chiết từ lòng đỏ trứng gà pha trong dung dịch BSA 1% ở 37°C trong 2 giờ. Rửa bỏ các thành phần không bám vào màng rồi phát hiện sự có mặt của kháng thể IgY đặc hiệu gắn vào các vạch kháng nguyên bằng cách ủ với dung dịch cộng hợp kháng thể cừu kháng IgY gà gắn enzym peroxidase. Hoạt tính peroxidase được phát hiện bằng cơ chất mầu DAB nồng độ 0,5 mg/mL trong dung dịch TBS pH 7,4. Phản ứng hiện mầu cơ chất được ngừng bằng cách rửa màng với nước cất. Sản phẩm màng sau khi kết thúc phản ứng được làm khô và chụp ảnh.
2.3.7. Thử nghiệm ngưng kết vi khuẩn
Nghiền tan một khuẩn lạc TKMX trong 50 µL nước muối sinh lý vô trùng rồi trộn đều với 50 µL dung dịch kháng thể ở các nồng độ khác nhau
trên lam kính. Quan sát hiện tượng ngưng kết bằng mắt thường hoặc bằng kính hiển vi sau 3 đến 5 phút ủ ở nhiệt độ phòng. Mức độ dương tính được lượng giá thành mức độ +, ++, +++, ++++ theo qui ước thường qui chuẩn tại Bộ môn khoa Vi sinh y học, Bệnh viện 103.
2.3.8. Thử nghiệm tạo vòng kháng khuẩn in vitro trên môi trường đặc
Kỹ thuật khuếch tán trên thạch: thực hiện theo qui định của Dược điển Việt Nam III [3].
Các bước kỹ thuật:
-Đĩa thạch Muller-Hinton đổ dày 7mm được đục lỗ tạo giếng tròn đường kính 9mm, với số lượng 01 giếng/đĩa thạch, sau đó ria cấy lên trên bề mặt thạch chủng TKMX cần thử có nồng độ 108
/mL (mỗi chủng ria cấy lên một đĩa thạch). Để 15 phút cho se mặt thạch, sau đó nhỏ đầy kháng thể vào các giếng (thể tích cho vào các giếng là như nhau, nồng độ kháng thể IgY: 1,5 mg/mL là nồng độ có hoạt tính ngưng kết vi khuẩn mạnh ở thử nghiệm ngưng kết vi khuẩn).
-Số chủng vi khuẩn thử nghiệm: 04 chủng.
-Tất cả các đĩa thạch được đặt trong tủ ấm 37o
C, sau 24 giờ lấy ra đọc kết quả bằng cách đo đường kính vòng vô khuẩn xung quanh giếng thạch nhỏ kháng thể (nếu IgY có hoạt tính ức chế vi khuẩn sẽ tạo ra vòng ức chế vi khuẩn xung quanh giếng thạch nhỏ kháng thể). Tính đường kính hiệu lực kháng khuẩn bằng đường kính vòng ức chế vi khuẩn trừ đi đường kính giếng thạch có thuốc. Đường kính vòng ức chế vi khuẩn tỉ lệ thuận với hoạt tính của kháng thể.
2.3.9. Đánh giá độ ổn định của kháng thể IgY trong quá trình bảo quản
Chế phẩm IgY được chia lô và bảo quản trong điều kiện khác nhau bao gồm: Bảo quản ở nhiệt độ phòng, ở 4°C, và ở nhiệt độ -20ºC và được đánh giá hoạt tính phản ứng sau bảo quản bằng xét nghiệm ELISA như được mô tả trong Mục 2.3.5.
- Ở 4ºC: 2 tuần lấy mẫu 1 lần trong 16 tuần.
- Ở -20ºC: 1 tháng lấy mẫu 1 lần trong 5 tháng.
2.3.10. Gây bỏng thỏ thực nghiệm
Thỏ được cạo sạch lông 2 bên sống lưng với kích thước vùng cạo lông khoảng 12cm mỗi chiều. Cố định thỏ lên bàn chuyên dụng, gây mê bằng dung dịch penthotal 1% với liều 1mL/kg cân nặng theo đường tiêm tĩnh mạch tai. Khi thỏ đã mê, dùng bình nhôm hình trụ đáy phẳng có đường kính 3 cm đựng nước đang sôi với thể tích hằng định đặt lên vùng da thỏ đã cạo lông và ép với một lực không đổi bằng cách đặt một quả cân 1kg lên miệng bình. Thời gian tiếp xúc với nguồn nhiệt là 35 giây, tạo vết bỏng đường kính 3 cm với độ bỏng tương đương với độ III sâu. Băng kín vết thương bằng gạc vô trùng. Mức độ tổn thương được đánh giá theo phân loại độ bỏng của Lê Thế Trung (1965) [23].
2.3.11. Gây nhiễm khuẩn vết bỏng
TKMX chủng 6P11 được nuôi cấy hoạt hóa và tạo sinh khối trong môi trường thạch nutrient aga ở 37ºC trong 24 giờ. Thu hoạch sinh khối vi khuẩn, rửa và hòa loãng khuẩn lạc trong nước muối sinh lý vô trùng tạo hỗn dịch 108
vi khuẩn/mL bằng phương pháp so độ đục Mc-Farland. Sử dụng dung dịch vi khuẩn này gây nhiễm cho vết thương ngày thứ hai sau gây bỏng với liều 0,5 mL (tương ứng với 0,5x108
TKMX)/vết thương, bằng cách nhỏ trực tiếp dung dịch vi khuẩn lên vết bỏng, để 30 phút sau đó băng kín vết thương bằng gạc vô trùng tẩm vaselin.
2.3.12. Điều trị vết bỏng nhiễm trực khuẩn mủ xanh
Vào ngày thứ 2 sau gây nhiễm TKMX (ngày thứ 3 sau gây bỏng), trên lưng mỗi thỏ có 2 vết thương kích thước tương tự nhau đã được gây nhiễm TKMX với liều lượng và phương pháp như nhau đang có biểu hiện vết thương có màu xanh đặc trưng do nhiễm TKMX. Các vết thương được lấy mẫu để xác định số lượng vi khuẩn ở vết thương, sau đó điều trị theo qui ước các vết thương bên phải làm nhóm thí nghiệm và các vết thương bên trái làm nhóm chứng. Hàng ngày các vết thương được thay băng riêng rẽ sau đó nhóm thí nghiệm được đắp gạc tẩm 5 mL dung dịch IgY kháng TKMX nồng