Nghiên cứu sản xuất chế phẩm vi sinh vật bổ sung vào thức ăn chăn nuôi lợn giúp giảm thiểu ô nhiễm môi trường do chất thải mã số v2018 16

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI KHOA HỌC CÔNG NGHỆ CẤP TRƢỜNG “Nghiên cứu sản xuất chế phẩm vi sinh vật bổ sung vào thức ăn chăn nuôi lợn giúp giảm thiểu ô nhiễm môi trường chất thải” Mã số: V2018-16 Chủ nhiệm đề tài: Đào Thị Hồng Vân Hà Nội - 2019 MỤC LỤC MỞ ĐẦU PHẦN 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Một số đặc điểm dinh dưỡng tiêu hóa lợn 1.2 Vi sinh vật trình xử lý chất thải hữu 13 1.2.1 Vi sinh vật phân hủy hợp chất hữu 13 1.2.2 Quá trình xử lý chất thải hữu .9 1.3 Chế phẩm vi sinh vật 19 PHẦN 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22 2.1 Nguyên liệu 22 2.1.1 Nguồn vi sinh vật 22 2.1.2 Hóa chất thiết bị sử dụng 22 2.1.3 Môi trường nghiên cứu 22 2.2 Phương pháp nghiên cứu 23 2.2.1 Các phương pháp định tính định lượng 23 2.2.2 Phương pháp phân lập .23 2.2.3 Phương pháp tuyển chọn 25 2.2.4 Phương pháp phân loại 25 2.2.4 Nghiên cứu điều kiện ni cấy thích hợp 28 2.2.6 Thử nghiệm đánh giá hiệu chế phẩm 28 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Error! Bookmark not defined 3.1 Phân lập tuyển chọn chủng vi sinh vật hữu ích 29 3.1.1 Phân lập 29 3.1.2 Tuyển chọn vi sinh vật có đặc tính probiotic phân hủy hợp chất hữu 30 3.2 Nghiên cứu số đặc điểm sinh học, phân loại chủng vi sinh vật lựa chọn 29 3.2.1 Một số đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa phân loại vi sinh vật 29 3.2.2 Ảnh hưởng muối mật đến khả sinh trưởng chủng lựa chọn 45 3.2.3 Khả dính bám chủng vi sinh vật vào niêm mạc đường tiêu hóa 38 3.3 Nghiên cứu lựa chọn môi trường điều kiện lên men thu sinh khối 39 3.3.1 Đối với chủng Lactobacillus acidophilus AH4 39 3.3.2 Đối với chủng Bacillus subtilis H11 .50 3.4 Nghiên cứu sản xuất chế phẩm vi sinh vật 54 3.4.1 Kiểm tra tính đối kháng chủng lựa chọn 54 3.4.2 Khả sinh trưởng chuyển hóa dinh dưỡng chủng lựa chọn với số thành phần có thức ăn 54 3.4.3 Tạo chế phẩm 55 3.5 Đánh giá mức độ an toàn thời gian bảo quản chế phẩm 60 3.6 Thử nghiệm lợn 62 KẾT LUẬN .63 TÀI LIỆU THAM KHẢO .63 PHỤ LỤC 63 DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1 Kết phân lập vi sinh vật từ nguồn khác Bảng 3.2 Số lượng chủng vi khuẩn lactic có khả sinh axit Bảng 3.3 Khả sản sinh bacteriocin kháng vi khuẩn kiểm định 10 chủng vi khuẩn lactic (được đánh giá đường kính vịng kháng khuẩn - ∆D, mm) Bảng 3.4 Số lượng chủng Bacillus có khả sinh enzym ngoại bào phân giải chất Bảng 3.5 Khả phân giải chất số chủng vi khuẩn Bacillus Bảng 3.6 Hoạt tính kháng khuẩn 15 chủng vi khuẩn Bacillus Bảng 3.7 Số lượng chủng nấm men có hoạt tính kháng khuẩn Bảng 3.8 Ảnh hưởng pH ban đầu đến khả sinh trưởng 06 chủng nấm men Bảng 3.9 Đặc điểm hình thái vi khuẩn lactic Bảng 3.10 Đặc điểm sinh lý sinh hóa vi khuẩn lactic Bảng 3.11 Các đặc điểm sinh hoá 02 chủng vi khuẩn lactic Bảng 3.12 Kết giải trình tự so sánh gen mã hoá cho rARN 16S chủng vi khuẩn lactic Bảng 3.13 Đặc điểm nuôi cấy chủng H9 số môi trường Bảng 3.14 Đặc điểm nuôi cấy chủng H11 số mơi trường Bảng 3.15 Đặc điểm hình thái tế bào chủng H9 H11 Bảng 3.16 Đặc điểm sinh hóa chủng vi khuẩn H9 H11 Bảng 3.17 Kết giải trình tự so sánh gen mã hoá cho rARN 16S 02 chủng vi khuẩn Bacillus Bảng 3.18 Một số đặc tính hình thái sinh lý sinh hoá chủng nấm men V1 Bảng 3.19 Kết giải trình tự so sánh gen mã hoá cho rARN 5,8S chủng nấm men V1 Bảng 3.20 Ảnh hưởng mơi trường ni cấy có nồng độ muối mật khác đến khả sinh trưởng chủng vi sinh vật Bảng 3.21 Khả bám dính chủng vi sinh vật biểu mô ruột Bảng 3.22 Ảnh hưởng môi trường dinh dưỡng đến phát triển vi khuẩn L acidophilus AH4 Bảng 3.23 Ảnh hưởng nguồn đường khác đến khả sinh trưởng chủng L acidophilus AH4 Bảng 3.24: Ảnh hưởng nhiệt độ nuôi cấy đến khả sinh trưởng (OD600nm) sản sinh axit lactic (g/l) L acidophilus AH4 Bảng 3.25 Ảnh hưởng pH môi trường đến phát triển sinh axit L acidophilus AH4 Bảng 3.26 Điều kiện lên men thu sinh khối chủng L acidophilus AH4 Bảng 3.27 Sinh khối chủng vi khuẩn nghiên cứu theo thời gian Bảng 3.28 Khả sinh trưởng (giá trị OD600nm) chủng vi khuẩn B subtilis H11 với nguồn cacbon khác Bảng 3.29 Ảnh hưởng nguồn nitơ lên sinh trưởng chủng vi khuẩn nghiên cứu Bảng 3.30: Ảnh hưởng nhiệt độ nuôi cấy đến khả sinh trưởng (OD600nm) sinh enzym chủng Bacillus subtilis H11 Bảng 3.31 Ảnh hưởng pH môi trưởng đến khả sinh trưởng phát triển chủng vi khuẩn Bacillus subtilis H11 Bảng 3.32: Điều kiện lên men thích hợp cho vi khuẩn Bacillus subtilis H11 Bảng 3.33 Khả sinh trưởng chủng vi sinh vật lựa chọn mơi trường có chứa số thành phần có hoạt tính bổ sung phần ăn Bảng 3.34: Điều kiện thu hồi sinh khối vi khuẩn Bảng 3.35 Tỷ lệ phối trộn chất phụ gia với sinh khối vi khuẩn Bảng 3.36 Điều kiện tạo chế phẩm vi sinh vật Bảng 3.37: Tổng hợp lượng