Bố trí thí nghiệm tổng quát

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.3. Bố trí thí nghiệm tổng quát

Xây dựng thí nghiệm tổng quát như sơ đồ sau:

Chủng vi sinh vật thuần

Xác định hoạt tính Cellulase

Tăng sinh khối

B.subtilis

A.oryzae

B.subtilis và A.oryzae

Rong lục

Khảo sát thành phần hóa học

Xử lý nguyên liệu

Rong nguyên liệu

Xác định khả năng thủy phân

rong lục của vi sinh vật

Chọn chủng vi sinh vật phù

hợp

Nghiên cứu chế độ thủy phân

Tối ưu hóa chế độ thủy phân

Sản phảm thủy phân Thời gian

(giờ)

Nhiệt độ ( )

Mật độ vi sinh vật (CFU/g)

Sơ đồ 2. 1 Sơ đồ tổng quan thủy phân rong lục

21 Thuyết minh sơ đố:

Chủng vsv B.subtilis và A.oryzae thuần được xác định khả năng cellulase bằng cách cho phân giải CMC. Chủng vsv nếu sinh cellulase thì được mang đi tăng sinh khối.

2.3.1 Tăng sinh khối vsv

Cân 13g môi trường dinh dưỡng LB cùng với 1000mL nước cất, hấp vô trùng 1210C, trong vòng 15 phút.

*Các bước tiến hành nuôi cấy vsv

Cho 3mL nước muối sinh lý vào ống nghiệm chứa khuẩn lạc của chủng vsv. Hút 1mL cho vào bình tam giác chứa môi trường dinh dưỡng lỏng LB đã được hấp vô trùng.

Nuôi cấy trong điều kiện lắc 200 vòng/phút với B.subtilis và 120 vòng/phút với A.oryzae. Ở 280C trong 48 giờ để thu sinh khối vi khuẩn.

2.3.2. Đánh giá sinh trưởng của vi khuẩn

Được xác định bằng cách đếm khuẩn lạc trên môi trường thạch LBA với B.subtilis và DG18 với A.oryzae. Sau hai ngày ủ ở nhiệt độ 35℃ với B.subtilis và ba ngày với A.oryzae.

2.3.3. Thu sinh khối vsv

Dịch nuôi cấy được ly tâm 5000 vòng/phút ở nhiệt độ phòng [3]

- Pha sinh khối vi sinh thu được vật trong 1 lít đệm axetat.

- Định lượng mật độ vsv bằng cách đếm đĩa, điều chỉnh mật độ vsv đến 108 CFU/mL.

2.3.4. Thí nghiệm xác định hoạt tính cellulase của hai chủng vsv

Kiểm tra khả năng sinh cellulase của vsv bằng phương pháp khuếch tán trên thạch có cơ chất CMC.

Nguyên tắc của phương pháp là nuôi vi sinh trên môi đặc hiệu có bổ sung cơ chất CMC như sau:

* Môi trường xác định hoạt tính sinh cellulase - Môi trường khoáng + CMC (g/l):

22

CMC 10

NH4NO3 1

K2HPO4 0,5 KH2PO4 0,5 MgSO4. 7H2O 0,5

NaCl 1

CaCl2 0,1

FeCl3 0,02

Cao men 0,05

Thạch 20

pH7

Môi trường thanh trùng 121℃ trong 15 phút

Dùng phương pháp cấy chấm điểm. Ủ ở 350C trong 36 giờ, sau đó tráng dịch Lugol trên đĩa thạch và đo vòng phân giải trong suốt, không bắt màu nhuộm xung quanh điểm cấy.

