3.1.2.1. Ảnh hưởng các tỉ lệ pha loãng lòng đỏ trứng/nước đến hiệu quả
tách chiết IgY
Lòng đỏ trứng được pha loãng với nước cất lạnh ở các tỷ lệ khác nhau từ 1:5 đến 1:11, sau đó để lắng và thu hoạch dịch nổi như mô tả ở bước 1 mục 2.3.3. Sản phẩm thu được điều chỉnh về cùng thể tích và đánh giá hoạt tính của kháng thể bằng phản ứng ELISA trong cùng điều kiện thí nghiệm. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ pha loãng lòng đỏ trứng/nước đến hiệu quả tách chiết IgY được thể hiện trong Hình 3.5.
Hình 3.5: Ảnh hưởng các tỉ lệ pha loãng lòng đỏ trứng/nước đến hiệu quả tách chiết IgY.
Nhận xét:
- Trong các điều kiện để tách chiết IgY được khảo sát, tỷ lệ pha loãng lòng đỏ trứng 1:9 trong nước cất lạnh là thu được kháng thể IgY với hoạt tính cao nhất.
- Ở các tỷ lệ thấp hơn hoặc cao hơn, sự chênh lệch về lượng protein thu được không đáng kể nhưng hoạt tính kháng thể không cao bằng tỷ lệ 1:9.
- Điều này có thể giải thích là do ở độ pha loãng thấp lượng nước không đủ để hoà tan hết lượng kháng thể có trong lòng đỏ trứng, còn ở các tỷ lệ cao hơn kháng thể thu hồi bị pha loãng quá lớn mặc dù số lượng kháng thể thu được lớn nhưng sẽ phải mất nhiều công đoạn để thu hồi sản phẩm dẫn đến giảm hoạt tính cũng như hao hụt mất kháng thể.
3.1.2.2. Ảnh hưởng của pH đến hiệu quả tách chiết IgY
Lòng đỏ trứng gà được pha loãng theo tỷ lệ 1:9 với nước có pH từ 3,0 tới 9,0. Sản phẩm thu được định lượng protein và kiểm tra độ đặc hiệu bằng phản ứng ELISA trong cùng điều kiện thí nghiệm. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của pH đến hiệu quả tách chiết IgY được trình bày trong Hình 3.6.
Hình 3.6: Ảnh hưởng của pH đến hiệu quả tách chiết IgY. Nhận xét: Nhận xét:
- Chế phẩm IgY thu được với hoạt tính mạnh nhất ở pH 6,0. Điều này cũng phù hợp với đặc tính ổn định của IgY trong điều kiện pH từ 3,5 đến 11,0.
- Ở pH 3,0 hoạt tính của IgY rất yếu có thể do pH quá acid này làm biến tính IgY.
- Ở pH cao hơn (8,0 đến 9,0) cũng làm ảnh hưởng tới hoạt tính của IgY. - pH 6,0 tỏ ra là pH tối ưu để tách chiết IgY từ lòng đỏ trứng. Điều này cũng phù hợp với những qui tắc chung trong thao tác với các phân tử kháng thể.
3.1.2.3. Ảnh hưởng của nồng độ sulphat amoni bão hòa đến hiệu quả tách chiết IgY
Lòng đỏ trứng gà sau khi được tách chiết bằng nước với tỷ lệ 1:9, pH 6,0 được tủa với muối sulphat amoni ở các nồng độ từ 20% đến 60%. Chế phẩm thu được tiến hành phản ứng ELISA trong cùng điều kiện thí nghiệm. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nồng độ muối sulphat amoni đến hiệu quả tách chiết IgY được thể hiện trong Hình 3.7.
Hình 3.7: Ảnh hưởng của nồng độ sulphat amoni bão hòa đến hiệu quả tách chiết IgY.
Nhận xét:
- Kết tủa IgY bằng muối sulphat amoinở nồng độ 40% bão hoà cho hoạt tính kháng thể thu được là mạnh nhất.
- Ở nồng độ muối thấp (20 đến 30%) có thể chưa kết tủa hết IgY còn ở nồng độ muối cao (50 đến 60%) lại có thể tạp lẫn các protein khác không phải IgY vào hỗn hợp protein thu được.
3.1.2.4. Phân tích và tinh sạch sản phẩm IgY bằng sắc ký trao đổi ion
Phân đoạn protein tủa ở 40% sulphat amoni bão hòa sau thẩm tích loại muối được phân tách tiếp bằng sắc ký trao đổi ion. Sắc ký đồ sắc ký trao đổi ion của chế phẩm kháng thể thu được sau kết tủa với sulphat amoni được trình bày trong Hình 3.8. Hoạt tính kháng thể IgY đặc hiệu với TKMX trong các phân đoạn sắc ký được kiểm tra bằng kỹ thuật ELISA và được trình bày trong Hình 3.9.
