Bước đầu nghiên cứu thủy phân rong lục (ulva lactuca) tại vịnh nha trang bằng bacillus subtilis và aspergillus oryzae bổ sung vào thức ăn chăn nuôi

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM BỘ MÔN CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU THỦY PHÂN RONG LỤC (ULVA LACTUCA) TẠI VỊNH NHA TRANG BẰNG BACILLUS SUBTILIS VÀ ASPERGILLUS ORYZAE BỔ SUNG VÀO THỨC ĂN CHĂN NI GVHD: TS Thái Văn Đức SVTH: Trương Văn Đơng MSSV: 56130833 Khánh Hòa, tháng 7/2018 TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG Khoa/viện: Công nghệ thực phẩm PHIẾU THEO DÕI TIẾN ĐỘ VÀ ĐÁNH GIÁ ĐỀ TÀI / KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP (Dùng cho CBHD nộp báo cáo ĐA/KLTN sinh viên) Tên đề tài: Bước đầu nghiên cứu thủy phân rong lục (ulva lactuca) vịnh nha trang Bacillus subtilis Aspergillus oryzae bổ sung vào thức ăn chăn nuôi Giảng viên hướng dẫn:TS Thái Văn Đức Sinh viên hướng dẫn: Trương Văn Đông MSSV: 56130833 Ngành: Cơng nghệ thực phẩm Khóa:2014-2018 Lần KT Ngày Ngày kiềm tra: …………… ……… 10 11 12 Nội dung Nhận xét GVHD Kiểm tra tiến độ Trưởng BM Đánh giá công việc hồn thành:……%: Được tiếp tục:Khơng tiếp tục: Ký tên ………………………… Nhận xét chung (sau sinh viên hoàn thành ĐA/KL): …………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………….……… …………………………………………………………………………………………….… Điểm hình thức:……/10 Điểm nội dung: ./10 Điểm tổng kết:………/10 Đồng ý cho sinh viên: Được bảo vệ: Khơng bảo vệ: Khánh Hịa, ngày…….tháng…….năm……… Cán hướng dẫn (Ký ghi rõ họ tên) TS: THÁI VĂN ĐỨC LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng tơi Các số liệu kết nêu đồ án trung thực chưa công bố cơng trình khác Sinh viên Trương Văn Đơng LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành đồ án này, trước hết em xin gửi tới Ban Giám hiệu Ban Chủ nhiệm Khoa Cơng nghệ Thực phẩm kính trọng, niềm tự hào học tập nghiên cứu Trường năm qua Sự biết ơn sâu sắc em xin dành cho thầy Thái Văn Đức cô Nguyễn Thị Thanh Hải tận tình hướng dẫn động viên em suốt trình thực đồ án Xin cám ơn cán Phòng Nghiên cứu Viện Công nghệ Sinh học Thực phẩm - Trường Đại học Nha Trang tận tình giúp đỡ tạo điều kiện cho em suốt thời gian thực đồ án vừa qua Đặc biệt, xin ghi nhớ tình cảm, giúp đỡ, động viên gia đình bạn bè ln ln chia sẻ em trình nghiên cứu Trong trình làm đề tài, em cố gắng hết sức hạn chế kiến thức thân thời gian nên khơng tránh khỏi có sai sót Về phần mình, em xin hứa hết sức cố gắng mang kiến thức học để vận dụng vào thực tế góp phần cơng sức nhỏ bé vào cơng xây dựng đổi ngành công nghệ thực phẩm nước nhà Em xin chân thành cảm ơn! Nha Trang, ngày 05 tháng năm 2018 Tác giả đồ án MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN iii DẠNH MỤC SƠ ĐỒ ix MỞ ĐẦU 1 Đặt vấn đề Ý nghĩa thực tiễn, mục đích phạm vi ứng dụng 2.1 Ý nghĩa thực tiễn 2.2 Mục đích đề tài 2.3 Phạm vi ứng dụng CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu chung về rong lục 1.2 Chủng Bacillus subtilis Aspergillus oryzae 1.2.1 Bacillus subtilis 1.2.2 Aspergillus oryzae 1.3 Tổng quan về Cellulose 1.4 Enzym Cellulase 11 1.4.1 Định nghĩa phân loại 11 1.4.2 Tính chất 13 1.4.3 Cơ chế thủy phân cellulose 13 1.4.4 Cơ chế tác dụng cellulase 14 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16 2.1 Đối tượng nghiên cứu 16 2.1.1 Rong lục (Ulva lactuca ) 16 2.2 Phương pháp nghiên cứu 17 2.3 Bố trí thí nghiệm tổng quát 20 2.4 Phương pháp xử lý số liệu 34 Chương III KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 35 3.1 Kiểm tra khả sinh hoạt tính cenlulase 35 3.2 Kết khảo sát ảnh hưởng nồng độ NaCl đến khả thủy phân 36 3.3 Khảo sát thành phần dinh dưỡng rong lục nguyên liệu 37 3.4 Xác định khả thủy phân vsv rong lục 38 3.5 Kết thăm dò vùng ảnh hưởng yếu tố ảnh hưởng q trình thủy phân 39 3.5.1 Kết khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ 39 3.5.2 Kết thí nghiệm khảo sát thời gian thủy phân 41 3.4 Tối ưu hóa q trình thủy phân 42 Model Terms 44 ANOVA for Quadratic model 44 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 53 TÀI LIỆU THAM KHẢO 54 DANH MỤC PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT AOAC CMC DNS K-Na TCVN TCN Nxb STT VSV Association of Official Analytical Chemists Carbonyl-methyl cellulose Dinitrosalicylic axit Potassium sodium tartrate tetrahydrate Tiêu chuẩn Việt Nam Tiêu chuẩn ngành Nhà xuất Số thứ tự Vi sinh vật DANH MỤC BẢNG BẢNG KẾT QUẢ ĐO VÒNG PHÂN GIẢI CELLULOSE 36 BẢNG THÀNH PHẦN DINH DƯỠNG CƠ BẢN CỦA RONG LỤC ULVA LACTUCA 37 BẢNG 3.3 KẾT QUẢ THÍ NGHIỆM CỦA MƠ HÌNH BOX-BEHNKEN 43 BẢNG 3.4 CÁC ĐIỂM TIÊN ĐOÁN DO PHẦN MỀM DX6 51 BẢNG 3.5 KẾT QUẢ KIỂM TRA THỰC NGHIỆM ĐIỂM TIÊN ĐOÁN 51 DANH MỤC HÌNH HÌNH 1 VI KHUẨN B.SUBTILIS DƯỚI KÍNH HIỂN VI HÌNH HÌNH VẼ SỢI NẤM A.ORYZAE HÌNH CẤU TRÚC CELLULOSE VÀ MẠNG LƯỚI LIÊN KẾT HYDROGEN HÌNH SỰ SẮP XẾP CÁC CHUỖI CELLULOSE TRONG THÀNH TẾ BÀO THỰC VẬT 10 HÌNH CƠ CHẾ TÁC ĐỘNG CỦA ENZYM CELLULASE 14 HÌNH CƠ CHẾ THỦY PHÂN CELLULOSE 15 HÌNH RONG LỤC ULVA LACTUC 16 HÌNH 2 KHUẨN LẠC B.SUBTILIS 16 HÌNH KHUẨN LẠC CỦA A.ORYZAE 17 HÌNH SỰ TẠO PHỨC MÀU CỦA THUỐC THỬ 23 HÌNH TỐI ƯU QUÁ TRÌNH THỦY PHÂN 29 HÌNH KHUẨN LẠC VÀ VÒNG PHÂN GIẢI CELLULOSE CỦA B.SUBTILIS 35 HÌNH KHUẨN LẠC VÀ VỊNG PHÂN GIẢI CELLULOSE CỦA A.ORYASE 35 DẠNH MỤC SƠ ĐỒ SƠ ĐỒ SƠ ĐỒ TỔNG QUAN THỦY PHÂN RONG LỤC 20 SƠ ĐỒ 2 ĐƯỜNG CHUẨN GLUCOSE 24 SƠ ĐỒ BỐ TRÍ THÍ NGHIỆM KHẢO SÁT SỰ ẢNH HƯỞNG CỦA NỒNG ĐỘ NACL ĐẾN