2.3.5. Phương pháp đo đường khử và xây dựng đường khử glucose a) Nguyên tắc:

Phương pháp xác định hàm lượng đường khử. Enzym celluase thủy phân cơ chất CMC tạo thành sản phẩm là các đường có chứa gốc khử. Hàm lượng đường khử tạo thành được xác định bằng cách cho phản ứng với dung dịch DNS. 3,5- Dinitrosalicylic acid (DNS) có màu vàng trong dung dịch kiềm sẽ bị khử thành acid 3-amino-5-nitrosalicylic có màu đỏ cam. Màu sinh ra sau phản ứng được xác định bằng phương pháp so màu trên máy quang phổ ở bước sóng 540nm. Dựa theo biểu đồ đường chuẩn của glucose tinh khiết với thuốc thử DNS sẽ tính được hàm lượng đường khử của mẫu nghiên cứu. Phương trình phản ứng tạo màu giữa đường khử và DNS acid:

23

Một đơn vị hoạt độ enzym CMCase là lượng enzym phân giải cơ chất tạo thành 1mg glucose sau 1h tác dụng ở 400C, pH 5.5 [6, 15]

b)Hóa chất và thiết bị:

Các hóa chất sử dụng trong nghiên cứu bao gồm: Glucose; đệm acetate 0.5M, pH 5.0;

DNS, K-Na tartrate dung dịch CMC (1g/ 60mL).

* Thiết bị bao gồm: tủ ấm 400C, máy khuấy từ, máy quang phổ.

- Cân 0.5g DNS vào 30mL nước cất hòa tan trên bếp khuấy từ 50 độ.

-Thêm 0.5mL dung dịch NaOH 4M - Thêm 15g muối kép tartrat

- Định mức đến 50mL.Bảo quản trong lọ thủy tinh sẩm màu ở 40C

- Chuẩn độ 3mL thuốc thử bằng HCl 0.1M với chất chỉ chị phenolphtalein,hết 5-6 mL HCl là được.

Dung dịch đường chuẩn: Pha 0.1g glucose vào nước cất. Sau đó thêm nước đến20mL.

Dung dịch có mật độ 5mg/mL.

c) Xây dựng đường chuẩn glucose

Chuẩn bị 20mL dung dịch glucose 1mg/mL rồi pha loãng dung dịch này với độ pha loãng khác nhau từ 0.1 – 0.3 mg/mL. Thực hiện các thí nghiệm theo bảng sau:

Hình 2. 4. Sự tạo phức màu của thuốc thử

24

Bảng 1. 2 Xây dựng đường chuẩn Glucose

Lấy 0.5mL từ mỗi dịch pha loãng glucose ở trên và làm phản ứng xác định hàm lượng đường khử như phương pháp đã được mô tả ở trên.

d) Đường chuẩn Glucose

Đường chuẩn Glucose được xây dựng :

Ống số 0 1 2 3 4 5

Mật độ glucose (mg/mL) 0 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 Dung dịch glucose (mL) 0 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3

Nước cất (mL) 1 0,9 0,85 0,8 0,75 0,7

y = 2.054x - 0.1716 R² = 0.9778

0.000 0.050 0.100 0.150 0.200 0.250 0.300 0.350 0.400 0.450 0.500

0.00 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 0.30 0.35

A 540nm

Mật độ Glucose(mg/ml)

Đương chuẩn Glucose

Sơ đồ 2. 2. Đường chuẩn Glucose

25 e) Xác định hàm lượng đường khử trong mẫu

Cho 0.5mL dịch của mẫu kiểm tra và 0.5mL dung dịch DNS vào eppendof 1.5mL.

Đun sôi 5 phút, làm lạnh và ly tâm 12000 vòng/phút trong 2 phút. Thu 1mL dịch trong và đo độ hấp phụ tại bước sóng 540nm

* Công thức tính định lượng đường khử

Tìm phương trình biểu diễn đường chuẩn dạng y = ax + b với y =OD540nm; x=[glucose] (mg/mL) và hệ số tương quan R2 nhờ phần mềm Excel.

- Từ phương trình biểu đồ đường cong chuẩn tính được X mg/mL đường khử trong dung dịch đường pha loãng.

- Chọn hệ số pha loãng n sao cho OD nằm trong giới hạn đường chuẩn.

- Tính hàm lượng đường trong nguyên liệu (mg/g) = (x*n)/m

*Trong đó:

- Với x là kết quả đo được đơn vị là mg/mL - Với n là số mL dung dịch đệm pha loãng mẫu - Với m là khối lượng mẫu cân đem đi phân tích 2.3.6. Xác định khả năng của vsv trên cơ chất rong lục

Vsv được cho vào rong để thủy phân. Lượng đường khử sinh ra được đo nhằm đánh giá khả năng thủy phân của vsv.

