Chương III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.4. Tối ưu hóa quá trình thủy phân
Trên cơ sở thăm dò miền ảnh hưởng của các yếu tố về điệu kiện sống tối ưu của vsv.
Tiến hành tối ưu hóa bằng phương pháp bề mặt đáp ứng, sử dụng mô hình thiết kế BoxBehnken quá trình thủy phân rong lục với các thông số biến như sau: thời gian thủy
Biểu đồ 3. 5. Khảo sát mật độ vsv dùng để thủy phân rong lục
0.30 0.41 0.47 0.54 0.60 0.68 0.80 0.91
0.36 0.49 0.56 0.65 0.72 0.82 0.96 1.09
0.50 0.69 0.79 0.91 1.01 1.14 1.34 1.53
0.81 1.10 1.26 1.61 1.61 1.63 1.80 1.94
1.45 1.72 1.94 1.95 1.98 1.91 1.90 1.90
1 2 3 4 5 6 7 8
TỔNG ĐƯỜNG KHỬ (MG/G)
MẬT ĐỘ (TRIỆU CFU/G) 24 48 72 96 120
43
phân 72÷ 120 giờ, nhiệt độ 25 ÷ 400C,mật độ 2-6.106 CFU/g. Cố định pH = 6,[4, 11]. Kết quả thể hiện ở bảng sau:
Bảng 3. 3. Kết quả thí nghiệm của mô hình Box-Behnken
Factor 1 Factor 2 Factor 3 Response 1
Std Run A:Thời gian B:Nhiệt độ C:Mật độ vsv Lượng đường khử
giờ độ C triệu CFU/g mg/g
1 2 72 25 4 0,46
2 15 120 25 4 0,74
3 13 72 40 4 0,78
4 5 120 40 4 1,02
5 12 72 32,5 2 1,53
6 14 120 32,5 2 1,95
7 8 72 32,5 6 1,75
8 1 120 32,5 6 1,93
9 3 96 25 2 0,7
10 16 96 40 2 0,91
11 4 96 25 6 0,75
12 7 96 40 6 0,98
13 9 96 32,5 4 1,95
14 11 96 32,5 4 1,97
15 10 96 32,5 4 1,88
16 6 96 32,5 4 2
17 17 96 32,5 4 1,9
44 Model Terms
Term Standard Error* VIF Rᵢ² Power
A 0,3539 1,00222 0,0022 68,0 %
B 0,3536 1,00235 0,0023 68,1 %
C 0,3539 1,00222 0,0022 68,0 %
AB 0,4994 1,00222 0,0022 40,9 %
AC 0,5000 1 0,0000 40,8 %
BC 0,4994 1,00222 0,0022 40,9 %
A² 0,4873 1,00588 0,0058 93,8 %
B² 0,4901 1,00824 0,0082 93,6 %
C² 0,4873 1,00588 0,0058 93,8 %
ANOVA for Quadratic model Response 1: Lượng đường khử
Source Sum of Squares df Mean Square F-value p-value
Model 5,33 9 0,5924 284,04 < 0.0001 significant A-Thời gian 0,1568 1 0,1568 75,18 < 0.0001
B-Nhiệt độ 0,1352 1 0,1352 64,82 < 0.0001
C-Mật độ vsv 0,0128 1 0,0128 6,14 0,0424
AB 0,0004 1 0,0004 0,1918 0,6746
AC 0,0144 1 0,0144 6,90 0,0340
BC 0,0001 1 0,0001 0,0479 0,8329
A² 0,0581 1 0,0581 27,87 0,0011
B² 4,84 1 4,84 2322,07 < 0.0001
C² 0,0044 1 0,0044 2,13 0,1876
Residual 0,0146 7 0,0021
Lack of Fit 0,0048 3 0,0016 0,6531 0,6217 not significant Pure Error 0,0098 4 0,0025
Cor Total 5,35 16
45
Biểu đồ 3. 6. Biểu diễn ảnh hưởng của thời gian thủy phân đến hàm lượng đường khử
Từ kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian thủy phân đến hàm lượng đường khử được thể hiện ở biểu đồ 3.5, cho thấy khi thời gian thủy phân tăng từ 72 giờ đến 96 giờ thì lượng đường khử sinh ra tăng nhanh, thể hiện rõ rệt ở 72 là 1,53 mg/g đường khử đến giờ thứ 96 thì lượng đường này là 1,97 mg/g. Qua giờ thứ 96 trở đi thì lượng đường tăng nhẹ cho đến giờ thứ 120.