KHẢ NĂNG THỦY PHÂN CỦA VSV 27 SƠ ĐỒ XÁC ĐỊNH KHẢ NĂNG THỦY PHÂN CỦA VSV TRÊN RONG LỤC 29 SƠ ĐỒ KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA NHIỆT ĐỘ ĐẾN QUÁ TRÌNH THỦY PHÂN RONG LỤC 30 SƠ ĐỒ KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA THỜI GIAN TỚI QUÁ TRÌNH THỦY PHÂN RONG LỤC 31 Từ phân tích cho phép chọn thông số tối ưu cho hoạt động thủy phân bã rong sau sản xuất agar: nhiệt độ thích hợp 330C, pH 6, thời gian thủy phân thích hợp 109 giờ, mật độ hỗn hợp vsv so với chất 4,2.106 CFU/g 52 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 1.Kết luận Từ thí nghiệm nghiên cứu cho phép rút số kết luận sau: 1) Kết đánh giá rong lục nguyên liệu thu lượm gành đỏ biển Hòn Chồng Nha Trang có số thành phần sau: hàm lượng protein 34,5 mg/g, hàm lượng cellulose 80mg/g, hàm lượng tro 200,5 mg/g 2) Đánh giá, nghiên cứu khả sinh enzyme cellulase hai chủng vsv B.subtilis A.oryzae sưu tập giống vsv PTN Vi sinh – Trung tâm Thực hành, Trường ĐH Nha Trang Kết luận hai chủng vsv hoàn toàn phù hợp sử dụng đồ án bước đầu thủy phân rong lục 3) Xác định điều kiện tối ưu cho trình thủy phân Ulva Lactuca: Thời gian 109 giờ, nhiệt độ 33℃, số vsv đưa vào 2.1x106 CFU B.Subtilis 2.1x106CFU A.Oryzae 1g rong nguyên liệu xay, lượng đường khử tạo 1,98 mg/g Sản phẩm thủy phân hỗn hợp dịch gần đồng có hàm lượng protein 34,5mg/g Kiến nghị Từ nghiên cứu sơ cho phép đề xuất kiến nghị: 1) Nghiên cứu ứng dụng giá trị dinh dưỡng cụ thể rong Ulva lactuca thủy phân vào thức ăn chăn ni, đa dạng hóa tính ứng dụng rong lục Ulva Lactuca đời sống 2) Ứng dụng kết hợp đồng thời hai chủng vsv B.Subtilis A.Oryzae vào thủy phân đối tượng nguyên liệu khác 53 TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT Bộ y tế (1979), "Vi khuẩn vi rút ký sinh trùng" Lê Ngọc Tú Các tác giả (1997), Hố sinh học cơng nghiệp, Nxb Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội Khoa Công nghệ Sinh học, Đại học Nông nghiệp (2014), Khảo sát thành phần vi sinh đặc tính probiotic sản phẩm men tiêu hóa thị trường, Tạp chí khoa học phát triển, Hà Nội Lê Ngọc Tú, La Văn Chứ, Phạm Trân Châu, Nguyễn Lân Dũng, (1982), Enzyme vsv, Nxb Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội Lương Đức Phẩm (2004), Công nghệ vsv, Nxb Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội Nguyễn Đức Lượng ((2001)), Công nghệ sinh học, Nxb Đại học Quốc gia, Tp HCM Nguyễn Đức Lượng, Phan Thị Huyền, Nguyễn Ánh Tuyết (2003), Thí Nghiệm Cơng nghệ Sinh học, Tp HCM, Nxb Đại học Quốc gia Nguyễn Hoàng Anh, Nguyễn Thị Thanh Thủy, Nguyễn Vĩnh Hoàng (2017), PHÂN lập, tuyển chọn vi khuẩn bacillus spp từ cỏ bị có khả sinh enzyme βglucanase bước đầu xác định đặc tính enzyme, Tạp