2.3.7. Chọn chủng vsv phù hợp

Có ba sự lựa chọn. Lựa chọn thứ nhất là chỉ dùng B.sutilis để thủy phân. Lựa chọn thứ hai là chỉ dùng A.oryzae để thủy phân. Lựa chọn thứ ba là dùng kết hợp hai chủng vsv là B.sutilis và A.oryzae để cùng thủy phân rong lục.

2.3.8. Khảo sát chế độ thủy phân

Nghiên cứu chế độ thủy phân phù hợp với chủng vsv được chọn ở mục 2.3.7. Xác định các vùng ảnh hưởng của các yếu tố như: Nhiệt độ, mật độ vsv, thời gian…

26 2.3.9. Nghiên cứu tối ưu hóa quá trình thủy phân

Dựa vào các vùng ảnh hướng được xác định ở mục 2.3.8. Tối ưu hóa quá trình thủy phân rong bởi các yếu tố ảnh hưởng: nhiệt độ, mật độ vsv và thời gian thủy phân.

2.3.10. Sản phẩm thủy phân rong lục

Sản phẩm thủy phân rong lục có hàm lượng đường khử lớn. Phù hợp để bổ sung vào thức ăn chăn nuôi.

2.4 Bố trí thí nghiệm

2.4.1. Thí nghiệm kiểm tra khả năng sinh cellulase thủy phân CMC

Môi trường thạch khoáng dinh dưỡng + CMC được đổ vào đĩa petri vô trùng. Làm lạnh ở nhiệt độ phòng. Khi thạch dinh dưỡng đông lại và ổn định, ta cấy vsv theo phương pháp cấy điểm lên bề mặt thạch. Một đĩa cấy B.sutilis, một đĩa cấy A.oryzae. Ủ ở nhiệt độ 35℃ trong vòng 72 giờ. Sau 72 giờ, dùng thuốc thử Lugol trải trên bề thạch, idol trong thuốc thử tạo phức với cơ chất CMC nhưng không tạo phức màu với đường khử. Ta đo vòng phân giải là vòng không bắt màu thuốc thử. Kích thước vòng phân giải được tính như sau:

Vòng phân giả được xác định: 𝑫−𝒅

𝟐

Với: D là đường kính vòng thủy phân d là đường kính giếng khuếch tán

2.4.2. Khảo sát khả năng sinh cellulase của vsv ở các nồng độ muối (NaCl) khác nhau

Đối tượng nghiên cứu là rong lục Ulva lactuca là rong sống ở biển, môi trường sống chứa muối (NaCl). Trong bản thân của Ulva lactuca có hàm lượng muối nhất định.

Vì vậy đồ án khảo sát khả năng thủy phân Cellulose trên cơ chất là rong lục của các vi sinh đối tượng nghiên cứu của đồ án ở các mật độ muối khác nhau. Với mục đích đánh giá sự ảnh hưởng của hàm lượng muối lên khả năng sinh trưởng, phát triển và khả năng sinh cellulase thủy phân cellulase (CMC). Thông số của bố trí thí nghiệm được cố định như

27

sau: 108 CFU B.subtilis+A.oryzae; Nhiệt độ 35℃; Thời gian 72 giờ; Môi trường khoáng + CMC không chứa agar tương tự như mục 2.3.2 với lượng là 200mL. Nuôi cấy lắc với 120 vòng/phút.

Bố trí thí nghiệm như sau:

Sơ đồ 2. 3. Bố trí thí nghiệm khảo sát sự ảnh hưởng của nồng độ NaCl đến khả năng thủy phân của vsv

2.4.2. Khảo sát thành phần hóa học của rong

Dựa vào các phương pháp xác định thành phần hóa học của rong lục ở mục 2.2 để xác định hàm lương chất dinh dưỡng trong rong lục nguyên liêu.

2.4.4. Xử lý rong nguyên liệu

Rong lục là loại rong sống ở biển nên mang trong mình hàm lượng muối nhất định.

