Nghiên cứu sản xuất chế phẩm vi sinh vật đối kháng với vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv. oryzae gây bệnh bạc lá trên cây lúa (Luận văn thạc sĩ)

Nghiên cứu sản xuất chế phẩm vi sinh vật đối kháng với vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv. oryzae gây bệnh bạc lá trên cây lúa (Luận văn thạc sĩ)Nghiên cứu sản xuất chế phẩm vi sinh vật đối kháng với vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv. oryzae gây bệnh bạc lá trên cây lúa (Luận văn thạc sĩ)Nghiên cứu sản xuất chế phẩm vi sinh vật đối kháng với vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv. oryzae gây bệnh bạc lá trên cây lúa (Luận văn thạc sĩ)Nghiên cứu sản xuất chế phẩm vi sinh vật đối kháng với vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv. oryzae gây bệnh bạc lá trên cây lúa (Luận văn thạc sĩ)Nghiên cứu sản xuất chế phẩm vi sinh vật đối kháng với vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv. oryzae gây bệnh bạc lá trên cây lúa (Luận văn thạc sĩ)Nghiên cứu sản xuất chế phẩm vi sinh vật đối kháng với vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv. oryzae gây bệnh bạc lá trên cây lúa (Luận văn thạc sĩ)Nghiên cứu sản xuất chế phẩm vi sinh vật đối kháng với vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv. oryzae gây bệnh bạc lá trên cây lúa (Luận văn thạc sĩ)Nghiên cứu sản xuất chế phẩm vi sinh vật đối kháng với vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv. oryzae gây bệnh bạc lá trên cây lúa (Luận văn thạc sĩ)

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUN SINH VẬT NGƠ BÍCH NGỌC NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT CHẾ PHẨM VI SINH VẬT ĐỐI KHÁNG VỚI VI KHUẨN Xanthomonas oryzae pv.oryzae GÂY BỆNH BẠC LÁ TRÊN CÂY LÚA LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC Chuyên ngành: Động vật học Mã số: 60 42 01 03 Hướng dẫn: TS Nguyễn Thị Hòa NĂM 2017 Khóa luận tốt nghiệp Ngơ Bích Ngọc LỜI CẢM ƠN Để hồn thành tốt Khóa luận tốt nghiệp, tơi xin trân trọng cảm ơn TS Nguyễn Thị Hịa - Trưởng phòng Nghiên cứu Triển khai, Trung tâm Khoa học Công nghệ Môi trường trực tiếp tận tình hướng dẫn, bảo giúp đỡ tơi suốt q trình thực tập hồn thành khóa luận tốt nghiệp để thu kết tốt mong muốn Tôi xin trân trọng cảm ơn Ban lãnh đạo Trung tâm khoa học công nghệ mơi trường, anh, chị phịng Nghiên cứu triển khai tạo điều kiện thuận lợi cho học tập nghiên cứu Trung tâm Tôi xin trân trọng cảm ơn Thầy Cô giáo truyền đạt kiến thức kinh nghiệm bổ ích cho tơi suốt trình học tập Viện Sinh Thái Tài Nguyên sinh vật Cuối cùng, xin chân thành cảm ơn người thân gia đình, bạn bè bên cạnh, ủng hộ, động viên để tơi hồn thành cách tốt khóa luận tốt nghiệp Hà Nội, ngày 25 tháng 10 năm 2017 Học viên Ngơ Bích Ngọc Khóa luận tốt nghiệp Ngơ Bích Ngọc MỤC LỤC DANH MỤC BẢNG BIỂU DANH MỤC HÌNH ẢNH DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT 11 Phần MỞ ĐẦU 12 Đặt vấn đề 12 Mục tiêu nội dung nghiên cứu 13 2.1 Mục tiêu 13 2.2 Nội dung 13 Phần TỔNG QUAN TÀI LIỆU 14 Bệnh bạc lúa 14 1.1 Tác nhân gây bệnh bạc lúa 16 1.2 Các biện pháp phòng trừ bệnh bạc lúa 17 1.2.1 Sử dụng thuốc hóa học 18 1.2.2 Chọn giống lúa kháng bệnh 18 1.2.3 Biện pháp sinh học 22 Sử dụng vi sinh vật đối kháng phòng trừ bệnh bạc lúa 23 2.1 Xạ khuẩn 24 2.1.1 Giới thiệu chung xạ khuẩn 24 2.1.2 Khả sinh chất kháng sinh xạ khuẩn 26 2.2 Vi khuẩn Bacillus 28 2.2.1 Giới thiệu chung vi khuẩn Bacillus 28 2.2.2 Khả sinh hoạt chất vi khuẩn 31 Phần VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 34 Vật liệu hóa chất 34 1.1 Vật liệu 34 1.2 Hóa chất dụng cụ 34 1.3 Môi