Hình 3.8: Sắc ký đồ trao đổi ion sản phẩm sau tủa bằng sulphat amoni.
Nhận xét:
- Sắc ký đồ ở Hình 3.8 cho thấy có 2 đỉnh protein. Đỉnh 1 là các protein không bám vào cột và được đẩy ra cùng với dung dịch đệm ở giai đoạn nạp mẫu và rửa cột với dung dịch đệm A có nồng độ muối thấp. Đỉnh 2 là phân đoạn protein được đẩy ra khỏi cột bằng dung dịch đệm B có nồng độ muối cao.
Hình 3.9: Kết quả phân tích bằng ELISA kiểm tra hoạt tính kháng thể ở các phân đoạn sắc ký. Mỗi phân đoạn được pha loãng ở một hàng theo
chiều từ trên xuống dưới
Nhận xét:
- Kết quả khảo sát hoạt tính kháng thể đặc hiệu kháng TKMX ở Hình 3.9 cho thấy phân đoạn ở đỉnh 1 không có hoạt tính kháng thể, có thể thấy đây là các protein tạp. Phân đoạn ở đỉnh 2 có hoạt tính kháng thể mạnh với TKMX tương ứng với phần chứa kháng thể IgY.
- So sánh tỷ lệ tương đối giữa đỉnh 1 và đỉnh số 2 cho thấy sản phẩm IgY thu được sau tủa phân đoạn với sulphat amoni 40% bão hoà còn chưa sạch.
3.1.2.5. Kết quả điện di SDS-PAGE sản phẩm IgY sau các bước tách chiết,
tinh sạch
Độ tinh sạch của chế phẩm IgY sau các bước tách chiết và tinh sạch bằng sắc ký trao đổi ion được đánh giá tiếp bằng kỹ thuật điện di SDS-PAGE trong điều kiện biến tính. Kết quả điện di SDS-PAGE được trình bày trong Hình 3.10.
Hình 3.10: Kết quả điện di SDS-PAGE trong điều kiện biến tính các sản
phẩm sau mỗi bước tách chiết tinh sạch IgY từ lòng đỏ trứng gà.
Ghi chú:
1) Protein toàn phần tách bằng nước cất;
2) Protein sau kết tủa bằng sulphat amoni 40% bão hoà ; 3) Phân đoạn bám cột sắc ký trao đổi ion (đỉnh 2);
M) Protein marker;
Nhận xét:
- Protein toàn phần từ lòng đỏ trứng sau tách bằng nước cất chứa rất nhiều protein tạp. Các protein này được loại bỏ lần lượt bằng tủa phân đoạn với sulphat amoni và sắc ký trao đổi ion. Qui trình tinh sạch này tương đối đơn giản, cho IgY có độ tinh sạch cao hơn, trên SDS-PAGE thành phần protein tạp ít.
- Phân tích bằng SDS – PAGE cho thấy sản phẩm thu được sau sắc ký là tinh sạch nhất. Tuy nhiên sản phẩm thu được sau tủa với sunphat amoni là tinh sạch và có hoạt tính cao hơn. Với kích thước khoảng 70 kDa và 42 kDa, phù hợp với kích thước chuỗi nặng (H) và chuỗi nhẹ (L) của IgY, khẳng định sản phẩm thu được là IgY.
3.1.2.6. Hiệu suất tách chiết IgY từ lòng đỏ trứng
Hiệu suất tách chiết IgY từ lòng đỏ trứng được tính toán dựa trên sản lượng protein thu được sau mỗi bước tách chiết, tinh sạch so với tổng lượng protein có trong mẫu dịch pha loãng lòng đỏ trứng ban đầu. Kết quả được trình bày trong Bảng 3.1.
Bảng 3.1: Hiệu suất tách chiết IgY từ lòng đỏ trứng.
TT Các bước tách chiết thu được (mg/1 Lượng protein lòng đỏ trứng)
Hiệu suất (%)
Độ tinh sạch kháng thể
1 Dịch thu được sau tủa lipid bằng nước cất
1863,03 100 Tạp lẫn một số thành phần khác 2 Tủa sulphat amoni 202,01 10,84 Tương đối tinh
khiết 3 Sắc ký trao đổi ion 139,98 7,51 Tinh khiết
Nhận xét:
- Hiệu suất thu hồi protein tổng số trong đó có chứa IgY qua các bước có sự khác biệt lớn.
- Sau lọc, mặc dù thu được protein tổng số lớn nhưng kháng thể thu được có hoạt tính thấp do chứa nhiều protein tạp khác.
- Sản phẩm thu được sau tủa với muối sulphat amoni và sắc ký trao đổi ion với số lượng kháng thể thấp nhưng hoạt tính của kháng thể mạnh, độ tinh sạch cao hơn.