Vì vậy quá trình xử lý rong giúp bên cạnh loại bỏ táp chất cát, sạn….còn loại bỏ một lượng muối nhất định. Mật độ muối trong rong thu nhận sử dụng trong đồ án được xác định theo TCVN 4330:1986. Kết quả sau khi đo, hàm lượng muối của rong tại biển hòn Chồng, hòn Đỏ Nha Trang có mật độ là 1.6 %.

Cố định tỉ lệ rong và nước là 100g rong ngâm trong 1L nước sạch. Có sử dụng phương pháp khuấy đảo. Bố trí thí nghiệm khảo sát thời gian ngâm rong, bước nhảy là 30 phút, thí

28

nghiệm dừng lại khi hàm lượng muối trong rong nguyên liệu nằm dưới 0.5%. Kết quả thí nghiệm được thể hiện qua bảng sau thực nghiệm như sau:

Bảng 2. 1. Hàm lượng NaCl có trong rong nguyên liệu qua các thời gian ngâm khác nhau.

Thời gian ngâm

(phút) Hàm lượng muối trong rong lục (%)

10 0,9

20 0,6

30 0,4

40 0,4

50 0,3

60 0,3

Kết quả đo ở lần đâu tiên với thời gian là 30 phút thì lượng muối trong rong đã đạt yêu cầu. Vậy chế độ rửa rong được thành lặp như sau: Ngâm rong với tỷ lệ 100 gram rong trong một lít nước. Thời gian ngâm là 30 phút, kèm phướng pháp khuấy đảo. Rong sau khi rửa được làm ráo nước bằng cách banh các tản rong trên rỗ, rá. Điều kiện là ráo ở điều kiện phòng.

Rong sau khi làm ráo được say nhuyễn, trở thành rong nguyên liệu cho các thí nghiệm của đồ án.

2.4.5. Xác định khả năng thủy phân của vsv trên rong lục

Nhằm đánh giá khả năng thủy phân và sự kết hợp của hai chủng vsv, bố trí thí nghiệm khảo sát như sau:

TN1: 50g rong + 108 CFU B.subtilis TN2: 50g rong + 108 CFU A.oryzae

TN3: 50g rong + 108 CFU (5.108 CFU B.subtilis và 5.108 CFU A.oryzae) Thời gian 72 giờ, ủ ở nhiệt độ 35℃.

29

Xác định hàm lượng đường khử ở ba thí nghiệm để xác định khả năng thủy phân cellulose của chủng vsv trên mẫu rong lục.

2.4.6. Tối ưu quá trình thủy phân

Sử dụng chủng vsv hoặc hỗn hợp hai chủng vsv được lựa chọn ở mục 2.4.5 để tối ưu hóa quá trình thủy phân. Quá trình thủy phân sử dụng các thông số và các vùng ảnh hướng

Sơ đồ 2. 4 Xác định khả năng thủy phân của vsv trên rong lục 108 CFU

B.subtilis

108 CFU A.oryzae

108 CFU B.subtilis + A.oryzae

50g rong nguyên liệu đã xử lý

Ủ 72 giờ,35℃

Đo đường khử

Hàm lượng đường khử số

Mật độ vsv(10

8CFU/

ml) Nhiệt

độ

Thời gian

Hình 2. 5. Tối ưu quá trình thủy phân

30 2.4.6.1 Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ

Nhiệt độ là một yếu tố quan trọng đến sự sinh trưởng và phát triển của vsv. Vì vậy thí nghiệm tiến hành khảo sát khả năng sinh trưởng và tiết cellulase của chủng vsv được chọn tại mục 2.4.5 ở các nhiệt độ 25, 30, 35, 40, 45 và 50℃. Thí nghiệm sử dụng tủ mát, bể ổn nhiệt và tủ ấm để gia nhiệt cho các mấu thí nhiệm.

Tiến hành thí nghiêm: Cho 50g rong lục nguyên liệu đã được xử lý cùng với 108 CFU vsv. Các mẫu được ủ ở các nhiệt độ khác nhau. 25℃ ủ trong tủ mát; 30, 35℃ ủ trong tủ ấm; 40 và 50℃ được ủ trong bể ổn nhiệt.