trường nghiên cứu 35 Phương pháp nghiên cứu 36 Khóa luận tốt nghiệp Ngơ Bích Ngọc 2.1 Phương pháp phân lập Bacillus 36 2.2 Phương pháp thử hoạt tính kháng vi sinh vật 37 2.3 Phương pháp đánh giá khả đồng sinh trưởng chủng vi sinh vật tuyển chọn 37 2.4 Nghiên cứu điều kiện nuôi cấy chủng vi sinh vật tuyển chọn 38 2.4.1 Ảnh hưởng nguồn dinh dưỡng đến sinh trưởng chủng vi sinh vật tuyển chọn 38 2.4.2 Ảnh hưởng nhiệt độ đến sinh trưởng chủng vi sinh vật tuyển chọn 38 2.4.3 Ảnh hưởng pH đến sinh trưởng chủng vi sinh vật tuyển chọn 39 2.5 Bố trí thí nghiệm 39 2.5.1 Đánh giá khả đối kháng chế phẩm với chủng vi khuẩn Xoo 39 2.5.2 Đánh giá khả phòng trừ bệnh bạc lúa 40 2.6 Đánh giá độc tính chế phẩm 41 2.6.1 Phương pháp thử độc cấp 41 2.6.2 Phương pháp thử độc tính bán trường diễn 42 2.7 Sản xuất chế phẩm 43 Phần KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 44 Tuyển chọn chủng vi sinh vật đối kháng với vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv oryzae pv.oryzae 44 1.1 Đánh giá tính kháng Xanthomonas oryzae pv oryzae chủng vi khuẩn, xạ khuẩn 45 1.2 Đặc điểm sinh học chủng vi sinh vật tuyển chọn 47 1.2.1 Đặc điểm hình thái chủng xạ khuẩn tuyển chọn 47 1.2.2 Đặc điểm hình thái chủng Bacillus tuyển chọn 50 1.3 Đánh giá khả đồng sinh trưởng chủng vi sinh vật tuyển chọn 51 Nghiên cứu điều kiện nuôi cấy chủng vi sinh vật tuyển chọn 54 Khóa luận tốt nghiệp Ngơ Bích Ngọc 2.1 Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng chủng vi sinh vật tuyển chọn 54 2.1.1 Ảnh hưởng pH 54 2.1.2 Ảnh hưởng nhiệt độ 57 2.1.3 Khả chịu mặn 60 2.2 Ảnh hưởng nguồn dinh dưỡng đến sinh trưởng sinh chất đối kháng vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv oryzae chủng vi sinh vật tuyển chọn 63 2.2.1 Nguồn Cacbon 63 2.2.1.1.Ảnh hưởng nguồn cacbon đến sinh trưởng chủng vi sinh vật tuyển chọn 64 2.2.1.2.Xác định nồng độ cacbon cần thiết cho chủng vi sinh vật tuyển chọn 67 2.2.2 Nguồn Nitơ 70 2.2.2.1.Ảnh hưởng nguồn nitơ đến sinh trưởng chủng vi sinh vật tuyển chọn 70 2.2.2.2.Xác định nồng độ nitơ cần thiết cho chủng vi sinh vật tuyển chọn 73 2.2.3 Nguồn khoáng 74 2.2.3.1.Ảnh hưởng nguồn khoáng đến sinh trưởng chủng vi sinh vật tuyển chọn 75 2.2.3.2.Xác định nồng độ khoáng cần thiết cho chủng vi sinh vật tuyển chọn 78 Sản xuất ứng dụng chế phẩm phòng trừ bệnh bạc qui mơ phịng thí nghiệm 81 3.1 Sản xuất chế phẩm vi sinh vật kháng Xanthomonas oryzae pv oryzae 81 3.2 Đánh giá độc tính cấp độc tính bán trường diễn sản phẩm 85 3.3 Đánh giá hiệu phòng trừ bệnh bạc chế phẩm qui mơ phịng thí nghiệm 87 3.3.1 Đánh giá khả đối kháng chế phẩm với vi khuẩn Xoo môi trường lỏng 87 3.3.2 Đánh giá khả phòng trừ bệnh bạc lúa quy mơ phịng thí nghiệm 88 Khóa luận tốt nghiệp Ngơ Bích Ngọc Phần KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 91 Kết luận 91 Đề nghị 91 TÀI LIỆU THAM KHẢO 93 TÀI LIỆU TIẾNG ANH 93 TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT 97 WEBSITE 98 Khóa luận tốt nghiệp Ngơ Bích Ngọc DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng Đặc điểm nguồn gốc gen Xa kháng bệnh bạc lúa 19 Bảng 2 Trình tự đoạn mồi đặc hiệu để phát gen Xa lúa 20 Bảng Số lượng vi sinh vật qua mẫu đất phân lập (CFU/g)…………………… 44 Bảng Khả kháng vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv oryzae chủng xạ khuẩn 46 Bảng Khả kháng vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv oryzae chủng vi khuẩn 46 Bảng 4 Sinh khối chủng vi sinh vật tuyển chọn nuôi cấy đồng sinh trưởng 53 Bảng Đặc điểm hình thái khuẩn lạc chủng xạ khuẩn XKBL2 chủng XKBL3 môi trường Gauze ISP 49 Bảng Đặc điểm hình thái khuẩn lạc chủng vi khuẩn tuyển chọn 51 Bảng Ảnh hưởng pH đến chủng vi khuẩn tuyển chọn 56 Bảng Ảnh hưởng nhiệt độ tới khả sinh trưởng kháng Xanthomonas oryzae pv oryzae chủng xạ khuẩn tuyển chọn 57 Bảng Ảnh hưởng nhiệt độ tới khả sinh trưởng sinh chất kháng vi khuẩn tuyển chọn 59 Bảng 10.