sinh khối chất phụ gia sử dụng để tạo 10kg chế phẩm Bảng 3.38 Tỷ lệ sống sót vi khuẩn chế phẩm sau thời gian bảo quản Bảng 3.39 Kết kiểm định mật độ vi sinh vật chế phẩm Trung tâm Công nghệ Môi trường (tháng 09/2018) Bảng 3.40 Kết kiểm định mật độ vi sinh vật chế phẩm Trung tâm Công nghệ Môi trường (tháng 12/2018) Bảng 3.41 Đối tượng, thời gian môi trường thử nghiệm Bảng 3.42 Tổng hợp kết đánh giá theo cảm quan người sử dụng chế phẩm DANH MỤC HÌNH Hình 3.1 Kết xác định số lượng vi sinh vật có mẫu số mơi trường đặc trưng sau 48 nuôi nhiệt độ 30C Hình 3.2 Khả phân hủy CaCO3 (A) phát triển môi trường đặc (B) chủng vi khuẩn lactic AH3 Hình 3.3 Hoạt tính kháng chủng lactic chủng vi khuẩn kiểm định E coli Hình 3.4 Khả sinh enzym cellulase (A), amylase (B) protease (C) chủng vi khuẩn Bacillus Hình 3.5 Khả sinh enzym ngoại bào có dịch sau lên men chủng vi khuẩn Bacillus mơi trường có chứa chất (1)-casein; (2)-xenluloza, (3)- tinh bột Hình 3.6 Hình thái chủng vi khuẩn (A) khả đối kháng với chủng vi khuẩn Salmonella sp (B) E coli (C) Hình 3.7 Hình thái khuẩn lạc 06 chủng nấm men Hình 3.8: Hình thái khuẩn lạc tế bào chủng vi khuẩn lactic Hình 3.9 Điện di đồ sản phẩm ADN tổng số PCR sử dụng cặp mồi16S F1 16S R1 Hình 3.10 Mức độ tương đồng di truyền chủng vi khuẩn AH3 AH4 với số chủng vi khuẩn Lactobacillus có họ hàng gần gũi Hình 3.11 Hình thái khuẩn lạc tế bào chủng vi khuẩn Bacillus Hình 3.12 Kết kít thử API 50CHB hai chủng vi khuẩn H9 H11 Hình 3.13 Điện di đồ sản phẩm PCR sử dụng cặp mồi16S F1 16S R1 từ DNA tổng số hai chủng H9 H11 Hình 3.14 Mức độ tương đồng di truyền chủng vi khuẩn H11 H9 với số chủng vi khuẩn Bacillus có họ hàng gần gũi Hình 3.15 Hình thái khuẩn lạc (A) hình thái tế bào chủng nấm men (B) Hình 3.16 Điện di đồ sản phẩm DNA tổng số PCR sử dụng cặp mồi ITS1 ITS4 Hình 3.17 Mức độ tương đồng di truyền chủng nấm men V1 với số chủng nấm men có họ hàng gần gũi Hình 3.18 Ảnh hưởng pH mơi trường đến trình sinh trưởng phát triển chủng vi khuẩn Hình 3.19 Khả đồng sinh trưởng hai chủng vi khuẩn lựa chọn Hình 3.20 Qui trình tạo chế phẩm vi sinh vật Hình 3.21: Chế phẩm vi sinh vật sau đông khô (A) sau trình phối trộn tạo thành chế phẩm (B) Hình 3.22: Cám heo Jolie Neovia trước (A) sau (B) trộn chế phẩm vi sinh vật MỞ ĐẦU Theo Cục Chăn nuôi (Bộ Nông nghiệp Phát triển nông thôn) [02], tổng đàn lợn nước 28,8 triệu con, sản lượng thịt lợn xuất chuồng đạt 3,7 triệu tấn, tăng 1,9% so với năm trước Tuy nhiên, ngành chăn nuôi lợn phát triển kéo theo khối lượng chất thải tăng cao, không ảnh hưởng tới môi trường sống người chăn nuôi vùng xung quanh mà cịn gây nhiễm nguồn nước, tài nguyên đất vùng Do đó, ngành chăn ni phát triển khơng kèm với biện pháp xử lý chất thải làm môi trường sống người xuống cấp nhanh chóng Mơi trường bị nhiễm lại tác động trực tiếp vào sức khoẻ vật nuôi, phát sinh dịch bệnh, gây khó khăn cơng tác quản lý, giảm suất, chất lượng Trong chất thải chăn nuôi lợn chứa nhiều hợp chất hữu cơ, vô cơ, vi sinh vật gây bệnh có mùi Đặc thù chất thải chăn nuôi lợn chất thải rắn, lỏng trộn lẫn nên khó thu gom xử lý triệt để Do vậy, giảm bớt mức độ ô nhiễm chất thải trước chúng phát tán môi trường việc làm cẩn thiết Trong dinh dưỡng động vật, việc tăng cường sức khoẻ hệ thống tiêu hoá vật nuôi thông qua tác động tới hệ vi sinh vật đường ruột coi giải pháp hữu hiệu Hệ vi sinh vật đường ruột vật nuôi phong phú chủng loại số lượng, biến động cấu, số lượng loài vi sinh vật đường ruột nguyên nhân chủ yếu dẫn đến rối loạn tiêu hoá hấp thu Bởi vậy, việc sử dụng biện pháp kỹ thuật thông qua thức ăn nuôi dưỡng nhằm tạo nên cân tối ưu loài vi sinh vật đường ruột theo hướng có lợi cho vật chủ hướng nghiên cứu nhà nghiên cứu ngồi nước quan tâm Có nhiều biện pháp để cải thiện quan hệ cân nhóm vi khuẩn có lợi có hại đường tiêu hố gia súc, gia cầm Một giải pháp hữu hiệu probiotic Probiotic - theo Fuller (1992)- chất bổ sung vi sinh vật sống hữu ích thức ăn nhằm cải thiện cân hệ vi sinh vật đường ruột theo hướng có lợi cho vật chủ Các sản phẩm probiotic nhập dùng chăn ni có mặt thị trường Việt Nam nhiều đáp ứng tích cực cho vật nuôi chưa rõ ràng Các nhà khoa học cho vi sinh vật khơng phù hợp với hệ vi sinh vật đường ruột vật chủ địa Mặt khác, nghiên cứu sản xuất chế phẩm probiotic dùng chăn nuôi nước ta cịn hạn chế Chúng tơi thực đề tài: “Nghiên cứu sản xuất chế phẩm vi sinh vật bổ sung vào thức ăn chăn nuôi lợn giúp giảm thiểu ô nhiễm môi trường chất thải” với định hướng góp phần đưa số giải pháp công nghệ để sản xuất chế phẩm chứa vi sinh có ích, nhằm tăng cường chuyển hóa thức ăn Đề tài thực thành công mở triển vọng việc sản xuất sản phẩm sinh học chất lượng cao, đáp ứng với yêu cầu ngày cao ngành chăn nuôi hữu (hoàn toàn dựa vào nguyên liệu từ thiên nhiên) theo hướng công nghiệp nước ta, hạn chế nhập Mục tiêu đề tài: - Sản xuất chế phẩm