CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Phương pháp xác định thành phần hóa học của rong
Phân tích độ ẩm, hàm lượng tro, protein thô, carbohydrate theo phương pháp của Hiệp hội phân tích Mỹ AOAC [34], theo TCVN và tiêu chuẩn ngành TCN:
a) Hàm lượng tro:
- Nguyên tắc của phương pháp xác định hàm lượng tro: Mẫu được nung ở nhiệt độ 550ºC- 600°C để nung cháy hoàn toàn các chất hữu cơ, đem cân phần tro của mẫu sau khi nung và tính ra phần trăm tro có trong mẫu.
- Tiến hành thí nghiệm: Nung chén sứ đã rửa sạch ở lò nung 550º – 600°C đến khối lượng không đổi. Để nguội ở bình hút ẩm và cân ở cân phân tích chính xác đến 0,0001g. Cho vào chén sứ khoảng 5g mẫu. Cân tất cả ở cân phân tích với độ chính xác như trên, cho tất cả vào lò nung và nâng nhiệt độ từ từ cho đến 550ºC – 600°C. Nung cho đến tro trắng, nghĩa là đã loại hết các chất hữu cơ, thường khoảng 6 - 7 giờ. Trường hợp còn tro đen, lấy ra để nguội, cho thêm vài giọt H2O2 hoặc HNO3 đậm đặc và nung lại đến tro trắng.
Để nguội trong bình hút ẩm và cân đến độ chính xác như trên. Tiếp tục nung thêm ở nhiệt độ như trên trong 30 phút rồi để nguội trong bình hút ẩm và cân cho đến khối lượng không đổi.
Hình 2. 3. Khuẩn lạc của A.oryzae
18
-Tính toán kết quả: Hàm lượng tro theo % được tính theo công thức:
X = ((G2 - G)/(G1 - G)) × 100 Trong đó G: khối lượng chén (g)
G1: khối lượng chén và mẫu trước khi nung (g) G2: khối lượng chén và mẫu sau khi nung (g)
b) Protein thô:
Lượng nitơ có trong mẫu được xác định bằng phương pháp micro-Kjeldahl, được tiến hành như sau: Cân khoảng 2g mẫu rong khô, cho vào bình cầu 100ml, cho thêm vào 30ml dung dịch H2SO4 đậm đặc, tiếp theo 10g K2SO4 và 1g CuSO4.5H2O. Hỗn hợp này được đun nhẹ cho đến khi hết sủi bọt thì đun tăng mạnh nhiệt độ lên. Khi dung dịch chuyển thành không màu hoặc trong suốt, tiếp tục đun thêm 1 giờ nữa, để nguội, pha loãng với nước cất và chuyển vào bình Kjeldahl 800ml. Thêm vào 100ml dung dịch NaOH 40%, lắp bình với hệ thống chưng cất, bình hứng có 25 ml dung dịch H2SO4
0,1N và tiến hành chưng cất. Khi hai phần ba lượng chất lỏng đã được cất, kiểm tra xem phản ứng đã xảy ra hoàn toàn chưa. Bình hứng được lấy ra chuẩn độ với dung dịch KOH 0,1N. Khi đó, lượng protein thô được tính theo công thức sau:
Protein = Nitơ x 6,25
c) Hàm lượng lipid: (TCVN 4331:2001(ISO 6492:1999) )
Cân 20g mẫu kèm 10g natri sunfat khan cho vào cốc lọc. Đưa vào trụ triết của bộ Soxhlet, thêm dung môi dietyl ete gần đến vạch chảy tràn, ngâm qua đêm. Sau 24h thêm dung môi cho trụ triết,qua mức chảy tràn chảy về lại bình cầu. Bình cầu được nung nóng, dung môi bay hơi mà lipid không bay hơi. Dung môi bay hơi gặp ống sinh hàn, rớt xuống trụ triết. Quá trình triết diễn ra, quá trình diễn ra 5 lần khoản 1 giờ đồng hồ.
Lượt cuối cùng dừng lại lúc dung môi trong trục triết gần đến mức chảy tràn. Lấy bình cầu, làm nút bông để vào tủ sấy ở nhiệt độ 103℃ trong 10 phút. Chuyển vào bình hút ẩm, cân sự thay đổi khối lượng của bình cầu để tìm khối lượng lipid trong 20g rong tươi.
19 d) Phân tích tổng cellulose
Cân chính xác 1-2 gam rong cho vào bình tam giác 200ml dung dịch NaOH 0,5%, lắp vào ống sinh hàn đun hoàn lưu trong 30 phút kể từ lúc sôi. Chú ý đừng để bọt trào lên.
Lọc qua giấy lọc đã biết trọng lượng hoặc ly tâm. Rửa cặn còn lại với dung dịch NaOH 0,5% nóng. Tiếp tục cho cặn tác dụng với 10ml HCl 10%. Thêm vào đó 10ml dung dịch natri hypochlorite từng giọt một, vừa cho vừa khuấy đều. Để yên trong 5 phút rồi lọc qua giấy lọc đã biết trọng lượng hoặc ly tâm. Cho cặn lại tiếp tục tác dụng trở lại với NaOH 0,5% ở nhiệt độ 40℃. Để yên vài phút và ly tâm. Làm như thế 1-2 lần nữa để có cellulose thật trắng. Sau cùng rửa sạch thật kỹ bằng nước sôi. Sấy khô và cân.
𝑿 = 𝒂
𝒎𝒙 𝟏𝟎𝟎 Trong đó: a là trọng lượng cellulose
m là khối lượng mẫu
e) Phân tích hàm lượng nước : Tiêu chuẩn ngành 10TCN 842:2006 về tiêu chuẩn rau quả
2.2.1. Phương pháp đếm khuẩn lạc trên môi trường thạch dinh dưỡng
Phương pháp đếm khuẩn lạc là phương pháp đếm số khuẩn lạc có trên bề mặt thạch dinh dưỡng dùng để nuôi cấy vsv. Từ số khuẩn lạc đếm được và hệ số pha loãng, ta tính số vsv có trong một đơn vị thể tích dịch chứa vsv. Đơn vị là CFU/ml với mẫu lỏng và CFU/g với mẫu rắn.
2.2.2. Phương pháp cấy chấm điểm
Phương pháp cấy chấm điểm là phương pháp cấy sinh khối vsv thành một chấm điểm trên môi trường thạch dinh dưỡng, vsv sẽ hấp thu dinh dưỡng từ môi trường thạch để tạo thành các sản phẩm chuyển hóa. Vsv sẽ phát triển và ăn lang ra xung quanh điểm cấy và tạo thành các chất chuyển hóa. Trong đồ án này, sản phẩm chuyển hóa là đường khử. Môi trường dinh dưỡng có chứa cơ chất CMC sẽ bắt mầu thuốc thử Lugol còn
20
đường khử thì không. Qua bề rộng của vòng không bắt màu ta biết được khả năng phân giải cơ chất được bổ sung vào môi trường thạch dinh dương, trong đồ án này cơ chất bổ sung là cơ chất CMC. Ủ ở nhiệt độ và thời gian phù hợp.