Ảnh hưởng nồng độ muối tới khả sinh trưởng sinh hoạt tính kháng Xanthomonas oryzae pv oryzae chủng xạ khuẩn tuyển chọn 61 Bảng 11 Ảnh hưởng nồng độ muối tới khả sinh trưởng sinh hoạt tính kháng Xanthomonas oryzae pv oryzae chủng vi khuẩn tuyển chọn 63 Bảng 12 Ảnh hưởng nguồn cacbon đến sinh trưởng hoạt tính kháng khuẩn Xanthomonas oryzae pv oryzae hai chủng xạ khuẩn tuyển chọn 65 Khóa luận tốt nghiệp Ngơ Bích Ngọc Bảng 13 Ảnh hưởng nguồn cacbon đến hoạt tính kháng Xanthomonas oryzae pv oryzae chủng vi khuẩn tuyển chọn 67 Bảng 14 Ảnh hưởng nồng độ cacbon tới chủng xạ khuẩn tuyển chọn 68 Bảng 15 Ảnh hưởng nồng độ cacbon tới chủng vi khuẩn tuyển chọn 69 Bảng 16 Ảnh hưởng nguồn nitơ đến sinh trưởng hoạt tính kháng Xanthomonas oryzae pv oryzae hai chủng xạ khuẩn tuyển chọn 71 Bảng 17 Ảnh hưởng nguồn nitơ đến hoạt tính kháng Xanthomonas oryzae pv oryzae chủng vi khuẩn tuyển chọn 72 Bảng 18 Ảnh hưởng nồng độ nitơ tới hai chủng xạ khuẩn tuyển chọn 73 Bảng 19 Ảnh hưởng nồng độ nitơ tới chủng vi khuẩn tuyển chọn 74 Bảng 20 Ảnh hưởng nguồn khống đến sinh trưởng hoạt tính kháng Xanthomonas oryzae pv oryzae hai chủng xạ khuẩn tuyển chọn 76 Bảng 21 Ảnh hưởng nguồn khoáng đến sinh trưởng chủng vi khuẩn tuyển chọn 77 Bảng 22.Ảnh hưởng nồng độ khoáng tới chủng xạ khuẩn tuyển chọn 79 Bảng 23 Ảnh hưởng nồng độ khoáng tới chủng vi khuẩn tuyển chọn 80 Bảng 24 Các thơng số q trình sản xuất 83 Bảng 25 Kết phân tích số tiêu vi sinh vật chế phẩm (Phân tích Phịng thử nghiệm sinh học Viện Công nghệ Sinh học – Viện Hàn Lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam) 84 Bảng 26 Số lượng chuột chết, biểu bên chuột uống chế phẩm 85 Bảng 27 Sự thay đổi khối lượng chuột thí nghiệm cho uống chế phẩm 86 Bảng 28 Khả đối kháng chế phẩm dạng lỏng với vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv oryzae 87 Khóa luận tốt nghiệp Ngơ Bích Ngọc Bảng 29 Khả sinh trưởng tỷ lệ mắc bệnh bạc quy mơ phịng thí nghiệm sau 4120h gieo cấy 89 Khóa luận tốt nghiệp Ngơ Bích Ngọc DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình Lúa bị nhiễm bệnh bạc vi khuẩn Xanthomonas oryzae 15 Hình 2 Khuẩn lạc tế bào vi khuẩn Xanthomonas oryzae 16 Hình Khuẩn lạc số chủng xạ khuẩn 26 Hình Hình thái khuẩn lạc chủng vi khuẩn, xạ khuẩn có mẫu 45 Hình Hoạt tính đối kháng vi khuẩn Xanthomonas oryzae chủng vi sinh vật tuyển chọn 47 Hình Sợi khuẩn ty khí sinh chủng XKBL2 (A,C,E) chủng XKBL3 (B,D,F) thời điểm – 14 – 21 ngày 48 Hình 4 Đặc điểm hình thái khuẩn lạc chủng vi khuẩn tuyển chọn 50 Hình Khả đồng sinh trưởng hai chủng xạ khuẩn tuyển chọn 52 Hình Khả đồng sinh trưởng chủng vi khuẩn tuyển chọn 52 Hình Khả đồng sinh trưởng chủng vi sinh vật tuyển chọn 53 Hình Ảnh hưởng pH tới khả sinh trưởng chủng xạ khuẩn tuyển chọn 55 Hình Ảnh hưởng pH đến chủng vi khuẩn tuyển chọn 55 Hình 10 Sự sinh trưởng chủng xạ khuẩn 200C, 300C, 450C 58 Hình 11 Sự sinh trưởng chủng vi khuẩn tuyển chọn 200C 300C đánh giá phương pháp cấy đường zizac môi trường MPA sau ngày 60 Hình 12 Đồ thị biểu thị khả chịu muối hai chủng xạ khuẩn tuyển chọn 62 Hình 13 Ảnh hưởng nguồn cacbon đến sinh trưởng hai chủng xạ khuẩn tuyển chọn 64 Hình 14 Sự phát triển xạ khuẩn sau 120h nuôi cấy bổ sung nguồn cacbon 65 Hình 15 Ảnh hưởng nguồn cacbon đến sinh trưởng chủng vi khuẩn tuyển chọn 66 