Thời gian tối ưu của quá trình thủy phân là tại thời điểm lượng đường khử không tăng nửa.
Design-Expert® Software Factor Coding: Actual
Lượng đường tổng (mg/g) Design Points
95% CI Bands X1 = A: Thời gian
Actual Factors B: Nhiệt độ = 32,5 C: Nồng độ vi sinh vật = 4
X: A: Thời gian (giờ)
72 80 88 96 104 112 120
Y: Lượng đường tổng (mg/g)
0 0,5 1 1,5 2
2,5 Warning! Factor involved in multiple interactions.
One Factor
46
Biểu đồ 3. 7. Biểu đồ ảnh hưởng của nhiệt độ thủy phân đến hàm lượng đường khử
Biểu đồ trên biểu thị mối ảnh hưởng của nhiệt độ đến hàm lượng đường khử. Từ 25℃
đến 31℃ thì lượng đường khử sinh ra tăng theo chiều tăng của nhiệt đô và lượng đường khử sinh ra đạt cao nhất vào khoảng nhiệt độ giữa 31 đến 34℃. Từ nhiệt độ 34 đến 40℃
thì lượng đường khử giảm, biểu hiện ở biểu đồ là đường thẳng đi xuống. Có thể thấy vùng nhiệt độ tốt nhất cho quá trình thủy phân rong lục của vsv là từ 30-35℃. Điều này hoàn toàn phu hợp với lý thuyết, giáo trình vsv hiên tại [5, 8, 11]. Nhiệt độ tối ưu của quá trình thủy phân là tại điểm nhiệt độ đó lượng đường sinh ra là lớn nhất.
Design-Expert® Software Factor Coding: Actual
Lượng đường tổng (mg/g) Design Points
95% CI Bands X1 = B: Nhiệt độ
Actual Factors A: Thời gian = 96 C: Nồng độ vi sinh vật = 4
X: B: Nhiệt độ (độ C)
25 28 31 34 37 40
Y: Lượng đường tổng (mg/g)
0 0,5 1 1,5 2
2,5 Warning! Factor involved in multiple interactions.
One Factor
47
Biểu đồ 3. 8. Ảnh hưởng của mật độ vsv đến hàm lượng đường khử
Biểu đồ trên thể hiện mối ảnh hưởng của yếu tố mật độ vsv hay lượng vsv có trên một gram rong nguyên liệu. Đường cong thể hiện ảnh hưởng của mật độ vsv đến lượng đường khử. Có thể nhận thấy là từ nồng 2.106 CFU được bổ sung trên 1g rong nguyên liệu đến 4.106 CFU trên 1g rong thì lượng đường có tăng. Nhưng với lượng vsv bổ sung từ bốn triệu CFU trên 1g rong trở đi thì chỉ tăng nhẹ.
Mật độ tối ưu cho quá trinh thủy phân là mật độ tại đó nếu bổ sung thêm vsv thì lượng đường cũng không tăng.