vi sinh vật (dạng bột) có tác dụng giảm mùi hôi thối mức độ ô nhiễm chất thải - Thử nghiệm bổ sung chế phẩm vào thức ăn chăn nuôi lợn sở chăn ni lợn xã Trọng Quan, Đơng Hưng, Thái Bình Nội dung nghiên cứu: - Phân lập tuyển chọn chủng vi sinh vật hữu hiệu - Nghiên cứu số đặc điểm sinh học, phân loại đến loài chủng tuyển chọn - Nghiên cứu lựa chọn môi trường điều kiện lên men thu sinh khối - Sản xuất chế phẩm vi sinh vật (10 kg dạng bột) - Đánh giá mức độ an toàn thời gian bảo quản chế phẩm PHẦN 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Một số đặc điểm dinh dƣỡng tiêu hóa lợn Về đặc điểm sinh lý tiêu hoá lợn, theo Lê Hồng Mận, Xuân Giao (2001) [06], lợn lồi gia súc có loại hình dày đơn Mơi trường dày có axit (pH = 2,0-2,5) dịch vị tiết pH dịch vị thấp phù hợp điều kiện hoạt động pepsin để phân giải protein thành sản phẩm trung gian albumoz, pepton lượng nhỏ axit amin Ruột non lợn chứa dịch tụy, dịch ruột dịch mật, có mơi trường kiềm tính với pH khoảng 7,8 - 8,7 có dịch tụy dịch ruột chứa đủ enzyme tiêu hóa triệt để chất dinh dưỡng thức ăn Nhờ vậy, ruột non phận tiêu hóa chứa đầy đủ enzyme thủy phân chất dinh dưỡng thức ăn thành chất dinh dưỡng đơn giản mà thể hấp thu trực tiếp qua vách ruột vào máu Trong tất chất dinh dưỡng, protein đại phân tử có cấu tạo phức tạp nên phức hệ enzyme thủy phân protein (gọi chung protease) phức tạp chia làm nhóm khác tùy theo khả mức độ phân giải enzyme, đó: Nhóm gồm enzyme pepsin dịch vị, trypsin chymotrypsin dịch tụy, erepxin dịch ruột, nhóm thủy phân protein thành peptit ngắn 6-8 axit amin Nhóm nhóm enzyme phân giải peptit Nhóm nhóm enzyme thủy phân protein tổ chức liên kết elastaza thủy phân elastin Nhóm nhóm enzyme thủy phân protein nhân tế bào Dịch mật khơng chứa enzyme tiêu hóa, hỗ trợ hoạt động tiêu hóa hấp thu, tiêu hóa mỡ Ruột non có cấu tạo đặc biệt, thích ứng cao với tiêu hóa hấp thu thức ăn Dọc niêm mạc ruột có tuyến ruột phát triển tiết dịch ruột theo kiểu toàn tiết, tức tế bào tuyến chứa đầy enzyme từ niêm mạc ruột bong theo chu kỳ rơi thẳng vào xoang ruột tạo nguồn nitơ nội sinh Đây đặc điểm gây ảnh hưởng tới tính xác kết thử mức tiêu hóa protein lợn mà ta loại trừ Ở ruột già lợn có hệ vi sinh vật cộng sinh manh tràng kết tràng có khả phân giải chất xơ Ruột già không tiết enzyme mà tiếp tục phân giải thức ăn nhờ enzyme ruột non Tỷ lệ tiêu hóa cao hay thấp phụ thuộc vào thời gian lưu thức ăn ruột già (12 - 16 giờ) Tính trung bình có 14% chất xơ, 12% protein 9% mỡ lại dưỡng chất tiêu hóa ruột già [5] Hoạt động chủ yếu ruột già lên men chất xơ tác động hệ vi sinh vật manh tràng, kết tràng hoạt động phân hủy protein thừa thức ăn vi khuẩn gây thối tạo thành chất độc crezon, fenol, indol, scatol Các chất độc hấp thu vào máu giải độc gan Nếu nhiều gây tình trạng ngộ độc đường tiêu hóa làm cho lợn bị ỉa chảy, chất thải có mùi thối khó chịu, làm nhiễm mơi trường chất khí SO2, H2S Như vậy, trường hợp lên men vi sinh vật ruột già manh tràng, kết tràng lợn tạo sinh khối vi sinh vật thải theo phân nguồn nitơ với nitơ thừa thức ăn gây sai số đáng kể việc xác định tỷ lệ tiêu hóa thực nitơ thức ăn ăn vào Hoạt động tiêu hóa lợn vào ban ngày thường lớn ban đêm thời gian thức ăn lưu lại đường tiêu hóa lợn khoảng 24 Tuy nhiên, có phần nhỏ thức ăn thải khoảng 4-5 ngày Nhu cầu chất dinh dưỡng phát triển lợn: Theo Vũ Duy Giảng cs, (1999) [03] protein hợp chất hữu phức tạp có phân tử lượng lớn; bao gồm cacbon, hydro, oxy, có nitơ lưu huỳnh Protein tìm thấy tất trình xảy tế bào, thể có protein đặc hiệu Protein đảm nhiệm nhiều chức quan trọng nguồn nguyên liệu cấu tạo lên tế bào Quá trình sinh trưởng lợn trình tăng lên khối lượng protein Protein có nhiều chất (30 - 35% tổng lượng protein thể) Protein thành phần cấu trúc quan trọng thể lợn Theo Từ Quang Hiển, Phan Đình Thắm (2001) [04]; nhu cầu protein thể thực chất nhu cầu axit amin Cơ thể vật tổng hợp lên protein theo mức cân đối axit amin thức ăn Những axit amin nằm cân đối bị oxi sản sinh lượng cung cấp axit amin theo tỷ lệ cân đối nâng cao hiệu lợi dụng protein, tiết kiệm protein thức ăn Một thí nghiệm nghiên cứu lợn sinh trưởng cho biết: yêu cầu tăng trọng 585g/con/ngày phần cân đối axit amin protein thô cần 11 - 12%, phần cân đối axit amin cần 20 -22% protein thô [09] Theo Lê Hồng Mận, Xuân Giao (2001) [06], cho biết: tổng thể lợn, chất khoáng chiếm 3% có tới 75% canxi photpho, xấp xỉ 25% kali natri Trong thể có magie lượng nhỏ sắt, kẽm, đồng cịn chất khống khác tồn mức dấu vết 10 37 30 180 MT2 cải tiến (maltodextrin+cao nấm men+pepton) 109 3.4 Nghiên cứu sản xuất chế phẩm vi sinh vật 3.4.1 Kiểm tra tính đối kháng chủng đƣợc lựa chọn Bằng phương pháp cấy vạch để thử tính đối kháng, kết thu cho thấy chủng Lactobacillus acidophilus AH4 Bacillus subtilis H11 khơng có tính đối kháng lẫn Đây đặc điểm thuận lợi để tạo chế phẩm có mặt