Hình 16 Ảnh hưởng nguồn nitơ đến sinh trưởng hai chủng xạ khuẩn tuyển chọn 70 Khóa luận tốt nghiệp Ngơ Bích Ngọc khuẩn đạt 108CFU/ml, bào tử hình thành mật độ thấp khoảng 10 4CFU/ml Các chủng xạ khuẩn sau 40 nhân giống cấp đạt 107CFU/ml Sản phẩm sau hồn thiện đóng gói phân tích đánh giá chất lượng sản phẩm thơng qua mật độ vi sinh vật hữu ích Bên cạnh việc phân tích phịng thí nghiệm trung tâm, sản phẩm gửi phân tích Viện cơng nghệ Sinh học, kết trình bày bảng 4.25 Bảng 25 Kết phân tích số tiêu vi sinh vật chế phẩm (Phân tích Phịng thử nghiệm sinh học Viện Cơng nghệ Sinh học) STT Chỉ tiêu phân tích Xạ khuẩn Đơn vị Phương pháp tính phân tích TCVN CFU/g Kết phân tích Chế phẩm Chế phẩm dạng bột dạng lỏng 2,0x108 1,1x108 4,7x108 2,8x108 KPH KPH KPH KPH KPH KPH 4884:2001 Vi khuẩn Bacillus sp TCVN CFU/g 4884:2001 Tổng Coliform CFU/g TCVN 61871:2009 Tổng E.coli CFU/g TCVN 61871:2009 Tổng Salmonella CFU/g TCVN4884:2001 Ghi chú: KPH: không phát thấy mẫu Như vậy, mật độ vi sinh vật hữu ích chế phẩm đạt >108CFU/ml Kết phân tích cho thấy chế phẩm khơng có vi sinh vật gây bệnh đường ruột cho động vật E coli hay Salmonella 84 Khóa luận tốt nghiệp Ngơ Bích Ngọc 3.2 Đánh giá độc tính cấp độc tính bán trường diễn sản phẩm Trước đưa sản phẩm vào thực tế sản xuất sản phẩm đánh giá độc tính cấp độc tính bán trường diễn chuột để đánh giá ảnh hưởng sản phẩm với môi trường sinh thái động vật Sản phẩm gửi phân tích Viện Cơng nghệ Sinh học với thí nghiệm bố trí phần 2.6.1 phần Kết cụ thể sau: Độc tính cấp: Bảng 26 Số lượng chuột chết, biểu bên chuột uống chế phẩm Chế phẩm Số chuột chết Biểu bên ngồi vịng (g/kgP) vịng 0-72h 10,0 72h (con) Chuột di chuyển, ăn uống bình thường, 12,5 15,0 17,5 20,0 22,5 25,0 Lô lông mượt, phân nước tiểu bình thường Chuột di chuyển, ăn uống bình thường, lơng mượt, phân nước tiểu bình thường Chuột di chuyển, ăn uống bình thường, lơng mượt, phân nước tiểu bình thường Chuột di chuyển, ăn uống bình thường, lơng mượt, phân nước tiểu bình thường Chuột di chuyển, ăn uống bình thường, lơng mượt, phân nước tiểu bình thường Chuột di chuyển, ăn uống bình thường, lơng mượt, phân nước tiểu bình thường Chuột di chuyển, ăn uống bình thường, lơng mượt, phân nước tiểu bình thường 85 Khóa luận tốt nghiệp Ngơ Bích Ngọc Độc tính bán trường diễn: Thí nghiệm bố trí phần 2.6.2 phần 3, theo dõi ghi nhận kết quả: - Kết theo dõi biểu bên ngoài: Theo dõi biểu chức chuột thí nghiệm, nhận thấy chuột tất lô sử dụng chế phẩm khơng có tượng xù lơng, lông mượt, khả di chuyển, khả thu nhận thức ăn, phân nước tiểu bình thường Như vậy, thơng qua yếu tố trực quan bên ngồi, chế phẩm liều nghiên cứu không gây ảnh hưởng cho động vật uống dài ngày - Kết tăng khối lượng động vật thí nghiệm: Khơng có theo dõi biểu bên ngồi chuột thí nghiệm, chúng tơi cịn theo dõi thay đổi khối lượng chuột q trình thí nghiệm Khối lượng chuột thí nghiệm trình bày bảng 4,27 Bảng 27 Sự thay đổi khối lượng chuột thí nghiệm cho uống chế phẩm Liều lượng Đối chứng LD: g/kg LD: g/kg LD: g/kg Ngày thứ Ngày thứ Ngày thứ Ngày thứ 14 21 28 22,38 ± 23,00 ± 23,90 ± 24,38 ± 26,13 ± 1,25 1,53 1,22 1,25 1,38 22,65 ± 24,15 ± 24,40 ± 26,00 ± 0,92 0,49 1,27 0,71 22,73 ± 23,38± 24,00 ± 24,00 ± 25,75 ± 0,32 1,60 1,15 0,71 0,29 23,73 ± 22,35 ± 22,50 ± 22,50 ± 24,18 ± 0,61 1,20 1,78 2,45 1,66 Ngày 24,75 ± 0,5 86 Khóa luận tốt nghiệp Ngơ Bích Ngọc Kết cho thấy, chế phẩm liều nghiên cứu không ảnh hưởng đến tăng khối lượng động vật thí nghiệm thời gian 28 ngày 3.3 Đánh giá hiệu phòng trừ bệnh bạc chế phẩm qui mô phịng thí nghiệm 3.3.1 Đánh giá khả đối kháng chế phẩm với