48 Coefficients in Terms of Coded Factors
Factor Coefficient
Estimate df Standard Error
95% CI Low
95% CI
High VIF
Intercept 1,94 1 0,0204 1,89 1,99
A-Thời gian 0,1400 1 0,0161 0,1018 0,1782 1,0000
B-Nhiệt độ 0,1300 1 0,0161 0,0918 0,1682 1,0000
C-Mật độ
vsv 0,0400 1 0,0161 0,0018 0,0782 1,0000
AB -0,0100 1 0,0228 -0,0640 0,0440 1,0000
AC -0,0600 1 0,0228 -0,1140 -0,0060 1,0000
BC 0,0050 1 0,0228 -0,0490 0,0590 1,0000
A² -0,1175 1 0,0223 -0,1701 -0,0649 1,01
B² -1,07 1 0,0223 -1,13 -1,02 1,01
C² -0,0325 1 0,0223 -0,0851 0,0201 1,01
Kết quả thí nghiệm cho thấy mối quan hệ hàm bậc hai giữa hàm lượng đường khử(mg/g) và thời gian thủy phân(giờ), nhiệt độ thủy phân (℃), tỉ lệ sinh khối(mL) (P FLack of Fit=0,6217)
Y=1,94+1,14X1+1,13X2+0,04X3-0,01X1X2-0,06X1X3+0.005X2X3-0,1175X12-1,07X22- 0,0325X32
Trong đó: Y là hàm lượng đường khử (mg/g) X1 là thời gian thủy phân(giờ) X2 là nhiệt độ thủy phân (℃) X3 là mật độ vsv (106 CFU/ml)
49
Kết quả xử lý thống kê và biểu đồ biểu diễn cho thấy mức độ ảnh hưởng của các yếu tố, cho thấy khoảng nghiên cứu hai yếu tố ảnh hưởng đến hàm lượng đường khử số (mg/g) là thời gian thủy phân (p<0,0001) và nhiệt độ thủy phân (p<0,0001). Nhìn chung thời gian thủy phân và nhiệt độ thủy phân tăng trong khoảng nhất định thì lượng đường khử số (mg/g) tăng theo. Bên cạnh đó mật độ vsv được đưa vào thủy phân thì không ảnh hưởng quá nhiều (p = 0,0424 < 0.05). Phương trình hồi quy tuyến tính:
Y=1,94+1,14X1+1,13X2+0,04X3-0,06X1X3-0,1175X12-1,07X22 Trong đó: Y là hàm lượng đường khử (mg/g)
X1 là thời gian thủy phân(giờ) X2 là nhiệt độ thủy phân (℃) X3 là mật độ vsv (106 CFU/mL)
Design-Expert® Software Factor Coding: Actual
Lượng đường tổng (mg/g) Design Points
0,46 2
X1 = A: Thời gian X2 = B: Nhiệt độ
Actual Factor
C: Nồng độ vi sinh vật = 4
72 80 88 96 104 112 120
25 28 31 34 37
40 Lượng đường tổng (mg/g)
X: A: Thời gian (giờ) Y: B: Nhiệt độ (độ C)
0,5
1 1
1,5 1,5
5
Biểu đồ 3. 9 Đường đồng mức hàm lượng đường khử
50
Biểu đồ cho thấy các vùng màu khác nhau thể hiện lượng đường sinh ra khác nhau.
Dải màu sắc từ xanh dương đến xanh lá đến màu đỏ thể hiện sự tăng của hàm lượng đường khử. Biểu đồ trên là hình chiếu bằng từ trên xuống của bề mặt đáp ứng. Các điểm tối ưu của quá trình thủy phân là các điểm nằm trong vùng màu đỏ của biểu đồ.