chí Khoa học Nơng nghiệp Việt Nam 2017 Nguyễn Hữu Đại (1997), "Rong Mơ (Sargassaceae) Việt Nam nguồn lợi sử dụng", NXB Nông nghiệp TP Hồ Chí Minh 10 Nguyễn Hữu Qn (2009), Tuyển chọn,ni Cấy chủng A.Oryzae sinh tỏng hợp sinh endo-b-1,4glucanase xác định hoạt tính hóa học nó, Hà Nội Nguyễn Lân Dũng, Phạm Văn Ty (1979), Vsv học tập 1, Hà Nội Nguyễn Tiến Thắng, Ngô Kế Sương, Trần Hạnh Phúc, Võ Hồng Nhân, (1994), Công nghệ sinh học số ứng dụng Việt Nam, Nxb Nông nghiệp Nguyễn Trọng Cẩn, Nguyễn Thị Hiền, Đỗ Thị Giang, Trần Thị Luyến, ((1997),), Công nghệ enzyme,, Nxb Nông nghiệp,, Hà Nội Phạm Thị Ánh Hồng ((2003)), Kỹ thuật sinh hóa, Nxb Đại học quốc gia TP HCM Trần Non Nước, Võ Văn Song Toàn, Dương Thị Hương Giang Trần Nhân Dũng, (2012), tuyển chọn tối ưu hóa vi khuẩn kỵ khí sinh tổng hợp enzyme cellulase chất bột giấy, Tạp chí Khoa học 2012:22b 43-53 11 13 14 15 16 17 Trần Thị Luyến, Đỗ Minh Phụng, Nguyễn Anh Tuấn, Ngô Đăng Nghĩa (2004), Chế biến rong biển, Nxb Nông Nghiệp, Tp HCM 54 TÀI LIỆU TIẾNG ANH 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 Adegunloye D V., Adetuyi F C., Akinyosoye F A., Doyeni M O., (2007), "Microbial analysis of compost using cowdung as booster", Microbial analysis of compost using cowdung as booster, Pak J Nut , tr 506 – 510 Alef K., Nannipieri P (1995), "Enzymee activities", Methods in Applied Soil Microbiology and Biochemistry, tr 311-373 Fields, M W., J B Russell and D B Wilson (1998), "The role of ruminal carboxymethylcellulases in the degradation of β-glucans from cereal grain", FEMS Microbiol Ecol 27, tr 261–268 Gupta, V.K., M.P.S Bakshi, and P.N Langar (1987), Microbiological Changes During Natural Fermentation of Urea-wheat Straw, Biological Wastes 21 L M Robson and G H Chambliss, J Bacteriol (1986), "Chem., Biol", tr 165, 612 L.H, Fan L.T and Lee (1983), "Kinetic studies of enzymatic hydrolysis of insoluble cellulose, a mechannistic kinetic model Biotech", Bioeng (15), tr 2707-2733 Lahaye, M Robic, A (2007), Structure and Functional Properties of Ulvan Le Van Viet Man, Tran Thi Anh Tuyet (2006), characterization of protease from aspergillus oryzaesurface culture and application in fish sauce processing, tạp chí phát triển kh&cn, Lingchong Wang, Xiangyu Wang, Hao Wu and Rui Liu (2014), "Overview on Biological Activities and Molecular Characteristics of Sulfated Polysaccharides from Marine Green Algae in Recent Years ", Mar Drugs M.M, Gascoigne J and Gascoigne (1960), "Biological degradation of cellulose", Butterwozch and Co.Limited,, London, tr 17-21 Ole Rasmussen, Olave Jansen, Đỗ Văn Khương, Nguyễn Văn Thục (2001), Seaweed processing and market for Viet Nam, Report