đồng thời chủng Hình 3.19 Khả đồng sinh trưởng hai chủng vi khuẩn lựa chọn 3.4.2 Khả sinh trƣởng chuyển hóa dinh dƣỡng chủng đƣợc lựa chọn với số thành phần có thức ăn Trong số yếu tố ảnh hưởng đến sức sống hoạt tính vi sinh vật probiotic tương tác chúng thành phần phần (chủ yếu số loại muối vơ cơ, chất axit hóa) có ý nghĩa quan trọng Kết nghiên cứu tương thích vi sinh vật lựa chọn số thành phần có hoạt tính bổ sung phần số loại khoáng CuSO4 (250 ppm Cu); ZnSO4 (100 ppm Zn) hỗn hợp axit hữu (gồm axit lactic axit, axit formic, axit citric ) với liều 200mg/lít trình bày bảng 3.33 Bảng 3.33 Khả sinh trưởng chủng vi sinh vật lựa chọn mơi trường có chứa số thành phần có hoạt tính bổ sung phần ăn Thành phần Đối chứng Số lƣợng tế bào hai chủng vi khuẩn (CFU/ml) L acidophilus AH4 B subtilis H11 6,5 x 108 5,2 x 109 54 CuSO4.5H2O 4,5 x 108 1,8 x 109 ZnSO4.5H2O 4,3 x 108 8,8 x 108 Hỗn hợp axit hữu 1,45 x1010 4,0 x1010 Kết bảng 3.33 cho thấy, vi khuẩn L acidophilus AH4 B subtilis H11 sinh trưởng phát triển bình thường mơi trường diện muối sulfat đồng (CuSO4.5H2O), kẽm (ZnSO4.5H2O) hỗn hợp số loại axit hữu với liều tương tự liều khuyến cáo bổ sung phần thức ăn Điều có ý nghĩa quan trọng việc hướng dẫn sử dụng sản phẩm probiotic có chứa chủng chăn ni lợn Với sản phẩm probiotic mà chủng vi sinh vật có tính tương thích cao với thành phần có hoạt tính phần thức ăn tính ứng dụng lớn Bởi cơng nghệ chế biến thức ăn chăn nuôi, probiotic chất bổ sung với thành phần khác vào thức ăn, với hoạt tính có chủng tăng cường chuyển hóa thành phần có thức ăn protein, chất sơ, tinh bột thành chất đường, axit amin thể lợn hấp thụ tối đa để chuyển hóa thành lượng sinh khối Ngồi có mặt nhóm vi sinh vật probiotic ruột non ruột già hạn chế phát triển nhóm vi sinh vật gây bệnh, bên cạnh hấp thụ chất dinh dưỡng, đường tiêu hóa cịn đóng vai trị quan trọng quan miễn dịch lớn thể, hệ thống bảo vệ hàng rào quan trọng chống lại tác nhân gây bệnh xâm nhiễm Thêm vào chế bảo vệ nói chung, hệ thống miễn dịch, với phản ứng đặc hiệu không đặc hiệu, giúp chống lại vi sinh vật gây bệnh Khu hệ vi sinh vật đường ruột coi yếu tố chống lại tác nhân gây bệnh 3.4.3 Tạo chế phẩm 3.4.3.1 Thu hồi sinh khối Hai chủng vi khuẩn sử dụng tạo chế phẩm lên men theo điều kiện nghiên cứu (phần 3.3), sau ly tâm thu lượng sinh khối nhưu sau: Bảng 3.34: Điều kiện thu hồi sinh khối vi khuẩn Chủng vi sinh vật Tốc độ ly tâm (vòng/phút) Nhiệt độ Thời gian ly Thể tích lên Sinh khối men (ml) thu hồi ly tâm tâm (phút) o (gam) ( C) 55 Bacillus subtillis H11 Lactobacillus acidophillus AH4 8000 8000 10 1500 67,3 10 1500 57,1 3.4.3.2 Lựa chọn chất mang tỷ lệ phối trộn Trong trình đơng khơ tạo chế phẩm thường bổ sung chất ổn định nhằm bảo quản vi sinh vật sống tốt hơn, đồng thời khối bột sau đông khô thường xốp, dễ hòa tan phân tán lại Mặt khác để bảo vệ vi sinh vật trình khử nước q trình đơng khơ u cầu chất ổn định phải an toàn người hay động vật sử dụng, sử dụng đường Lactose, sữa gày, axit ascorbic, vì: Đường Lactose có tác dụng bảo vệ lớp phospholipid protein vi sinh vật Sữa gày sữa tách bơ, có hàm lượng chất béo khơng q 1% Lượng chất béo sữa gầy thấp giúp cho sản phẩm trộn giảm mức độ oxy hóa nên bền Ngồi ra, sữa gầy có hàm lượng protein cao giúp bảo vệ thành phần màng tế bào khỏi bị tổn thương Axit ascorbic chất chóng oxy hóa mạnh, có tác dụng hạn chế nhiễm khuẩn q trình đơng khơ sử dụng Phối trộn chất phụ gia theo công thức: CT1: Lactose : sữa gầy : axit ascorbic = 7:3:1 CT2: Lactose : sữa gầy : axit ascorbic = 8:2:1 Sau đó, chất phụ gia phối trộn với sinh khối ướt vi khuẩn sau ly tâm theo tỷ lệ 2:1 (lượng sinh khối vi khuẩn chủng – 1:1) Kết sau: Bảng 3.35 Tỷ lệ phối trộn chất phụ gia với sinh khối vi khuẩn Lần thực Công thức Lactose (g) Sữa gày (g) Axit ascorbic 56 Sinh khối đem phối Chế phẩm sau đông khô Lần Lần (g) trộn (g) (g) CT1 70 30 10 55 123,0 CT2 80 20 10 55 120,4 CT1 98 42 14 77 173,2 CT2 112 28 14 77 169,0 Như vậy, lượng chế phẩm tạo công thức tương đối đồng đều, nhiên CT1 tạo lượng chế phẩm cao CT2 nên đề tài lựa chọn CT1 để tạo chế phẩm với lượng lớn Bảng 3.36 Điều kiện tạo chế phẩm vi sinh vật Tỷ lệ chất phụ gia Tỷ lệ Tỷ lệ chất Nhiệt độ (đƣờng:sữa gầy: axit sinh khối phụ gia:sinh đông khô ascorbic) khối 7:3:1 1:1 2:1 -50oC 3.4.3.3 Qui trình tạo chế phẩm Bacillus subtilis H11, Lactobacillus57acidophilus AH4 Áp suất Thời gian đông khô đông khô 10-4 tor 18-24 Môi trường MPA, MRS Nhân giống cấp I, II 37oC, ni lắc 180 vịng/phút Lên men bình tam giác 1000ml Ly tâm 8000 v/phút, 4oC Dịch Thu sinh khối Rửa sinh khối Nước khử trùng Dịch rửa Sinh khối Bổ sung phụ gia Đông khô (sấy phun) Chế phẩm vi sinh vật Hình 3.20 Qui trình tạo chế phẩm vi sinh vật Nhân giống cấp I, II: Nếu chủng giống bảo quản điều kiện -80oC cần sàng lọc trước nhân giống Nhân giống cấp 1: Các khuẩn lạc chủng vi khuẩn