2.4.6.2 Khảo sát ảnh hưởng của thời gian

Thời gian thủy phân cũng là một nhân tố ảnh hưởng trực tiếp đến quá trình thủy phân.

Thời gian lâu để vsv thủy phân cơ chất, cũng là thời gian ngắn nhất để giảm chi thí thủy phân. Bởi vậy, thí nghiệm khảo sát thời gian thủy phân nhằm xác định khoản thời gian phù hợp để tối ưu hóa quá trình thủy phân.

Khối lượng mẫu là 50g rong lục đã xử lý, cố định nhiệt độ ở 35oC, 1mL (108 CFU/mL) dịch vsv được chọn ở mục 2.4.5. Thời gian đo từ 24, 48, 72 giờ…..Lặp lại cho đến khi kết quả đo của hai lần liên tiếp lượng đường không tăng

Sơ đồ 2. 5. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình thủy phân rong lục

31 2.4.6.3 Khảo sát ảnh hưởng của mật độ vsv

Khối lượng mẫu là 50g rong lục đã xử lý, cố định nhiệt độ ở 35oC, thời gian khảo sát trong miền thời gian mục 2.4.6.2 , dịch vsv được chọn ở mục 2.4.5. Khảo sát các mật độ như trong bảng dưới đây:

Bảng 2. 2 Mật độ vsv trên 1g rong nguyên liệu Số mL dịch chứa vsv

(108 CFU/mL) Mật độ vsv trên 1g rong lục(CFU/g)

0.5 106

1 2.106

1.5 3.106

2 4.106

2.5 5.106

3 6.106

3.5 7.106

4 8.106

Sơ đồ 2. 6. Khảo sát ảnh hưởng của thời gian tới quá trình thủy phân rong lục

32 2.5 Ma trận thực nghiệm

Dựa vào các thí nghiệm khảo sát vùng ảnh hưởng các yếu tố đến quá trình thủy phân:

Thời gian, nhiệt độ và mật độ vsv. Xây dựng ma trận điều kiện thí nghiệm.

-Thời gian thủy phân (U1): 72-120 giờ -Nhiệt độ thủy phân (U2): 25-40 ℃ -Mật độ vsv thủy phân (U3): 2-6 (triệu CFU/g)

Bảng 2. 3 Điều kiện thí nghiệm cho quá trình thủy phân rong lục

Các mức

Các yếu tố ảnh hưởng

U1 (giờ) U2 (℃) U3 (106 CFU/g)

Mức trên (+1) 120 40 6

Mức cơ sở (0) 96 32,5 4

Mức dưới (-1) 72 25 2

Khoảng biến thiên 24 7,5 2

Từ hệ tọa độ U1,U2,U3 chuyển sang hệ tọa độ mới không thứ nguyên X1,X2,X3 theo công thức 2.1:

Xi=𝑈𝑖 −𝑈𝑖

0

∆𝑈𝑖 (2.1)

Kết quả hình thành ma trận quy hoạch thực nghiệm và số lượng thí nghiệm được thể hiện theo mô hình Box-behnken được thể hiện trong bảng 2.4

Phương trình hồi quy có dạng:

Y= b0 + b1X1 + b2X2 + b3X3 + b12X1X2 + b13X1X3 + b23X2X3 + b11X12 + b22X22 + b33X32

33

Bảng 2. 4 Ma trận huy hoạch thực nghiệm

STT X1: Thời gian thủy phân (giờ)

X2: Nhiệt độ thủy phân (℃)

X3 : Mật độ vsv (106CFU/g)

Y: Lượng đường khử số

(mg/g)

1 -1 -1 0

2 1 -1 0

3 -1 1 0

4 1 1 0

5 -1 0 -1

6 1 0 -1

7 -1 0 1

8 1 0 1

9 0 -1 -1

10 0 1 -1

11 0 -1 1

12 0 1 1

13 0 0 0

14 0 0 0

15 0 0 0

16 0 0 0

17 0 0 0