Nghiên cứu phát triển và hoàn thiện quy trình PCR đa mồi để phát hiện trực tiếp streptococcus suis từ dịch não tủy của người (luận văn thạc sĩ)

Nghiên cứu phát triển và hoàn thiện quy trình PCR đa mồi để phát hiện trực tiếp Streptococcus suis từ dịch não tủy của người (luận văn thạc sĩ)Nghiên cứu phát triển và hoàn thiện quy trình PCR đa mồi để phát hiện trực tiếp Streptococcus suis từ dịch não tủy của người (luận văn thạc sĩ)Nghiên cứu phát triển và hoàn thiện quy trình PCR đa mồi để phát hiện trực tiếp Streptococcus suis từ dịch não tủy của người (luận văn thạc sĩ)Nghiên cứu phát triển và hoàn thiện quy trình PCR đa mồi để phát hiện trực tiếp Streptococcus suis từ dịch não tủy của người (luận văn thạc sĩ)Nghiên cứu phát triển và hoàn thiện quy trình PCR đa mồi để phát hiện trực tiếp Streptococcus suis từ dịch não tủy của người (luận văn thạc sĩ)Nghiên cứu phát triển và hoàn thiện quy trình PCR đa mồi để phát hiện trực tiếp Streptococcus suis từ dịch não tủy của người (luận văn thạc sĩ)Nghiên cứu phát triển và hoàn thiện quy trình PCR đa mồi để phát hiện trực tiếp Streptococcus suis từ dịch não tủy của người (luận văn thạc sĩ)Nghiên cứu phát triển và hoàn thiện quy trình PCR đa mồi để phát hiện trực tiếp Streptococcus suis từ dịch não tủy của người (luận văn thạc sĩ)Nghiên cứu phát triển và hoàn thiện quy trình PCR đa mồi để phát hiện trực tiếp Streptococcus suis từ dịch não tủy của người (luận văn thạc sĩ)Nghiên cứu phát triển và hoàn thiện quy trình PCR đa mồi để phát hiện trực tiếp Streptococcus suis từ dịch não tủy của người (luận văn thạc sĩ)Nghiên cứu phát triển và hoàn thiện quy trình PCR đa mồi để phát hiện trực tiếp Streptococcus suis từ dịch não tủy của người (luận văn thạc sĩ)

I HC QUC GIA H NI TRNG I HC KHOA HC T NHIấN - ng Th Kiu Oanh NGHIấN CU PHT TRIN V HON THIN QUY TRèNH PCR A MI PHT HIN TRC TIP Streptococcus suis T DCH NO TY NGI Chuyờn ngnh: Vi sinh vt hc Mó s: 60 42 40 LUN VN THC S KHOA HC NGI HNG DN KHOA HC: PGS.TS PHAN Lấ THANH HNG H Ni - 2013 T VN Trong nhng nm 1960s trờn th gii v vi nm gn õy ti khu vc chõu ú cú Trung Quc v Vit Nam, luụn cú s cnh bỏo v tm nghiờm trng ca vi khun Streptococcus suis (S suis) nh mt tỏc nhõn gõy bnh nguy him cho ngi v cú tim nng gõy cỏc v bựng phỏt dch Ti Vit Nam, nhim trựng cp tớnh ngi S suis ó v ang c coi l mt bnh nhim trựng mi ni, cú kh nng gõy t l t vong v di chng cao Rt nhiu trng hp mc bnh cú cỏc biu hin lõm sng rt nng nh: nhim khun huyt, viờm mng nóo cú ban xut huyt v hoi t, hi chng sc nhim trựng nhim c liờn cu S liu lõm sng s b ca mt s vin v bnh vin ln nh Vin Cỏc Bnh truyn nhim v Nhit i Quc gia, Bnh vin Ch Ry, Bnh vin Trung ng Hu ó cho thy S suis l mt nhng nguyờn nhõn ch yu gõy bnh nhim khun huyt v viờm mng nóo m ngi ln ti Vit Nam cỏc nc cú nn kinh t phỏt trin, vic chn oỏn S suis bi cỏc k thut nuụi cy phõn lp kinh in hoc phỏt hin khỏng nguyờn c hiu bng cỏc k thut dch hc, thm cỏc k thut sinh hc phõn t rt ph bin Vit Nam, vỡ s khụng ng b v c s vt cht, trang thit b cng nh s khụng n nh v k nng thc hnh chn oỏn phũng thớ ngim, nhng phng phỏp sinh hc phõn t hin i nhm chn oỏn S suis rt khú cú th ỏp dng rng rói Tuy nhiờn cỏc phng phỏp hin i, nhanh v chớnh xỏc, phng phỏp PCR a mi (nhõn gen a mi) l phng phỏp