vi khuẩn Xoo môi trường lỏng Để xác định liều lượng sử dụng chế phẩm, thí nghiệm bố trí mục 2.5.1 phần 3: Các bình thí nghiệm ni máy lắc ổn nhiệt 300C, thời gian 48h, 12h lấy mẫu lần Phân lập xác định chủng vi sinh vật có mặt bình thí nghiệm Kết thể hình 4.22 bảng 4.28: Bảng 28 Khả đối kháng chế phẩm dạng lỏng với vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv oryzae Mật độ vi khuẩn Xoo Thí nghiệm 12h 24h 36h 48h TN1 KPH KPH KPH KPH TN2 KPH KPH KPH KPH TN3 KPH KPH KPH KPH TN4 2,3x102 KPH KPH KPH TN5 4,6x103 1,2x102 KPH KPH TN6 2,8x107 3,9x108 9,9x108 2,9x109 TN7 2,5x108 7,9x108 3,9x109 5,9x109 87 Khóa luận tốt nghiệp Ngơ Bích Ngọc Hình 22 Thí nghiệm sau 48h ni tủ ổn nhiệt 300C Kết phân tích cho thấy: thí nghiệm 1, 2, với tỷ lệ chế phẩm/vi khuẩn Xoo bảng 4.28, sau nuôi không thấy có mặt vi khuẩn Xoo sinh trưởng dịch canh trường Ở thí nghiệm có tỷ lệ chế phẩm nhỏ so với vi khuẩn Xoo (TN4, TN5) cần thời gian dài hơn, vi khuẩn Xoo giảm dần đến bị tiêu diệt hoàn toàn sau 24h (TN4) 36h (TN5) Ở thí nghiệm cịn lại (TN6, TN7) mật độ vi khuẩn Xoo môi trường chiếm đa số phát triển lấn át chủng vi sinh vật chế phẩm Như vậy, để đạt hiệu phòng trừ bệnh bạc cho lúa, cần sử dụng nồng độ vi khuẩn hữu ích lớn so với mật độ vi sinh vật gây bệnh Trong tự nhiên, vi khuẩn Xoo với mật độ khoảng 103-104 CFU/ml Chế phẩm có mật độ vi sinh vật hữu ích đạt 108CFU/ml Do vậy, mật độ pha loãng khoảng 10 000 lần có khả kháng lại vi khuẩn Xoo tự nhiên Như vậy, lít (kg chế phẩm) xử lý cho 20 - 30 m2 đất trồng 3.3.2 Đánh giá khả phòng trừ bệnh bạc lúa quy mơ phịng thí nghiệm Ngay sau xác định liều lượng sử dụng, chế phẩm thử nghiệm khả phòng trừ bệnh bạc lúa quy mơ phịng thí nghiệm với giống lúa Bắc thơm số Tiến hành thí nghiệm trình bày mục 2.5.2 phần 3: 88 Khóa luận tốt nghiệp Ngơ Bích Ngọc - TN 1: Chỉ xử lý hạt giống - TN 2: Xử lý hạt giống kết hợp xử lý đất - TN 3: Không xử lý hạt giống, xử lý đất trồng lúa - TN4: Không xử lý hạt giống, không xử lý đất trồng, phun chế phẩm bắt đầu phát mầm bệnh với tỷ lệ 1l/20m2 - TN (ĐC): không sử dụng chế phẩm giai đoạn Kết thí nghiệm trình bày bảng 4.29 Bảng 29 Khả sinh trưởng tỷ lệ mắc bệnh bạc quy mơ phịng thí nghiệm sau 45 ngày gieo cấy Thí Tỷ lệ nảy nghiệm mầm Số nhánh Trọng lượng Số vết trung thân + rễ bệnh/khóm bình/cây cây/khóm (g) TN 100% 6,5 nhánh 115,51 8,5 TN 100% 6,3 nhánh 154,17 3,5 TN 100% 6,8 nhánh 160,24 3,7 TN 100% 6,6 nhánh 110,26 10 TN 100% 6,5 nhánh 119,11 11 Kết cho thấy: chế phẩm không ảnh hưởng đến khả nảy mầm hạt Các hạt giống xử lý chế phẩm đảm bảo nảy mầm 100% mẫu đối chứng Ở tất thí nghiệm, sinh trưởng tốt đẻ nhánh khỏe Sau 30 ngày gieo cấy, lúa bắt đầu xuất vài vết bệnh điển hình, đó, thí nghiệm 2, thấy vài vết bệnh nhỏ Các thí nghiệm 1, 4, vết bệnh xuất nhiều hơn, 89 Khóa luận tốt nghiệp Ngơ Bích Ngọc tiến hành phun chế phẩm cho lơ thí nghiệm 4, nhiên bệnh tiếp tục phát triển, điều hoạt tính khơng đủ mạnh cấu trúc bị phá hủy từ bên Sau 45 ngày thí nghiệm, cân trọng lượng thân thí nghiệm cho thấy thí nghiệm 2, vết bệnh trọng lượng thân lớn khoảng 25% so với trọng lượng thân thí nghiệm 1, 4, Như vậy, thí nghiệm có xử lý đất trồng cho hiệu phịng bệnh tốt so với thí nghiệm xử lý hạt giống Đặc biệt, kết theo dõi thí nghiệm cho thấy: xuất vết bệnh phun chế phẩm hiệu khơng rõ ràng Hình 23 Hình ảnh lúa trồng phịng thí nghiệm 90 Khóa luận tốt nghiệp Ngơ Bích Ngọc Phần KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ Kết luận - Từ mẫu đất trồng lúa phân lập chủng xạ khuẩn chủng vi khuẩn có khả sinh chất kháng vi khuẩn Xoo gây bệnh bạc lúa - Các