for SUMA programe R M Mackay, A Lo, G Willick, M Zuker, S Baird, M Dove, F Moranelli and V Seligy, (1986), Nucleic Acids Res R.D, Guerrero (1980), "Studies on the feeding of Tilapia nilotica in floating cages", Aquaculture 20, tr 169-175 Reese E.T., and Siu R.G.H (1950), "Giological degration of solube cellulose derities", Biotech J., (59, tr 485 Uhlig, Helmul (1998), Ph D Industrial enzym and theor applications, John Wiley and Sons, inc New York Y Koide, A Nakamura, T Uozumi and T Beppu, (1986), Agric Biol AOAC International ().16th edition, Gaithersburg (1996), Official Methods of Analysis of the Association of Official Analytical Chemists, USA, AOAC Internationa 55 MỘT SỐ TRANG WEB VÀ TÀI LIỆU MẠNG 35 36 37 38 39 40 Đỗ Thị Ngọc Huyền, Nguyễn Ngọc Huyền, Nguyễn Thuỳ Châu, Trương Hải Nam , (2005), Tuyển chọn chủng vi khuẩn Bacillus subtilis sinh phytaza cao cho sản xuất enzym chăn nuôi, TC Nông nghiệp phát triển nông thôn Đường Hồng Dật, Nguyễn Lân Dũng (1979), Giáo trình vsv học trồng trọt: dùng trường đại học nông nghiệp Hà Nội, Nông nghiệp thalgovietnam ulva lactuca, truy cập ngày, trang web http://www.thalgovietnam.vn/cac-loai-tao/u/64-ulva-lactuca.html Thu, Quách Thị Minh (2017), Nghiên cứu cấu trúc Ulvan có hoạt tính sinh học từ rong lục Ulvan lactuca Ulvan reticulata, Luận án tiến sỹ, Hà Nội Tường, Đinh Mạnh (2001), "Chương chương 8", Cấu trúc liệu & Thuật toán, Nhà xuất khoa học kỹ thuật, Hà nội, tr Chương wikipedia Aspergillus oryzae, truy cập ngày, trang web https://en.wikipedia.org/wiki/Aspergillus_oryzae 56 DANH MỤC PHỤ LỤC PHỤ LỤC 1: MỘT SỐ KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU PHỤ LỤC 2: MỘT SỐ HÓA CHẤT ĐƯỢC SỬ DỤNG TRONG ĐỒ ÁN PHỤ LỤC 3: MỘT SỐ HÌNH ẢNH THIẾT BỊ DÙNG TRONG ĐỒ ÁN PHỤ LỤC MỘT SỐ KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1 Bảng kết khảo sát thủy phân hỗn hợp vsv vsv riêng lẻ Kết xác định trung bình cộng ba mẫu rong có điều kiện thí nghiệm nhau, số liệu đây: 3.2 Bảng đo lượng đường khử sinh khảo sát nhiệt độ thủy phân Nhiệt độ (℃ ) 25 30 35 40 45 50 Mẫu 1.029 1.359 1.329 1.220 0.942 0.873 Mẫu 0.997 1.328 1.328 1.233 0.930 0.856 Mẫu 1.034 1.034 1.034 1.034 1.034 1.034 Kết trung bình : Nhiệt độ (℃) Lượng đường khử tạo thành (mg/g) 25 1.020 30 1.354 35 1.356 40 1.228 45 0.934 50 0.876 3.2 Bảng kết thí nghiệm thực tế khảo sát ảnh hưởng NaCl đến khả thủy phân 3.3 Số liệu thí nghiệm khảo sát mật độ vsv tới khả thủy phân Số liệu đo mốc thời gian 24, 48, 72, 96 120 với mật độ 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, triệu CFU 1g rong nguyên liệu Số liệu thu nhận từ ba lần đo lập lại, mẫu có điều kiện thí nghiệm, lấy kết trung bình làm trịn đến số