Biểu đồ 3. 10 Bề mặt đáp ứng của quá trình thủy phân
Design-Expert® Software Factor Coding: Actual
Lượng đường tổng (mg/g)
Design points above predicted value Design points below predicted value
0,46 2
X1 = A: Thời gian X2 = B: Nhiệt độ
Actual Factor
C: Nồng độ vi sinh vật = 4
25 28 31 34 37 40
72 80
88 96 104 112 120 0
0,5 1 1,5 2
Lượng đường tổng (mg/g)
A: Thời gian (giờ) B: Nhiệt độ (độ C)
51
Phần mềm chỉ ra 3 điểm tối ưu cho quá trình thủy phân:
Bảng 3. 4. Các điểm tiên đoán do phần mềm DX6
STT Thời gian thủy phân (giờ) Nhiệt độ (℃) Mật độ vsv (106 CFU/g )
Hàm lượng đường khử
(mg/g)
1 109.682 32,9341 4,21709 2,09855
2 109,691 32,9348 4,21372 2,09754
3 109,583 32,9371 4,20953 2,09987
Từ cơ sở điểm tiên đoán từ mô hình, tiến hành thực nghiệm để kiểm chứng. Kết quả thí nghiệm được thể hiện trong bảng sau:
Bảng 3. 5. Kết quả kiểm tra thực nghiệm điểm tiên đoán
Điểm tiên đoán Thời gian thủy phân
(giờ)
Nhiệt độ thủy phân
(℃)
Mật độ vsv (106CFU/g)
Hàm lượng đường khử
( mg/g)
Điểm tiên đoán 109,583 32,9371 4,20953 2,09987
Thực nghiệm 109,6 33 4,2 1,98 ± 0,07
Kết quả kiểm chứng thực nghiệm cho thấy có sự tương thích giữa lý thuyết và thực nghiệm. Hàm lượng đường khử số 1,98 ± 0,07 khi thủy phân rong lục bằng B.subtilis và A.oryzae ở nhiệt độ 330C, thời gian thủy phân 109 giờ, mật độ hỗn hợp vsv so với cơ chất là 4,2.106CFU/g. Kết quả đánh giá cảm quan cho thấy bã rong mềm, bóp nhẹ thì bã rong nát, màu nâu sáng, mùi tanh của rong. Sản phẩm thủy phân protein thu được từ rong lục nguyên liệu có thể được sử dụng để phối trộn sản xuất thức ăn chăn nuôi.
52
Từ các phân tích ở trên cho phép chọn các thông số tối ưu cho hoạt động thủy phân bã rong sau sản xuất agar: nhiệt độ thích hợp 330C, pH 6, thời gian thủy phân thích hợp 109 giờ, mật độ hỗn hợp vsv so với cơ chất là 4,2.106 CFU/g
53
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
1.Kết luận
Từ các thí nghiệm nghiên cứu ở trên cho phép rút ra một số kết luận sau:
1) Kết quả đánh giá rong lục nguyên liệu thu lượm tại gành đỏ và biển Hòn Chồng Nha Trang có một số thành phần như sau: hàm lượng protein 34,5 mg/g, hàm lượng cellulose 80mg/g, hàm lượng tro 200,5 mg/g.
2) Đánh giá, nghiên cứu khả năng sinh enzyme cellulase của hai chủng vsv là B.subtilis và A.oryzae trong bộ sưu tập giống vsv tại PTN Vi sinh – Trung tâm Thực hành, Trường ĐH Nha Trang. Kết luận hai chủng vsv này hoàn toàn phù hợp sử dụng trong đồ án bước đầu thủy phân rong lục.
3) Xác định điều kiện tối ưu cho quá trình thủy phân Ulva Lactuca: Thời gian 109 giờ, nhiệt độ là 33℃, số vsv đưa vào 2.1x106 CFU B.Subtilis và 2.1x106CFU A.Oryzae trên 1g rong nguyên liệu xay, lượng đường khử tạo ra là 1,98 mg/g. Sản phẩm thủy phân là hỗn hợp dịch gần như đồng nhất có hàm lượng protein là 34,5mg/g.
2. Kiến nghị
Từ những nghiên cứu sơ bộ cho phép đề xuất kiến nghị:
1) Nghiên cứu ứng dụng giá trị dinh dưỡng cụ thể của rong Ulva lactuca thủy phân vào thức ăn chăn nuôi, đa dạng hóa tính ứng dụng của rong lục Ulva Lactuca trong đời sống.
2) Ứng dụng kết hợp đồng thời hai chủng vsv B.Subtilis và A.Oryzae vào thủy phân các đối tượng nguyên liệu khác.
54