chủng vi sinh vật tuyển chọn phát triển điều kiện pH 5,5 - 8, nhiệt độ 20 - 400C chủng VSV sinh trưởng có hoạt tính mạnh pH 6,5 - 7,5 nhiệt độ 25 - 350C, khả chịu mặn lên tới 2% - Cả chủng vi sinh vật khơng có tính đối kháng lẫn sinh trưởng mạnh mơi trường dinh dưỡng có nguồn cacbon cám gạo, rỉ đường khoảng 20 - 25g/l; nguồn nito cao thịt từ – 10g/l; nguồn khoáng NaCl, MgSO4, KH2PO4 với nồng độ tương ứng là: 3g/l; 2g/l; 1,5g/l - Kết thí nghiệm cho thấy chế phẩm khơng gây độc cấp tính độc trường diễn với động vật thí nghiệm - Kết thử nghiệm khả phịng bệnh bạc lúa quy mơ phịng thí nghiệm cho thấy chế phẩm khơng ảnh hưởng đến khả nảy mầm hạt Chế phẩm có hiệu phòng trừ bệnh tốt sử dụng để xử lý hạt trước gieo xử lý đất trước cấy lúa Đề nghị Để đạt kết cao cần thực nghiên cứu cho ứng dụng vào việc phòng trừ bệnh Do đó, chúng tơi đề xuất vài hướng nghiên cứu: - Tối ưu điều kiện nuôi cấy để mở rộng quy mơ sản xuất lớn đưa vào ứng dụng rộng rãi, góp phần giảm thiệt hại nghiêm trọng mà bệnh bạc gây theo phương án thân thiện với môi trường 91 Khóa luận tốt nghiệp - Ngơ Bích Ngọc Ứng dụng chế phẩm vi sinh sản xuất đồng ruộng, thử nghiệm vùng khí hậu giống lúa khác để kiểm tra hiệu chế phẩm 92 Khóa luận tốt nghiệp Ngơ Bích Ngọc TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG ANH Basavaraj M, Shivayageeswar, E.N(2011),“Production and optimisation of tetracycline by various strains of Streptomyces under solid state fermentation using pineapple peel as a novel substrate ”,Recent Research in Science and Technology 3,pp 01-08 Bharathkumar, S, David, P.R.S, Brindha, P V., Kavitha, S., Gnanamanickam, S S (2008), “ Improvement of bacterial blight resistance in rice cultivars Jyothi and IR50 via markerassisted backcross breeding”, Journal of Crop Improvement, 21, pp 101-116 Bulletin, B O E (2007), “Xanthomonas oryzae pv oryzae”, 37, pp 543-553 Caffrey, P., Lynch, S., Flood, E., Finnan, S., Oliynyk, M (2001), “Amphotericin biosynthesis in Streptomyces nodosus: deductions from analysis of polyketide synthase and late genes”, journal of Biology Chemistry, 8, pp 713-723 Chand, T., Singh, N., Singh, H., Thind, B S (1979), “Field efficacy of stable bleaching powder to control bacterial leaf blight”, journal of Rice Research Newsletter, 4, pp 12-13 Das, S., Lyla, P S., Khan, S A (2008), “Distribution and generic composition of culturable marine actinomycetes from the sediments of Indian continental slope of Bay of Bengal”, Chinese Journal 0Ceanology Limnology, 26, pp 166-177 Furuya, N., Taura, S., Thuy, B T., Ton, P H., Hoan, N V., Yoshimura A, (2003), “Experimental technique for Bacterial Blight of Rice”, HAU-JICA ERCB Project, 25, pp 42-50 93 Khóa luận tốt nghiệp Ngơ Bích Ngọc Gnanamanickam, S S., Velusamy, P., Immanuel, J E., Thomashow, L S (2006), “Biological control of rice bacterial blight by plant-ass0Ciated bacteria producing 2,4-diacetylphloroglucinol”, Canadian Journal of Microbiology, 52, pp 5665 Gnanamanickan, S.S (2009), “Biological control of rice diseases”, Biological control of rice diseases, 8, pp 29-31 10 Gonzalaz, R I., Obregon, A M., Escalante, L., Sanchez, S (1995), “Gentamicin formation in Micromonospora purpurea: stimulatory efect of amanonium”, Journal of antibiotic, 48, pp 479-483 11 Gullo, V P., Zimmerman, S B., Dewey, R S., Hensens, O., Cassidy, P J (1982), “Factumycin, a new antinbiotic (A40A): Fermentation, isolation and antibacterial spectrum”, Journal of Antibiotic, 12, pp 1705- 1707 12 Hoa, P T P., Hop, D V., Quang, N Q., Ton, P H., Ha, T H., Hung, N V., Van, N T., Hai, T