cú tớnh kh thi hn c v mt kinh t v k nng thc hin so vi phng phỏp PCR nh lng (Real time PCR) Vi phng phỏp PCR a mi, chỳng ta cú th ng thi phỏt hin c s cú mt ca vi khun S suis, xỏc nh c typ huyt (typ 2) v cú th mt hoc vi gen c lc ca vi khun Phng phỏp ny giỳp tit kim sinh phm, thi gian, cụng sc v cú c hiu cao Chớnh vỡ vy, chỳng tụi ó thc hin ti Nghiờn cu phỏt trin v hon thin quy trỡnh PCR a mi phỏt hin trc tip Streptococcus suis t dch nóo ty ca ngi vi mc tiờu chớnh sau õy: - Xõy dng quy trỡnh PCR a mi phỏt hin trc tip S suis bnh phm ngi; - Xõy dng quy trỡnh x lý bnh phm n gin, d thc hin bc l DNA ca S suis CHNG TNG QUAN 1.1 GII THIU V S.suis 1.1.1 Gii thiu chung Streptococcus suis l vi khun Gram dng, k khớ tựy tin, kớch thc khong 1àm, khụng cú lụng, khụng sinh nha bo Trong bnh phm, chỳng thng xp thnh chui hoc thnh ụi (Hỡnh 1.1) S.suis cú yu t quyt nh khỏng nguyờn liờn quan n nhúm D theo phõn loi ca Lancefield, mc dự v mt di truyn, vi khun ny khụng cú s liờn quan n thnh viờn khỏc ca nhúm ny Thi im ban u, theo h thng phõn loi ca Lancefield, S suis thuc nhúm R, S v T tng ng vi cỏc type huyt 2, v 15 [Error! Reference source not found.] Nhng n nm 1995, da vo cu trỳc v cỏc nh khoa hc ó nghiờn cu c S.suis cú tng cng 35 type huyt (t typ n typ 34 v typ 1/2 ) [Error! Reference source not found.] nhng typ 32 v 34 va c chng minh l Streptococcus orisratti Mc dự vy, cỏc chng gõy bnh cho ngi ỏng chỳ ý l typ 1, 2, 14, chỳng cú th thay i theo vựng v theo thi gian [Error! Reference source not found.] Nhng typ gõy bnh nhim trựng nghiờm trng ln v l kiu huyt ph bin nht nh hng n ngi rng rói trờn ton th gii, cú rt ớt trng hp gõy bnh ngi typ v typ 14 Vi khun S suis phỏt trin iu kin mụi trng cú 5- 10% CO2, mc trờn cỏc mụi trng nuụi cy giu cht dinh dng nh mụi trng thch mỏu, thch Chocolate, nhng mc tt nht trờn mụi trng Columbia, nhit thớch hp 370C, nhng cú th phỏt trin c mt khong nhit rt rng 10 450C, pH thớch hp 77,2 Sau 24 gi, 370C, vi khun mc to nhng khun lc nh, trũn, li, b u, mu xỏm hoc sut, hi nhy S suis gõy tan huyt dng alpha trờn mụi trng thch mỏu cu v tan huyt dng beta trờn mụi trng thch mỏu nga Mc dự chc nng ca 20-30% b gen cha c bit nhng nhiu gen úng vai trũ bnh sinh nhim trựng ó c nghiờn cu ú l nhng gen chu trỏch nhim sn xut polysacarit, chuyn v, cỏc yu t hn ch st, yu t ly gii, cỏc protein liờn quan n c lc, cỏc enzym, h thng arginine deminase v cỏc protein gn IgG Cú 17 chng S suis ó c gii trỡnh t gen Tựy tng chng, b ben cú kớch thc t 2,01 n 2,18 Mb vi t l GC t 41 n 41,7% Trong b gen ca 17 chng cha t 1607 n 2427 gen v cú t 1559 n 2334 loi protein1.1.2 Mt s yu t c lc chớnh ca vi khun liờn quan n chn oỏn *V polysacarit ca vi khun S suis cú lp v polysacarit chc chn (capsular polysaccharide - cps) Vic nh typ huyt vi khun da trờn cu trỳc khỏng nguyờn ca lp v ny Trong cỏc loi typ huyt thanh, cỏc typ 1,2,7 v c cho l cú liờn quan nhiu hn n bnh nhim trựng liờn cu khun ln Tuy nhiờn, kh nng nhim a typ cng cú th xy Lp v typ bao gm cỏc loi ng: Galactose, glucose, Nacetyl glucosamine, N-acetyl galactosamine v sialic acid typ 2, N-acetyl glucosamine c thay th bng rhamnose c im cu trỳc ca lp v cỏc typ khỏc cha c nghiờn cu sõu *Suilysin Suilysin l mt yu t gõy tan huyt c mó húa bi gen sly ca S suis