Bacillus subtilis H11 Lactobacillus acidophilus AH4 dùng để nhân giống cấp I khuẩn lạc to, sinh trưởng mạnh, mọc riêng rẽ, đáp ứng tiêu chuẩn Từ khuẩn lạc chọn sau thời gian 24-48 giờ, môi trường MPA MRS cấy vào ống nghiệm chứa 5ml ni 37oC, tốc độ lắc 180 vịng/phút thời gian 14-16 vi khuẩn Bacillus; nuôi tĩnh thời gian 36 nhiệt độ 37oC Lactobacillus Kiểm 58 tra khả sinh trưởng phát triển đo OD600nm đạt 1,4-1,6 đơn vị, sau cấy truyền sang mơi trường nhân giống cấp II Nhân giống cấp 2: Từ môi trường nhân giống cấp I ống nghiệm, giống phát triển tốt, cấy truyền 5% sang môi trường nhân giống cấp II bình 250 ml mơi trường MPA với vi khuẩn Bacillus MRS cho nhóm vi khuẩn Lactobacillus Ni 37oC, tốc độ lắc 180 vòng/phút thời gian 14-16 chủng vi khuẩn Bacilus subtilis H11 nuôi tĩnh thời gian 36 nhiệt độ 37oC chủng Lactobacillus acidophilus AH4 Kiểm tra khả sinh trưởng phát triển đo OD600nm đạt 1,4-1,6 đơn vị, sau cấy truyền sang mơi trường lên men Lên men Sau trải qua trình nhân giống cấp II, giống đạt tiêu chuẩn tiến hành tiếp giống 2% vào môi trường lên men Khử trùng môi trường nhằm loại bỏ loại vi sinh vật nhiễm tạp bào tử vi sinh vật có mơi trường, tạo điều kiện thuận lợi để chủng vi khuẩn phát triển Sau khử trùng môi trường 121oC 30 phút, tiến hành làm nguội mơi trường, chỉnh pH NaOH 2M, thổi khí để bão hịa oxy mơi trường lên men Điều kiện lên men ban đầu: Tỉ lệ tiếp giống 2%; pH 6,5-7,0; Nhiệt độ 37oC; Tốc độ lắc 200 vòng/phút (đối với Lactobacillus thổi khí nhẹ tiếng đầu sau chuyển nuôi tĩnh) Ly tâm Sau thu hồi sinh khối sau lên men, toàn dịch lên men ly tâm 8000 vòng/phút 4oC thời gian 10 phút nhằm tách phần sinh khối tế bào khỏi phần dịch, thu sinh khối Rửa sinh khối Sinh khối thu được rửa 2-3 lần với nước cất khử trùng Ly tâm 8000 vòng/phút 4oC thời gian 20 phút nhằm loại bỏ dịch rửa thu sinh khối Đơng khơ đóng gói Sau hồn thành q trình đơng khơ, mẫu phối trộn chất phụ gia Chế phẩm đóng gói vào túi PE, để tránh bị hút ẩm, tránh ánh sáng 59 A B Hình 3.21: Chế phẩm vi sinh vật sau đơng khơ (A) sau trình phối trộn tạo thành chế phẩm (B) Bảng 3.37: Tổng hợp lượng sinh khối chất phụ gia sử dụng để tạo 10kg chế phẩm Thể tích lên men (lít) Sinh khối thu đƣợc (kg) Lactose (kg) Sữa gày (kg) Axit ascorbic (kg) Chế phẩm sau đông khô (kg) 108 4,5 5,74 2,46 0,82 10 3.5 Đánh giá mức độ an toàn thời gian bảo quản chế phẩm Lactobacillus acidophilus AH4 Bacillus subtilis H11 biết đến vi sinh vật an toàn, ứng dụng phổ biến nhiều lĩnh vực chế biến thực phẩm, bảo vệ môi trường, … Để theo dõi tồn vi khuẩn chế phẩm theo thời gian, đề tài bảo quản chế phẩm chế độ: ngăn mát tủ lạnh (8 – 10oC) điều kiện thường (nhiệt độ phòng khoảng 23 – 27oC) Kết sau tháng bảo quản sau: Bảng 3.38 Tỷ lệ sống sót vi khuẩn chế phẩm sau thời gian bảo quản Nhiệt độ bảo Thời gian Mật độ tế bào chủng có bảo quản chế phẩm (cfu/g) quản (C) (tháng) Lactobacillus sp Bacillus sp - 10 23 - 27 1,4 × 1010 2,7 × 1010 9,1 × 109 2,1 × 1010 5,2 × 109 8,9 × 109 9,1 × 108 4,6 × 109 6,0 × 108 2,3 × 109 1,4 × 1010 2,7 × 1010 60 3,5 × 109 5,6 × 109 7,0 × 108 4,0 × 109 2,9 × 108 3,3 × 109 1,3 × 108 9,8 × 108 Kết bảng cho thấy, bảo quản chế phẩm điều kiện lạnh sống sót vi khuẩn cao điều kiện nhiệt độ phòng Tuy nhiên, điều kiện thường, sau tháng mật độ tế bào chế phẩm ≥ 108 cfu/g – đạt yêu cầu mật độ vi sinh vật chế phẩm Như vậy, theo nghiên cứu đề tài chế phẩm vi sinh vật bảo quản nhiệt độ tự nhiên thời gian ≥ tháng Để khẳng định lại mật độ vi sinh vật tồn chế phẩm theo thời gian, đề tài gửi mẫu chế phẩm sản xuất vào tháng 8/2018 bảo quản nhiệt độ thường đến kiểm định Phòng phân tích kiểm tra chất lượng sản phẩm – Trung tâm Khoa học Công nghệ Môi trường, kết phân tích sau: Bảng 3.39 Kết kiểm định mật độ vi sinh vật chế phẩm Trung tâm Khoa học công nghệ Môi trường (tháng 09/2018) – Phụ lục kèm theo Thông số Đơn vị Phƣơng pháp xác định Kết Bacillus subtilis CFU/g TCVN4884 - 2015 3,4 × 109 Lactobacillus sp CFU/g TCVN4884 - 2015 5,3 × 108 Bảng 3.40 Kết kiểm định mật độ vi sinh vật chế phẩm Trung tâm Công nghệ Môi trường (tháng 12/2018) – Phụ lục kèm theo Thông số Đơn vị Phƣơng pháp xác định Kết Bacillus subtilis CFU/g TCVN4884 - 2015 2,4 × 109 Lactobacillus sp CFU/g TCVN4884 - 2015 3,3 × 108 Kết phân tích Trung tâm Cơng nghệ Môi trường cho kết gần tương đương với kết tự phân tích đề tài 61 3.6 Thử nghiệm lợn Mục đích thí nghiệm đánh giá hiệu việc sử dụng chế phẩm vi sinh vật đưa vào q trình chăn ni lợn hiệu kinh tế đem lại hộ chăn ni có sử dụng chế phẩm Thực thử nghiệm hộ chăn nuôi lợn, vào thời điểm tháng 12/2018, với điều kiện sau: Bảng 3.41 Đối tượng, thời gian môi trường thử nghiệm Tên hộ chăn nuôi Đối tƣợng lợn thử lợn nghiệm Bà Đông Lợn con, Số lƣợng lợn Thời gian (ngày) Nhiệt độ môi trƣờng Độ ẩm môi trƣờng (%) (oC) 11 15 15 - 26 80 - 93 lợn thịt Bà Len Lợn thịt 10 15 15 - 26 80 - 93 