V., Quy, N T K., Dao, N T A., Thom, V T., (2014), “Biological Control of Xanthomonas oryzae pv oryzae pv Oryzae Causing Rice Bacterial Blight Disease by Streptomyces toxytricini (VN08-A-12), Isolated from Soil and Leaf-litter Samples in Vietnam ”, BioControl science, 19, pp 13 Howard, T D (1998), “The Production of Neomycin by Streptomyces fradiae in Synthetic Media ”, Applied Microbiology, 1, pp 103-106 14 Huang, N., Angeles, E R., Domingo, J., Magpantay, G., Singh, S., Zhang, G (1997), “Pyramiding of bacterial blight resistance genes in rice; marker- assisted selection using RFLP and PCR”, Theoretical and Applied Genetic, 95, pp 313-320 15 Islam, N., Bora, L C (1998), “Biologycal management of Bacterial leaf blight of rice (Oryza Santiva) with plant grow promoting Rhizobacteria”, Indian Journal of 94 Khóa luận tốt nghiệp Ngơ Bích Ngọc Agricultural Univercity, 12, pp 50-63 16 Ji, G.H, Wei, L.F, Wu, Y.P, Bai, X H (2008), “Biological control of rice bacterial blight by Lysobacter antibioticus strain 13-1”, Biological control, 45, pp 288296 17 Mew, T W., Alvarez, A M., Leach, J E., Swings, J (1993), “F0Cus on bacterial blight of rice”, Plant Disease, 77, pp 5-11 18 Mitchell, J I., Logan, P G., Cushing, K E., Ritchie, D A (2006), “Novobi0Cin resistance sequences from the novobi0Cin producing strain Streptomyces niveus ”, Molecular Microbiology, 10, pp 1365-2958 19 Miyadoh, S (2005), “ Actinomycetes: Isolation and their antibiotic screening”, VNU-CBT and NITE cooperation project 20 Ndonde, M J M., Semu, E (2000), “ Preliminary characterization of some Streptomyces species from four Tanzanian soils and their antimicrobial potential against selected plant and animal pathogenic bacteria”, World Journal of Microbiology and Biotechnology, 16, pp 595-599 21 Nguyen Thi Lang and Bui Chi Buu 2004 Molecular genetic analysis and markerassisted selection for restore line and bacterial blight resistance in hybrid rice SABRAO 36(2): 83-93 22 Ogawa, T., Sekizawa, K (1993), “Studies on the breeding of rice varieties resistant to bacterial leaf blight and test of the quantitative resistance of rice native varieties in Japan by clipping in0Culation methods”, Bulletin of Chugoku National Agricultual Experiment, 27, pp 19-36 23 Rafi, A., Akhtar, M A., Akmal, M., Bibi, A., Ali, M., Rahman, H., Junaid, M (2013), “Effect of planting dates on bacterial leaf blight incidence and yield performance of rice cultivars in different l0Cation of khyber pakhtunkhwa, pakistan", 95 Khóa luận tốt nghiệp Ngơ Bích Ngọc Sarhad Journal of Agriculture, 29, pp 408-414 24 Rosovitz, M.J, Voskuil, M.I, Chambliss, G.H(1998) Bacillus.In: A Balows and B.I.Duener (Eds), Systematic Bacteriology Arnold Press, London: 709 – 720 25 Tagami, Y., Mizukami, T (1962) (1962), “Historical review of the researches on bacterial blight of rice caused by Xanthomonas oryzae pv oryzae (Uyede and Ishiyama) Dowson”, Special Report of Plant Disease and Insect Pests Forecasting Service, 10, pp 1-112 26 Schatz, A., Bugie, E., Waksman, S A (1994), “Streptomycin, a substance exhibiting antibiotic activity against gram-positive and gram-negative bacteria”, journal of Biology and Medicine, 55, pp 66-69 27 Shang, K., Hu, H., Zhu, C., Zhu, B (2008), “Production of 4′- epidaunorubicin by metabolic engineering of Streptomyces coeruleorubidus strain SIPI-1482”, Journal of Microbiology and Biotechnology, 24, pp 1107- 1113 28 Shapiro, S., Vining, L C (1983), “Nitrogen metabolism and chloramphenicol production in Streptomyces venezuelae”, Canadian Journal of Microbiology, 