Protein suilysin thuc nhúm cỏc c t kt hp vi cholesterol v cú tng ng cao vi pneumolysin (yu t ly gii t bo ca Streptococcus pneumoniae) Gen sly cú mt hu ht cỏc typ Nghiờn cu ca Takamatsu v cs (2002) cho rng gen sly cú th cú ngun gc ngoi lai Suilysin cú kh nng gõy tn thng t bo v lm tng kh nng xõm nhp ca vi khun (thớ nghim c tin hnh in vitro s dng cỏc t bo biu mụ v cỏc t bo dch) Ngoi ra, suilysin cũn cú th "khi ng" cho quỏ trỡnh sn xut v tỏc ng ca cỏc cytokine Thớ nghim s dng cỏc dng t bin ca sly cho thy mc nh hng khỏc ca suilysin tựy thuc vo vt ch, loi t bo v loi t bin Tuy khỏng th chng suilysin cú tỏc dng bo v nht nh, cỏc th nghim gõy nhim trờn ng vt vi cỏc chng mang suilysin cho rng suilysin khụng phi l yu t thit yu cho c lc ca liờn cu khun *H thng Arginine deminase Nm 2002 Winterhoff v cỏc cng s ó xỏc nh c protein b mt vi khun cú kớch thc 47 kDa v 53 kDa Hai protein ny cú mc tng ng cao vi h thng arginine deminase (ADS) ca S pyogenes Protein 47 kDa tng ng vi ornithine carbamoyl transferase cũn 53 kDa tng ng vi streptococcal acid glycoprotein (SAGP) ADS l h thng enzym cung cp ATP t quỏ trỡnh bin i arginine thnh ornithine Hot ng ca ADS cú th xy pH thp H thng ADS cú mt tt c cỏc chng vi khun S suis *Protein c gii phúng muramidase (muramidase-released protein; mrp) v yu t ngoi bo (extracellular factor- ef) Hai yu t mrp v ef hin din hu ht cỏc chng vi khun phõn lp t ng vt b bnh nhng tn s xut hin ca chỳng khụng cao cỏc ng vt truyn bnh cỏc chng gõy bnh trờn ngi, mt s nghiờn cu cho thy t l 69, 6% s chng phõn lp c mang gen mrp Mrp v ef cng c coi l cỏc yu t ch th cho S suis typ Cỏc chng vi khun cú c lc yu cng cú kh nng sn sinh mrp v bin th ca ef (ký hiu l ef*) Vi cỏc chng thuc typ 2, allen ca gen mó húa ef ó c xỏc nh Bin th mrp nh (small mrp; mrps) hin din typ v mrp ln (large mrp; mrp*) cú mt typ Cỏc chng Canada khụng cú mrp v ef ó cú nghiờn cu gõy nhim trờn ln cho rng typ v t bin thiu hon ton hai protein ny cú c lc chng khỏc gỡ vi khun th hoang di Tuy vy vai trũ ca chỳng ỏp ng dch cn c lm sỏng t bng cỏc thớ nghim gõy nhim thc nghim 1.1.3 C ch gõy bnh ca S.suis Quỏ trỡnh xõm nhp S tn ti ca vi khun mỏu v s lõy nhim Hin tng viờm v sc nhim trựng S xõm nhp h thn kinh trung ng v viờm mng nóo 1.2 S LY NHIM TRấN NGI CA S.suis S suis ln u tiờn c bỏo cỏo bi cỏc bỏc s thỳ y nm 1954, sau bựng phỏt dch viờm mng nóo, viờm khp nhim khun huyt, v cú m xy ln [Error! Reference source not found.] Sau ú, vo nm 1968, bnh S suis c ghi nhn ngi qua mụ t ln u tiờn v trng hp viờm mng nóo m v mt trng hp nhim trựng huyt nng ti an Mch T ú, bnh c ghi nhn cỏc nc khỏc thuc Chõu u (Anh, H lan,) v Hng kụng [Error! Reference source not found.] Ti Anh, khong t nm 1975 n nm 1990, cú tt c 35 trng hp nhim Streptococcus suis c bỏo cỏo, s ú, 34 trng hp bnh nhõn nam 25 bnh nhõn ó c xỏc nhn b nhim Streptococcus suis t nm 1984 v 1993 Hng Kụng Trong s ú, 15 trng hp (60%) ó cú mt tip xỳc vi ln hoc tht ln Xột nghim dch nóo ty ca 21 bnh nhõn ó xỏc nhn s hin din ca viờm mng nóo, bnh nhõn cũn li b viờm khp, viờm ph qun phi, viờm ni tõm mc v st [Error! Reference source not found.] Cú trng hp nhim S suis Nht Bn t nm 1994 n 2006 Tt c cỏc trng hp cú tip xỳc vi ln v ngi s h ó cú tn thng da tay quỏ trỡnh tip xỳc trng hp