Ông Huyên Lợn nái 02 15 15 - 26 80 - 93 hi ch : Nhiệt độ Độ ẩm theo dự báo hàng ngày Trung t m dự báo khí t ợng thủy văn TW (lấy mốc thấp cao thời gian nghiên c u) (A) (B) Hình 3.22: Cám heo Jolie Neovia trước (A) sau (B) trộn chế phẩm vi sinh vật 62 Bảng 3.42 Tổng hợp kết đánh giá theo cảm nhận người sử dụng chế phẩm (kèm theo phiếu đánh giá xác nhận Hợp tác xã – hụ lục) Cảm nhận hộ chăn nuôi chuồng trại Tên hộ chăn nuôi trƣớc sau sử dụng chế phẩm vi sinh vật Trƣớc Bà Đông Chuồng mùi thối Có nhiều phân Lợn ăn tốt Sau Đỡ mùi thối Ít phân Lợn ăn ngon miệng, da hồng Bà Len Ông Huyên Đánh giá chung Phân nhiều mùi Phân đỡ mùi Lợn ăn nhiều Lợn ăn nhiều Da hồng Da hồng hào, bóng Sử dụng thấy tốt hẳn Mùi chuồng nặng, Lại gần thấy mùi, ngửi rõ từ xa giảm khoảng 2/3 so với trước Lợn ăn bình thường, Lợn ăn uống bình 3kg thức ăn/ngày thường trước Qua thử nghiệm chế phẩm vi sinh vật lợn cho thấy kết bước đầu khả quan: giảm hẳn mùi hôi chuồng trại, khơng ảnh hưởng ảnh hưởng tích cực đến việc ăn màu sắc da lợn Điều chứng tỏ chế phẩm vi sinh vật vào ruột lợn thúc đẩy tốt trình chuyển hóa thức ăn, làm cho lợn tiêu hóa tốt hơn, hấp thu nhiều dinh dưỡng hơn, dẫn đến lượng hữu tồn dư chất thải nên giảm mùi ô nhiễm môi trường 63 KẾT LUẬN Từ ruột non lợn, phân lập 31 chủng vi sinh vật, bao gồm 10 vi khuẩn lactic, 15 vi khuẩn Bacillus 06 nấm men Đã tuyển chọn, nghiên cứu đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa, phân tích trình tự gen định danh 02 chủng vi khuẩn lactic, 02 chủng vi khuẩn Bacillus, 01 chủng nấm men: Lactobacillus acidophilus AH3, Lactobacillus acidophilus AH4, Bacillus licheniformis H9, Bacillus subtilis H11 Saccharomyces cerevisiae V1 Đã nghiên cứu lựa chọn môi trường điều kiện lên men thu sinh khối của: - Lactobacillus acidophilus AH4: môi trường MRS thay nguồn đường maltoza, pH 6,0; nhiệt độ 37oC; thời gian lên men 42 giờ, lắc nhẹ, mật độ đạt 109 CFU/ml - Bacillus subtilis H11: môi trường MT2 cải tiến (bổ sung dextrin, cao nấm men, pepton), pH 7; nhiệt độ 37oC; thời gian lên men 30 giờ, lắc 180 vòng/phút, mật độ đạt 109 CFU/ml Xây dựng bước tạo chế phẩm sản xuất thành công chế phẩm từ vi khuẩn Lactobacillus acidophilus AH4, Bacillus subtilis H11, mật độ cao đạt 1010 CFU/g Sau 05 tháng bảo quản chế phẩm nhiệt độ thường, mật độ tế bào chế phẩm ≥ 108 CFU/g Đã thử nghiệm trộn chế phẩm vào thức ăn chăn nuôi lợn làm giảm phần lớn mùi hôi chuồng trại 64 TÀI LIỆU THAM KHẢO Đào trọng Đạt - Phan Thanh Phượng (1996), Bệnh đường tiêu hóa lợn Nxb Nông nghiêp Hà Nội Nguyễn Quốc Đạt (2017) Báo cáo kết thực kế hoạch tháng 7/2017 Bộ Nông nghiệp Phát triển Nông thôn Vũ Duy Giảng - Nguyễn Thị Lương Hồng - Tôn Thất Sơn (1999), Giáo trình dinh d ỡng th c ăn gia s c, Nxb Nông nghiệp Hà Nội Từ Quang Hiển, Phan Đình Thắm, Ngơn Thị Hốn (2001), Giáo trình thức ăn dinh d ỡng gia súc, gia cầm NXB Nông nghiệp Hà Nội Nguyễn Quang Linh (1997), “Ảnh h ởng th c ăn ủ men đến suất phẩm chất thịt”, Tạp chí Nông nghiệp công nghiệp thực phẩm - KHCN quản lý kinh tế số 10, tr 400 - 402 Lê Hồng Mận, Xuân Giao (2001), Chăn nuôi nái siêu nạc, NXB Lao động xã hội Nguyễn Vĩnh h ớc (1980), Vi sinh vật học ứng dụng chăn nuôi Nxb Nông nghiệp Hà Nội, tr 20, 29, 30, 42, 292 Nguyễn Quang Thạch (2001), “Nghiên cứu tổng hợp tiếp thu công nghệ vật hữu hiệu (EM) nông nghiệp vệ sinh môi tr ờng”, Báo cáo tổng kết nghiệm thu đề tài độc lập cấp Nhà nước năm 1998 - 2000 Nguyễn Khắc Tuấn (1997), “Chế phẩm Emitan dùng chăn nuôi lợn theo mẹ”, Tạp chí chăn ni, hội chăn nuôi Việt Nam, tr 21 10 Feng J.Y, Cheng L.H, Xiang F.Z, Shiy A.Q, Guo L.Z (2015), The Use of Lactic Acid Bacteria as a Probiotic in Swine Diets Pathogens 4(1): 34-45 11 Milagrosa S.P and E.T Balaki (1996), Influence of Bokashi organic fertilizer and Effective Microorganisms (EM) on growth and yield of field grown vegetables Benguet State University, La Trinidad, Benguet, Philippines 12 Natacha C Gosmez, Juan M.P Ramiro, Beatriz X.V Quecan, and Bernadette D.G de Melo Franco (2016) Use of Potential Probiotic Lactic Acid Bacteria (LAB) Biofilms for the Control of Listeria monocytogenes, Salmonella typhimurium, and Escherichia coli O157:H7 Biofilms Formation Front Microbiol; 7:863 13 Pavla P, Gabriela Z, Miroaslava K, Zybysek S, Tomas K, Jana G (2015), Effect of probiotics in the pig nutrition on the pathogenic bacteria counts in the gut Acta Univer 65 Agri Silicultu Mendelia Brunen LXI (6): 1839-1843 14 Shengfa F L and Martin N (2017), Using probiotics to improve swine gut health and nutrient utilization Animal Nutrition 3(4): 331-343 15 Zaheer Ahmed, Yanping Wang, Qiaoling Cheng and M Imran (2010.) Lactobacillus acidophilus bacteriocin, from production to their application: An overview African Journal of Biotechnology, Vol (20), pp 2843-2850 16 Barnett JA., Payne RW., Yarrow DY (1990), Yeasts: Characteristics