thập phân thứ hai để vẽ biểu đồ so sánh trực quan chương Số liệu thể bảng sau: Giá trị trung bình lần đo lặp lại: 3.4 Bảng kết thí nghiệm khảo sát thời gian thủy phân Ba mẫu rong lục có điều kiện thí nghiệm giống Các mẫu rong lục đo lượng đường khử (mg/g) mốc thời gian 24, 48, 72, 96, 120 144 Kết trình bày bảng đây: 1,980 1,979 1,980 1,973 1,974 1,988 1,989 Kết tính trung bình cộng ba mẫu thí nghiệm đo mốc thời gian: 3.6 Hình ảnh cảm quan cho B.Subtilis A.Oryzae vào thủy phân rong lục *Cảm quan: Rong thí nghiệm rong không xay nhuyễn mà để ngun tản Mục đích nhìn rõ biến đổi tảng rong Sau thời gian 110 giờ, nhiệt độ 33℃, với 2ml dịch chứa vsv Mẫu rong có trạng thái mềm nhũn, rong mềm, bóp nhẹ rong nát, màu vàng lục, mùi rong Rong trước cho vi sinh Rong sau cho vi sinh PHỤ LỤC MỘT SỐ HÓA CHẤT ĐƯỢC SỬ DỤNG TRONG ĐỒ ÁN (Thành phần cách pha) 1.Cách pha thuốc thử Lugol: Thuốc thử Lugol: Hòa tan 2,5g KI 20ml nước cất, thêm 1g iod,khuấy máy khuấy từ cho tan hết, thêm nước cất đến 100ml Bảo quản lọ tối màu 2.Cách pha dung dịch đệm axetat Hoà tan 250g amoni acetat (TT) 15 g dinatri edetat (TT) 400 ml nước thêm 125 ml acid acetic băng (TT) Chuẩn độ pH lại HCl 10% Na,OH 10% 3.Môi trường DG18 *Thành phần (g/l): Peptone…………………………5 Dextrose……………………… 10 Monopotassium phosphate…… Magnesium sulfate.7H2O………0.5 Dicloran……………………… 0.002 Chloramphenicol……………… 0.1 Agar…………………………… 15 Final pH 5,6 ±0.2 at 25℃ *Cách pha:31.7g lít nước, bao gói hấp tiệt trùng 121℃ vịng 15 phút Mơi trường LB *Thành phần(g/l): Peptone…………………………5 Meat extract…………………….3 Lactose………………………….5 *Cách pha:13g lít nước bao gói hấp tiệt trùng 121℃ vịng 15 phút Môi trường Czapek Dox Agar *Thành phần(g/l): Sucrose……………………….30 Sodium Nitrate……………….2 Dipotassium Sulphate……… Magnesium Sulphate…………0.5 Potassium Chloride………… 0.5 Ferrous Sulphate…………… 0.01 Agar………………………… 15 Final pH(at 25℃) 7.3±0.2 6.Agar PHỤ LỤC MỘT SỐ HÌNH ẢNH THIẾT BỊ DÙNG TRONG ĐỒ ÁN Máy ly tâm lạnh Máy đo quang DR5000 Tủ ấm 40 Tủ ấm 32.5℃ Máy đo pH Cân phân tích số Bình hút ẩm Tủ cấy Máy khuấy từ kết hợp gia nhiệt Máy lắc 10 ... trên, tiến hành nghiên cứu đồ án : ? ?Bước đầu thủy phân rong lục (ulva lactuca) vịnh nha trang Bacillus subtilis Aspergillus oryzae bổ sung vào thức ăn chăn ni” có ý nghĩa thực tiễn việc nâng... thủy phân rong lục (ulva lactuca) vịnh nha trang Bacillus subtilis Aspergillus oryzae bổ sung vào thức ăn chăn nuôi Giảng viên hướng dẫn:TS Thái Văn Đức Sinh viên hướng dẫn: Trương Văn Đơng MSSV:... phẩm thủy phân rong lục Sản phẩm thủy phân rong lục có hàm lượng đường khử lớn Phù hợp để bổ sung vào thức ăn chăn ni 2.4 Bố trí thí nghiệm 2.4.1 Thí nghiệm kiểm tra khả sinh cellulase thủy phân