trờn cú cỏc triu chng ca viờm mng nóo, nhim trựng huyt, v cú trng hp ó t vong Tt c S suis c phõn lp thuc nhúm D theo phõn loi ca Lancefield v týp huyt Chỳng nhy cm vi penicillin G, ampicillin, cefotaxim, v ciprofloxacin Tuy nhiờn, sỏu s chỳng cú kh nng khỏng c erythromycin v clindamycin, v cng khỏng vi minocycline [Error! Reference source not found.] T ngy 1/1/2003-31/7/2005, cú 21 trng hp c xỏc nh l nhim S suis , ú cú trng hp (5%) t vong, 18 trng hp (86%) l nam gii v trng hp (14%) l n tui trung bỡnh l 62 tui (t 26-89 tui), 12 trng hp (57%) phỏt bnh thỏng 5, thỏng 6, thỏng hoc thỏng H sng cỏc huyn khỏc Hng Kụng v khụng cú phõn nhúm a lý [Error! Reference source not found.] Gn õy, thỏng 7-8/2005, ti tnh Sichuan, Trung Quc ó xy mt v dch ln S suis lõy truyn t ln sang ngi Tng s 215 ngi mc, ú, 61 (ngi) 28% trng hp nhim khun huyt cú sc nhim trựng nhim c, 38 ngi cht (62%), 48% viờm mng nóo m T l t vong trung bỡnh ca tt c cỏc trng hp > 20% Mt s trng hp sau khi bnh nhim khun S suis cp tớnh b nhng di chng nh ic khụng hi phc, mt thng bng [Error! Reference source not found.] Tng s ngi nhim S suis bỏo cỏo cho n thỏng nm 2006 400, v gn 90% cỏc trng hp ny xy Trung Quc, Thỏi Lan, Hng Kụng, i Loan, v H Lan Tt c cỏc trng hp ngi nhim S suis ó bỏo cỏo hu ht l typ 2, ngoi tr trng hp typ huyt 1, trng hp typs huyt 4, v trng hp typ kiu huyt 14 [Error! Reference source not found.] S lng trng hp lõy nhim S suis ngi bỏo cỏo ó tng ỏng k Trong mt bi bỏo xut bn nm 2007, 409 trng hp nhim S suis ngi c bỏo cỏo, hu ht s ú xy Trung Quc, Thỏi Lan v H Lan, 73 trng hp b t vong [Error! Reference source not found.] T 2000-2011, bnh nhõn b nhim S suis ó c xỏc nh i Loan Sỏu trng hp ban u c xỏc nh nhm l Streptococcus acidominimus, nhng sau gii trỡnh t gen 16S rRNA ca chng phõn lp c thỡ chỳng c xỏc nh l S suis a s cỏc trng hp trờn c xỏc nh l S.suis typ [Error! Reference source not found.] Trong s 116 trng hp viờm mng nóo S suis Bnh vin Bnh nhit i Thnh ph H Chớ Minh t nm 1997 n nm 2005, 115 trng hp dotyp huyt v trng hp typ huyt 14 [Error! Reference source not found.] Trong hai nm 2005 - 2006, cú 72 trng hp nhim S.suis nhp Bnh vin Bnh nhit i Thnh ph H Chớ Minh, 58 bnh nhõn (81%) l nam gii Phn ln bnh nhõn l nụng dõn, 38% bnh nhõn cú tin s tip xỳc vi ln hay tht ln, nhiờn ch cú bnh nhõn (8%) cú tn thng da nghi ng 69 bnh nhõn (96%) biu hin bnh cnh viờm mng nóo nh: st, nhc u, úi, c cng, ri lon tri giỏc l nhng triu chng thng gp 68% trng hp viờm mng nóo m cú triu chng ự tai, ic Mt bnh nhõn nhim khun huyt b sc nhim c t liờn cu Sau 10 n 14 ngy dựng khỏng sinh Ceftriaxone, hu ht bnh nhõn u hi phc Tt c cỏc chng vi khun phõn lp c cũn nhy cm vi penicillin v ceftriaxone [1, Error! Reference source not found.] T thỏng 1/2007 n thỏng 09/2008 : 68 trng hp ti Bnh vin Nhit i trung ng T thỏng 1/2006 n thỏng 12/2010 cú hn 140 trng hp viờm mng nóo v nhim trựng huyt ti Bnh vin Trung ng Hu 1.3 BNH V TRIU CHNG 1.3.1 ng lõy truyn Streptococcus suis cú th lõy truyn qua ngi tip xỳc vi ln bnh hay ln mang vi khun qua cỏc tn thng nh, try xc trờn da ca nhng ngi git m, ch bin v n tht ln bnh hay ln mang vi khun nu khụng chớn Hin nay, cha cú bng chng bnh liờn cu khun cú th lõy trc tip t ngi sang ngi Ln mang vi khun l ngun lõy nhim chớnh