29, pp 1706-1714 29 Srivastava, D N (1972),“ Bacterial leaf blight of rice”,Phytopathol,26, pp 1-16 30 Subramoni, S., Jha, G., Sonti, R V (2009), “Virulence functions of Xanthomonas,” Biological Control of Rice Diseases, 8, pp 535-571 31 Wang, Y G., Davies, J E., Hut Chinson, C R (1982), “Plasmid DNA in the erythromycin producing microorganism streptomyces erythreus NBRC 2338”, Journal of Antibiotic,, 35, pp 335-342 32 Weissbach, H., Redfield, B., Beaven, V., Katz, E (1965), “Actinomycin synthesis in washed cells of Streptomyces antibioticus”, journal of Biology Chemistry, 96 Khóa luận tốt nghiệp Ngơ Bích Ngọc 240, pp 4377-4381 33 Yoneyama, K., Sekido, S., Misato, T (1978), “Studies on the fungicidal action of dithiocarbamates effect of sodium dimethyldithi0Carbamate on fatty acid synthesis of Xanthomonas oryzae pv oryzae”, Annals of the Phytopathological S0Ciety of Japan, 44, pp 313-320 TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT 34 940 nghiên cứu sử dụng chế phẩm sinh học từ vi khuẩn đối kháng để kiểm sốt nấm hại trồng, Phịng Cơng nghệ Sinh học Enzyme, Viện Công nghệ Sinh học 37 Kiều Hữu Ảnh (1999), Giáo trình Vi sinh vật học cơng nghiệp, tập 1, Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội 41 Nguyễn Lân Dũng (2012), Giáo trình Vi sinh vật học, phần 3, Nhà xuất giáo dục Việt Nam 45 Nguyễn Thành Đạt, Thực hành vi sinh, 1990, NXB Nơng Nghiệp 47 Võ Bích Hạnh & cộng sự, “Nghiên cứu sản xuất chế phẩm BIO-F sản xuất phân bón hữu vi sinh từ rác thải sinh hoạt” Báo cáo khoa học đề tài, Viện Sinh học Nhiệt đới (2005) 42 Nguyễn Văn Hiển, giáo trình chọn giống trồng, NXB Giáo Dục 48 Vũ Triệu Mân, PGS TS Lê Lương Tề (1999), Bệnh vi khuẩn, vi rút hại nông nghiệp, NXB Nông nghiệp Hà Nội 36 K.E.Mucller (Hà Văn Chức dịch), Những thiệt hại ruộng lúa nhiệt đới – IRRI,1983 97 Khóa luận tốt nghiệp 46 Ngơ Bích Ngọc Tạ Minh Sơn, Bệnh bạc vi khuẩn (Xanthomonas oryzae pv oryzae) chọn tạo giống chống bệnh - Luận án Phó tiến sỹ khoa học, Viện khoa học kỹ thuật Nông nghiệp Việt Nam, 1987 38 Lê Lương Tề (1980), Bệnh bạc vùng đồng Sông hồng, Tuyển tập công trình nghiên cứu KHKT nơng nghiệp, NXB Nơng nghiệp Hà Nội 39 Lê Lương Tề, Bước đầu nghiên cứu độc tố Xanthomonin vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv oryzae gây bệnh bạc số giống lúa, Tạp chí Bảo vệ thực vật, số 5/2008 44 Nguyễn Xuân Thành, Dương Đức Tiến (2003), Vi sinh vật học nông nghiệp, Nhà xuất Đại học sư phạm, Hà Nội 35 Hà Minh Trung (1996), Hiện trạng triển vọng nghiên cứu bênh virut, vi khuẩn hại trồng Việt Nam, Tạp chí Bảo vệ thực vật 43 Nguyễn Văn Tuất cs(1996),Nghiên cứu đặc điểm hoá sinh,TC BVTV Số 40 Mai Văn Quyền (1969 – 1970), Ảnh hưởng loại phân vô đến phát sinh phát triển bệnh bạc vi khuẩn, Kết nghiên cứu khoa học nông nghiệp, NXB Nông nghiệp WEBSITE 49 http://www.vnast.gov.vn 50 http://en.wikipedia.org/wiki/Bacillus 98 ... chế phẩm vi sinh vật đối kháng với vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv oryzae gây bệnh bạc lúa? ?? Mục tiêu nội dung nghiên cứu 2.1 Mục tiêu Sản xuất chế phẩm vi sinh vật đối kháng thân thiện với mơi... vật đối kháng với vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv oryzae Nhằm phân lập tuyển chọn chủng vi sinh vật phù hợp với mục đích nghiên cứu: sử dụng chủng vi sinh vật có khả đối kháng với vi khuẩn Xanthomonas. .. phịng bệnh bạc vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv oryzae, phục vụ sản xuất an toàn 2.2 Nội dung - Tuyển chọn chủng vi sinh vật đối kháng với vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv oryzae - Nghiên cứu điều