and identification, Cambridge Univer Press 17 Bergey's Manual of Systematic Bacteriology (1984), Williams & Wilkins:158-168 18 Corcoran B, Stanton C, Fitzgerald G, Ross R (2005), Survival of probiotic lactobacilli in acidic environments is enhanced in the presence of metabolizable sugars Appli Environ Microbiol 71(6): 3060-3067 19 Czerucka D, Rampal P (2002), Experimental effects of Saccharomyces boulardii on diarrheal pathogens Microbes and infection 4:733-739 20 Kurtzman CP, Fell JW (1998), The Yeasts, a Taxonomic Study, 4th ed Elsevier Amsterdam 21 Lessard M, Brisson GJ (1987), Effect of a Lactobacillus fermentation product on growth, immune response and fecal enzyme activity in weaned pigs Can J Animal Sci 67 : 509-516 22 Moore T, Globa L, Barbaree J, Vodyanoy V, Sorokulova I (2013), Antagonistic activity Bacillus bacteria against food borne pathogens Prob Health 1:110 23 Patil AK, Kumar S, Verma AK, Baghel RPS (2015), Probiotic as Feed additives in weaned pigs: A review Livestock Research International (2): 31-39 24 Sambrook J, Russell DW (2001), Molecular clonning A laboratory manual, 3rd ed Cold spring harbor laboratory press, Cold spring habor, NewYork: 133-135 25 Sanders ME, Klaenhammers TR (2001), The scientific basis of Lactobacillus acidophilus NCFM functionality as a probiotic J Dairy Sci 84: 319-321 26 Ohashi Y, Ushida U (2009), Health-beneficial effects of probiotics: Its mode of action Animal Science J 80: 361-371 66 PHỤ LỤC I >1st_BASE_2000526_V1_IST1.ab1 NNAAAGGTTTCCGTCGGCGGCCTGCGGAGGATCATTAACGAGTTTTGACATGGGTTGTAGCTGG CCTCACGAGGCATGTGCACGCCCTGCTCATCCACTCTACACCTGTGCACTTACTGTAGGTTTGG CGTGGGCTTTCGGGGCCTTCACGGGCTTTGAGAGCATTCTGCCTGCCTATGTATCACTATAAAC ACTACGAAGTAACAGAATGTAATCGCGTCTAACGCATCTTAATACAACTTTCAGCAACGGATCT CTTGGCTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCA GTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACCTTGCGCTCCTTGGTATTCCGAGGAGCATGCCTGTTTG AGTGTCATGGTATTCTCAACCCACACATCCTTGTGATGCTTGTGAGGCTTGGACTTGGAGGCTT GCTGGCCCATCGCGGTCGGCTCCTCTTGAATGCATTAGCTTGGTTCCTTGCGGATCGGCTCTCA GTGTGATAATTGTCTACGCTGTGACCGTGAAGCGTTTGGCGAGCTTCTAACCGTCCTGCTAGGG ACAACTTACTTGACATCTGACCTCAAATCAGGTAGGACTACCCGCTGAACTTAAGCATATCAAT AAGCGGAGGAAAAGAAACTAACAAGGATTCCCCTAGTAACTGCGAGTGAAGCGGGAAAAGCTCA AATTTAAAATCTGGCGGTCTTTGGCCGTCCGAGTTGTAGTCTGGAGAAGCGTCTTCCGCGCTGG ACCGTGTCAAANTTCTCCCGGAN >1st_BASE_2259061_H9_27F GGGCCAATGGCGGCGTACTATCATGCAGTCGAGCGGACAGATGAGAGCTTGCTCCCTGATGTTAGCGGCGGACGGGT GAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATGGTTGTCTGA ACCGCATGGTTCAGACATAAAAGGTGGCTTCGGCTACCACTTACAGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGA GGTAACGGCTCACCAAGGCGACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCC AGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGAT GAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTGCCGTTCAAATAGGGCGGCACCTTGACGGTAC CTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATT GGGCGTAAAGGGCTCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAA CTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACAC CAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACC CTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTA AGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCA TGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAATCCTAGAGATAGGACGTCC CCTTCGGGGGCAGAATGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCATGTCCTGAAATGTTGGGTTAAGTCCCGCAAC GAGCCCAACCCTGGATCTTAGTTGCCAGCATTCAATTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAAGAAG GTGGGGATGACTTCAAATCTTCATGCCCCTTAAGAACTGGGGCTACCCACTTGCTACAATGGGACAGAACAAAGGGC CAGCAAACCCGCAAGGTTAAGCCAATTCCCAAAATCTGTTTCAAGTTCGGATCCAATGTCGGAACTCCACTGCTGGA AAATGGGAATCCATAAAATACCGAATACCAATGCCCCGGGGAAAAACTTTCCCGGGCTTTGAAACCACCCCGTTACC CACCGAAGTTTGTAACCCCACAGGGTGGGGGGGACCTTTTAAGGGGCCCCCCCTAATGGGTCAAATATGGGATAGGG GTTCAATTACGGATGTTCAACAATGATTTTCATTTCGCCTCACCACCAGCAACACAACACCCCAAAACAATCCAAGC AAACCAACACAACCACAACCACACTACACAACTAACATAGTACTCTAGCCCACACCCACACACGACAACCAGGCACC CCAGGATCATAACACCCCGCACAAGACCCGACAACCAAGACTAGATATTTTGAGACCAAATTGCCGGTACACCAACC CAAAATTAGCTCTAGAGTCCTGGCAGACCATAACAGACC >1st_BASE_2259061_AH3_27F GGTCAGAGAGCTTGCTCTCGGGTGACGAGTGGCGGACGGGTGAGTAATGTCTGGGAAACTGCCC GATGGAGGGGGATAACTACTGGAAACGGTAGCTAATACCGCATAATGTCGCAAGACCAAAGAGG GGGACCTTCGGGCCTCTTGCCATCGGATGTGCCCAGATGGGATTAGCTAGTAGGTGGGGTAACG GCTCACCTAGGCGACGATCCCTAGCTGGTCTGAGAGGATGACCAGCCACACTGGAACTGAGACA CGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGCCTGATGCA GCCATGCCGCGTGTATGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGTACTTTCAGCGAGGAGGAAGGCGT TGTGGTTAATAACCACAGCGATTGACGTTACTCGCAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAG CAGCCGCGGTAATACGGAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCACGCAGG CGGTCTGTCAAGTCGGATGTGAAATCCTCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATCCGAAACTGGCAG GCTAGAGTCTTGTAGAGGGGGGTAGAATTCCAGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATCTGGAG GAATACCGGTGGCGAAGGCGGCCCCCTGGACAAAGACTGACGCTCAGGTGCGAAAGCGTGGGGA GCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGTCGACTTGGAGGTTGTGCCC TTGAGGCGTGGCTTCTGGAGCTAACGCGTTAAGTCGACCGCCTGGGGGAGTACTGCCGCAAGAT 67 TAAAACTCTAATGAATTTGACGGCGGGCCCGCACAAGAGGTGGAGCATGTGGGTTTATTCTATG CTACTCGAGAACATATCTACTCTTGTCGTCATAGAAATACTAGAGATGCTTTCGTTGCTGCATG ACTATCAACAGAAGGTGCTTGCATGCTTCAGTCGTGCTGTGTAGTGATTTGTTGGTTAAGTACG AACCCAGCCGTACTCTTTCTTGTGTGCTCGGTCTGGTCTGGAACTGAGTGGCAGTGCTACCTCA CACAGGAGAGGTGGGGTCACTCATCAAGTCTTGCCCCTCAGATATGAGTCATCATGCTCATCGA GTTCAGGCGACGCGCCTGAGCGCGAGCACATAAAAGGTTGACCGTGATGATTCCCACTCGTGGA GTACGAGATTAACCGGACACGCAAGAGTGCGTCGTAACTCGTAAAAA >1st_BASE_2259060_H11_27F TGGCAGTGCGCGAGCTATAATGCAGTCGAGCGGACAGATGGGAGCTTGCTCCCTGATGTTAGCGGCGGACGGGTGAG TAACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATGGTTGTCTGAACC GCATGGTTCAGACATAAAAGGTGGCTTCGGCTACCACTTACAGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGT AACGGCTCACCAAGGCGACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGA CTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAA GGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTGCCGTTCAAATAGGGCGGCACCTTGACGGTACCTA ACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGG CGTAAAGGGCTCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTG GGGAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAG TGGCGAAGGCGACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTG GTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGC ACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGT GGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAATCCTAGAGATAGGACGTCCCCT TCGGGGGCAAAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCCTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAG CGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCAGCATTCATTTGGGCCTTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGAAGAAAGGTG GGGATAACCTCAAATCATCAGGCCCCTTATGACCTGGGCTACACCGTGGCTACATGGGACAGAACAAAGGTCACCGA ATCCCGCGGGGTTAAGCCAATTCCCATAATCTGTTTCCAGTTCGGATCCGACTTCGAACTCTACTGCTGGAACTTGA ATCCCTAAAAACCGGAAACAACTCCCCGGGTAAAACTATCCCGGCCTTGTAAACCGCGCCCTTAACCCCAAGATTTT GACCCCCGAATCCGGGAGCACTTTTGAGCGCTCCCATACGGGCAAATAGGGAAAGGTTTTTACAAGCGGATACACTG CATTCCACCCCTATCCTCCCACCCAAACATCTCACCCCAACCCCCTTCACCCCCTAAACTTTACAAACTCACCCTCA CCCCTAAACCCTCTTCAAACACCTTCCACCCCACATCACAATAACCCCCATTACAACACAACCACCTTCACAATCAC CCAACCCACACTATATCCATTCACACCCTCAACCTCGATATTTAAGACTTCCATCAAGTGTGGTTGACCCGTCCTCA CTATGAACTACCACCATTAACCGGTCAGAGCGACGTCCCGTGTTCTTATACGTCGTCAATCTCTCTAAAGTCCCCGA ATCTCCTCAAATCCGCCACAGTGTCACAACAACTTAACACGTCTCCCCTAATTTGTCCGGAA >1st_BASE_2259060_AH4_27F ACAACTTGAACGTATTCCCGACGTGCATGCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCAGCTTCACGC AGTCGAGTTGCAGACTGCGATCCGAACTGAGAACAGATTTGTGGGATTGGCTTAACCTCGCGGT TTCGCTGCCCTTTGTTCTGTCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGGTCATAAGGGGCATGATGA TTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCACCTTAGAGTGCCCAACTGAA TGCTGGCAACTAAGATCAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGA GCTGACGACAACCATGCACCACCTGTCACTCTGCCCCCGAAGGGGACGTCCTATCTCTAGGATT GTCAGAGGATGTCAAGACCTGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCTTCGAATTAAACCACATGCTCCAC CGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTCAGTCTTGCGACCGTACTCCCCAGGCGGA GTGCTTAATGCGTTAGCTGCAGCACTAAGGGGCGGAAACCCCCTAACACTTAGCACTCATCGTT TACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTCGCTCCCCACGCTTTCGCTCCTCAGCGTCA GTTACAGACCAGAGAGTCGCCTTCGCCACTGGTGTTCCTCCACATCTCTACGCATTTCACCGCT ACACGTGGAATTCCACTCTCCTCTTCTGCACTCAAGTTCCCCAGTTTCCAATGACCCTCCCCGG TTGAGCCGGGGGCTTTCACATCAGACTTAAGAAACCGCCTGCGAGCCCTTTACGCCCAATAATT CCGGACAACGCTTGCCACCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGTGGCTTTCT GGTTAGGTACCGTCAAGGTACCGCCCTATTCGAACGGTACTTGTTCTTCCCTAACAACAGAGCT TTACGATTGCGAAAACCTTCATCACTGACGCGGCGTTGCTCCGTCAGACTTTCGTCCATTGCGG AAGATTCCCTACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGGCGTGTCTCAGTCCCATGTGGCGATCACC CTCTCAAGGTCGGCTACGCGTCGTAGCTTGGTGAAGCGTGACGTCACAACTAGCTAATGCGCGC GGGTCATCTGGAGTGGTAGCGAAGCAACTATATGATAGATCAGGCGGATCAACGAGATCAGAAT ACCCAGATTCTCGATTTGCCAAGCTTACTGCCAGTACCAGGGGAGAACGCGATCGCCGATAACT CAGGGAAACAGTCCGGGTGAAAGTCCTGGTGTTTAACCCACCCCCAGAAAAACAGGGT 68 ... chế phẩm vi sinh vật bổ sung vào thức ăn chăn nuôi lợn giúp giảm thiểu ô nhiễm môi trường chất thải? ?? với định hướng góp phần đưa số giải pháp công nghệ để sản xuất chế phẩm chứa vi sinh có ích,... công nghiệp nước ta, hạn chế nhập Mục tiêu đề tài: - Sản xuất chế phẩm vi sinh vật (dạng bột) có tác dụng giảm mùi thối mức độ ô nhiễm chất thải - Thử nghiệm bổ sung chế phẩm vào thức ăn chăn. .. vô cơ, vi sinh vật gây bệnh có mùi Đặc thù chất thải chăn nuôi lợn chất thải rắn, lỏng trộn lẫn nên khó thu gom xử lý triệt để Do vậy, giảm bớt mức độ ô nhiễm chất thải trước chúng phát tán môi