Bnh cú th truyn qua ng hụ hp, cỏc cht bi tit, mỏu ca ln bnh, lõy lan thụng qua tip xỳc trc tip hoc lõy qua kim tiờm nhim khun.Vi khun cú th cú mt hch hnh nhõn ca ln sau ó c iu tr bng khỏng sinh penicillin Ln nỏi cú th mang vi khun t cung v õm o Ln cú th b nhim vi khun bt k tui no Kh nng nhim v gõy bnh ca vi khun ln cao hn ln trng thnh Cỏc n ln non trng thỏi chu stress v tip xỳc vi ngun bnh s cú kh nng phỏt bnh cao 1.3.2 Triu chng Th lõm sng thng gp nht ngi mc bnh nhim trựng S suis l viờm mng nóo m (72,5%), nhng mt t l ỏng k (24,2%) thng gp l th nhim khun huyt cú sc nhim trựng nhim c, cú biu hin suy a ph tng, viờm ni tõm mc (1,1%), viờm khp (1,1%), viờm phi (0,8%) v viờm phỳc mc (0,3%) th viờm mng nóo m, bnh nhõn b st cao, au u, n lnh, bun nụn, nụn v chúng mt Tip theo cú th cú mt hay nhiu triu chng sau: ic, mt thng bng, hụn mờ, cng gỏy, xut huyt, au khp, lit ngoi vi hoc lit mt, au c nghiờm trng, bm tớm ban th sc nhim trựng nhim c, bờn cnh st cao, n lnh, au u, nụn, chúng mt, au bng cũn thờm cỏc du hiu khỏc nh h huyt ỏp, tim p nhanh, suy gan, chy mỏu di da, ụng mỏu ni mch ri rỏc, suy thn cp, hi chng suy hụ hp cp T l t vong bnh nhõn mc th ny rt cao (>60%) 1.3.3 Bin phỏp phũng bnh Tuyờn truyn trờn cỏc phng tin thụng tin truyn thụng ngi dõn bit v ch ng phũng trỏnh bnh liờn cu khun ln [1]: - Nờn chn mua tht ln ó qua kim nh ca c quan thỳ y - Trỏnh mua tht ln cú mu khỏc thng, xut huyt hoc phự n - Nu chớn tht ln l iu rt quan trng (T chc Y t Th gii - WHO khuyn cỏo trờn 700C) Khụng n ln cht, khụng n cỏc mún n tỏi, c bit l tit canh ln thi gian cú dch - Nhng ngi cú vt thng h phi eo gng tay tip xỳc vi tht ln tỏi hoc sng - Phi gi cỏc dng c ch bin ni sch s, sch tay v cỏc dng c ch bin sau tip xỳc,ch bin tht ln Dựng riờng cỏc dng c ch bin tht sng v tht chớn 1.3.4 Bin phỏp chng dch Khi nhn thy cú dch liờn cu khun, xy thỡ phi x lý ỳng nh x lý mt dch truyn nhim [1]: - Tng cng giỏm sỏt phỏt hin cỏc trng hp b bnh nghi nhim liờn cu khun ln ngi, nờn a n bnh vin t chc cu cha kp thi c bit chỳ ý giỏm sỏt nhng i tng cú tip xỳc gn vi ln b bnh nh ngi chn nuụi, git m v buụn bỏn ln - Nghiờm cm hon ton vic di chuyn v git m ln Khụng git m,vn chuyn ln bnh, ln cht phi tiờu hu ỳng cỏch 1.3.5 Nguyờn tc iu tr - Lu ý phỏt hin sm cỏc trng hp cú biu hin viờm mng nóo v cú tip xỳc vi ln b bnh, chn oỏn v iu tr kp thi nhm gim t l t vong bin chng gõy - iu tr khỏng sinh c hiu Penicilline liu cao: ung, tiờm bp hoc truyn tnh mch, thng phi iu tr trờn 10 ngy Cú th dựng cỏc khỏng sinh khỏc cng hiu qu nh: Ampicilline, Erythromycine hoc nhúm Cephalosporine - iu tr triu chng v ỏp dng cỏc bin phỏp hi sc tớch cc - Lc mỏu nu cú iu kin 1.4 CC PHNG PHP CHN ON PHềNG TH NGHIM Nuụi cy phõn lp Nhum Gram Phn ng catalase Xột nghim nh danh, nh typ: Phỏt hin vi khun S suis bng phn ng Realtime PCR 1.5 PHNG PHP PCR 1.5.1 Gii thiu v phng phỏp khuch i gen (polymerase chain reaction PCR) PCR l mt k thut sinh hc phõn t khuch i mt hoc mt vi bn ca mt on DNA, to hng ngn, hng triu bn ca mt on DNA cú trỡnh t c th K thut PCR ó c phỏt trin vo nm 1984 bi mt nh húa sinh ngi M tờn l Kary Mullis Mullis nhn c gii Nobel v gii thng ca Nht Bn phỏt trin PCR 1993 Tuy nhiờn nguyờn lý c bn ca vic chộp mt phn ca DNA bng cỏch s dng hai mi ó c Gobind Khorana mụ t vo nm 1971 Hin nay, k thut PCR c s dng rt ph bin y t, phũng thớ nghim sinh hc v nhiu ng dng khỏc K thut PCR cú tim nng tr thnh mt nhng k thut sinh hc phõn t c s dng rng rói nht vỡ nú cho kt qu nhanh, chi phớ r v n gin K thut ny cho phộp khuch i mt on DNA c th c s lng DNA ớch rt thp Phỏt trin k thut PCR c coi l mt nhng bc t phỏ s phỏt trin ca nn khoa hc th gii [Error! Reference source not found.] 1.5.2 Nguyờn lý c bn ca k thut PCR PCR l mt phn ng dõy chuyn: Phõn t DNA c s dng to 2, 4, bn S nhõn lờn liờn tc ca DNA c thc hin bi cỏc protein c th l polymerase, enzyme ny cú kh nng tng hp cỏc chui DNA t cỏc nucleotit thc hin tng hp DNA cn cú loi nucleotit l adenine (A), thymine (T), cytosine (C) v guanine (G) PCR l mt phng phỏp c s dng to nhiu bn ca bt k si axit nucleic no õy l mt phng phỏp khuch i mt cỏch chn lc mt on DNA ca h gen Trong quy trỡnh PCR gc ca Mullis, DNA si kộp c tỏch thnh hai si n ca DNA bng cỏch nung núng nú n 96 C Tuy nhiờn, nhit ny, DNA polymerase ca E.Coli b phỏ hy, cn phi b sung cỏc enzyme mi sau giai on nung núng ca mi chu k Quy trỡnh PCR ny khụng hiu qu vỡ nú ũi hi nhiu thi gian, s lng DNA polymerase ln, v s theo dừi liờn tc sut quỏ trỡnh PCR [Error! Reference source not found.] 1.5.3 Gii thiu v phn ng PCR a mi 1.5.3.1 Gii thiu chung PCR a mi l mt loi phn ng khuch i gen nhng khụng phi ch khuch i mt trỡnh t gen ớch m cú th cựng mt lỳc khuch i hai hay nhiu hn hai trỡnh t gen ớch khỏc s dng hai hay nhiu loi mi khỏc (primers) vi cựng mt quy trỡnh khuch i cựng mt ng phn ng Do ú, s dng PCR a mi cú th tit kim c thi gian, cụng sc xột nghim v cú kh nng phỏt hin c hai hay nhiu tỏc nhõn gõy bnh cựng mt lỳc Phõn tớch c cỏc sn phm khuch i (sn phm PCR) ca mi mt cỏ th (hay mt tỏc nhõn gõy bnh) t hn hp cỏc sn phm PCR ó lm cho phng phỏp PCR a mi tr thnh mt phng phỏp sng lc nhanh chúng, tin li cho c lõm sng v nghiờn cu Trong lnh vc cỏc bnh nhim trựng, PCR a mi l cụng c cú giỏ tr vic nh danh vi rỳt, vi khun v ký sinh trựng 1.5.3.2 Ti u húa cỏc thnh phn phn ng PCR a mi Ti u húa cỏc thnh phn phn ng PCR a mi cú c hiu qu cao nht s dng PCR a mi phỏt hin gen ớch ngi ta phi chỳ ý nhiu hn ti mi khớa cnh ca k thut PCR nh mi (v trớ, trỡnh t, hm lng, nhit bt cp); hm lng Taq polymerase; nng MgCl2; s tng quan gia cỏc thnh phn phn ng v gen ớch thờm na l cỏc loi thch in di v nng thch phi hp Mt nhng khỏi nim quan trng nht ca PCR l s phự hp ti u ca t l mi (primer) v khuụn (DNA ca t bo ớch hay template) Nu t l ny quỏ cao, sn phm trựng hp mi c hỡnh thnh, nh xy ta pha rt loóng khuụn hoc cho d tha mi Mi luụn phi mc d tha 107 phõn t i vi khuụn Trong hu ht cỏc ỏp dng, khụng k n nng ca khuụn, nng mi khụng c tng vt quỏ 0,5àM vỡ sn phm trựng hp mi s c to nờn T l mi khuụn quỏ thp, sn phm s khụng c tng lờn theo s m bi vỡ cỏc chui ớch mi c tng hp s tr li bn cht gc ban u sau quỏ trỡnh bin tớnh (hin tung ny lm gim sn lng mt cỏch ỏng k) hoc c ch s hỡnh thnh sn phm PCR Do ú, iu quyt nh t l mi-khuụn l lng v phc hp ca khuụn c a vo phn ng PCR trỏnh s hỡnh thnh cỏc sn phm khụng c hiu (cỏc dimer) La chn mi: Chiu di ca mi mi khong 18-24 bp, nu mi cú di ln hn (3035bp) thỡ dng nh cng hot ng iu kin chu k tng t nh mi cú di ngn, vy mi di ln cú kh nng to cỏc sn phm chớnh, ngn cỏc sn phm ph phn ng a mi Nu cú th, trỡnh t ca mi mi nờn c bt u v kt thỳc bi 1-2 cp GC Hai mi cp cn phi cú nhit tan chy Tm gn iu kin chu k v nng m phi iu chnh cõn xng vi mi cp primer vic khuch i cỏc vựng ớch c c hiu Nng mi Thụng thng, mi phn ng PCR n (khuch i mt vựng), nng phõn t dựng cho mi mi t 100 500 nM Trong phn ng PCR a mi, lng mi cú th thay i t 500nM n 15nM (trong nghiờn cu, kt qu cho thy nu nng mi 15nM s khụng nhỡn thy sn phm, 30 nM cho sn phm ớtv sn phm PCR xut hin rừ nht nng 200nM) Cỏc nghiờn cu ó ch rng nờn trỏnh s dng lng mi quỏ cao hoc quỏ thp Lng mi quỏ cao cú th gõy c ch phn ng PCR a mi, nhng ngc li lng mi quỏ ớt thỡ khụng cú sn phm khuch i Khi phn ng khuch i din khụng t yờu cu, sn phm ớt nờn khú nhn thy mc dự ó ti u cỏc iu kin ca chu k phn ng thỡ vic thay i t l cỏc mi khỏc phn ng l cn thit, bng cỏch tng lng mi cho sn phm yu hn (vựng yu) v gim lng mi cho sn phm mnh hn (vựng mnh) Nng cui cựng ca cỏc mi (t 40 -500nM) cú th thay i ỏng k vũng vựng ny v thng c thit lp theo kinh nghim [Error! Reference source not found.] Vi DNA cú s copy thp hoc cú tớnh phc cao thỡ nng mi nờn dựng t 300nM - 500nM (0,3 0,5àM) i vi DNA cú s copy cao hoc tớnh phc thp nng mi c khuyờn l t 40nM 400nM (0,04-0,4àM) [Error! Reference source not found.] S cõn xng gia lng mi v lng DNA khuụn (DNA ớch) vy hai cp mi Cps2J v Sly u hot ng rt tt c t hp i vi cỏc t hp mi t n 4, cỏc vch DNA l sn phm ca mi c hiu cho S.suis 16S rDNA u biu hin tt.Tuy nhiờn TH3 v TH4, c sn phm ca cp mi Mrp cú kớch thc 188 bp u khụng biu hin Tt c cỏc t hp t n 8, sn phm ca cp mi Gdh v Cps2J biu hin khụng rừ rng Ch cú TH1 v TH2, sn phm ca tt c cỏc cp mi u c biu hin, cỏc vch DNA phõn tỏch rừ rng, d quan sỏt bp M TH9 TH10 TH11 TH12 TH13 TH14 TH15 TH16 500 300 200 100 Hỡnh 3.2.Th nghim cỏc t hp mi phự hp (t t hp n t hp 16) M: thang chun DNA c 100bp; TH: T hp mi Hỡnh 3.2 cho thy sn phm ca cỏc t hp mi t n 12 u c biu hin trờn bn gel nhng nhng vch ny rt m; t hp 15 v 16, cỏc sn phm hin rừ nột hn Tuy nhiờn, kt qu in di sn phm ca cỏc cp mi trờn u xut hin nhng vch DNA khụng c hiu t hp 13 v 14, sn phm ca cỏc cp mi u biu hin y v rừ nột, hn na khụng xut hin sn phm ph kt qu in di Nh vy, t cỏc th nghim trờn cho thy 24 t hp mi, ch cú t hp mi 1, 2, 13 v 14 l phự hp v cho kt qu rừ rng s dng phỏt hin S.suis bng phng phỏp PCR a mi Bng 3.2 Cỏc t hp mi thớch hp c la chn thớ nghim T hp T hp Loi mi c hiu cho Typ huyt Enzym ly gii S suis t bo (KTSP : 294 bp) (KTSP: 498bp) (KTSP: 248 bp) 16S rDNA Cps2J 22 Sly Enzym khỏc (KTSP: 118 bp) - T hp 16S rDNA Cps2J Sly arcA T hp 13 16S rDNA Cps2JJ Sly - T hp 14 16S rDNA Cps2JJ Sly arcA 3.1.3 Xỏc nh iu kin ti u ca phn ng PCR a mi phỏt hin S suis v mt s yu t c lc ph bin Bng 3.3 nh hng ca cỏc chu trỡnh PCR n kh nng phỏt hin S.suis Cỏc iu kin phn ng c th nghim nh hng tt n kh nng phỏt hin ca PCR Khụng tỏc ng n kh nng phỏt hin ca phn ng PCR Thờm bc gia nhit ph lỳc u X Tng thi gian bt cp X Tng s chu k chớnh X Tng c thi gian bt cp v s chu k chớnh X Tng thi gian kộo di cui cựng X Thay i nhit bt cp + ln lt nhng thay i trờn X Thờm chu trỡnh nhit ph (gm bc gia nhit) trc vo chu trỡnh nhit chớnh X Thờm chu trỡnh nhit ph, thay i thi gian kộo di X Thờm chu trỡnh nhit ph, thay i thi gian bt cp, tng dn s chu k chớnh X Thờm chu trỡnh nhit ph, thay i nhit bin tớnh, tng s chu k chớnh X C th: - Thờm chu trỡnh nhit ph: cú chu k ca: 960C x phỳt; 600C x 30 giõy; 720C x phỳt - Nhit bt cp thớch hp, thi gian v s chu k hp lý chu trỡnh chớnh: l chu trỡnh nhit th hai vi 40 chu k ca: 940C x 30 giõy; 600C x 30 giõy; 720C x phỳt - Thi gian kộo di sn phm giai on nhit cui cựng: 720C x phỳt 23 Sn phm ớch rừ nột, khụng cú hin tng cnh tranh Kt qu c minh hỡnh 3.3 Hỡnh 3.3 PCR a mi vi cỏc iu kin phn ng ti u phỏt hin trc tip S suis bnh phm M: thang DNA chun 100bp Sp1: chng vi khun S suis chun (S suis + TE) Sp2: Bnh phm mụ phng (DNT cha S suis ó chun ) 1: Sn phm PCR i din cho typ HT 2: Sn phm PCR vi mi c hiu S suis 3: Sn phm PCR i din enzym ly gii ca S.suis 3.1.4 Ti u húa cỏc thnh phn tham gia phn ng PCR a mi phỏt hin vi khun S suis v mt s yu t c lc ph bin Bng 3.5 Thnh phn tham gia phn ng PCR a mi c kho sỏt Thnh phn c th nghim Tng hm lng Taq polymerase > 1,5u/p nh hng tt n kh nng phỏt hin ca PCR Khụng tỏc ng n kh nng phỏt hin ca phn ng PCR/nh hng xu X Gim hm lng Taq polymerase < 1,5u/p X Tng hm lng dNTPs > 200àM X Gim hm lng dNTPs < 200àM X 24 Tng nng MgCl2 > 1,5mM X Gim nng MgCl2 < 1,5mM X Tng hm lng tt c cỏc mi > 10 50 pmol /p Khụng rừ rng Gim h/lng tt c cỏc mi < 10pmol/p X Thay i nng khỏc gia cỏc mi X Thay ụi hm lng t bo ớch: tng th tớch bnh phm X Thay ụi hm lng t bo ớch: gim th tớch mu, pha loóng bp X Bng 3.5 cho thy hng lng Taqpolymerase >1,5u/p, hm lng dNTPs = 200 àM, nng MgCl2 > 1,5mM, t l cỏc mi v hm lng t bo ớch phự hp s nh hng tt n hiu qu phỏt hin S.suis ca quy trỡnh PCR a mi c xõy dng 3.1.4.1 Ti u húa nng mi tham gia phn ng C(-) 104 103 10 10 M bp 500 300 100 Hỡnh 3.4 Th nghim hm lng cỏc mi vi nng mi mi l 20pmol/àl M: thang chun DNA c 100bp; C (-): chng õm Nng vi khun t 104vk/àl n 10 vk/àl 25 Hỡnh 3.4 cho thy, nng 104vk/àl v 103vk/àl, c sn phm DNA ca cp mi cps 2J, 16S rDNA v Sly u biu hin, nhiờn vch sn phm ca cp mi cps 2J biu hin yu hn sn phm ca cp mi cũn li nng 102 v 10 vk/àl, sn phm ca cp mi cps 2J khụng biu hin, ch xut hin sn phm ca cp mi cũn li iu ny cú th sc cnh tranh ca cp mi cps 2J yu hn hm lng DNA ca vi khun phn ng nng thp Vỡ vy khc phc thc trng ny, chỳng ta cú th gim hm lng ca mi mnh 16S rDNA, Sly v tng nng ca mi cps2J bp M 103 102 10 C (-) 500 300 100 Hỡnh 3.5 Th nghim hm lng mi vi nng mi khỏc (cps2J = 40pmol/àl, Sly = 16S rDNA= 10pmol/àl) M: thang chun DNA c 100bp;C (-): chng õm Nng vi khun t 103vk/àl n 1vk/àl Vi nng ca cỏc cp mi Sly, 16S rDNA v cps2J tng ng l 10, 10 v 40pmol/àl, c vch sn phm DNA u xut hin rừ nột tt c cỏc nng vi khun t 103 n vk/àl Nh vy, vi nng cỏc mi nh trờn thỡ nhy ca quy trỡnh PCR t ti nng vi khun/àl nhy tng ỏng k so vi vic s dng mi cp mi vi nng 20pmol/àl (ch phỏt hin n 103vk/àl) 26 3.1.4.2 Ti u húa hm lng DNA khuụn bp M DNA chun A2 B2 A1 B1 500 300 100 Hỡnh 3.6 Th nghim Quy trỡnh PCR ó xõy dng trờn mu bnh phm vi cỏc th tớch mu khỏc M: thang chun DNA c 100bp; DNA chun: chng dng A2: 2àl mu A, B2: 2àl mu B, A1: 1àl mu A, B1: 1àl mu B Kt qu in di sn phm ca mu A2 v B2 ch xut hin vch DNA l sn phm ca cp mi Sly (kớch thc 248 bp) v 16S rDNA (kớch thc 294 bp), mu A1 v B1 xut hin y sn phm ca c cp mi Nh vy, vic s dng th tớch mu ớt hn (1àl) s lm tng kh nng biu hin ca sn phm cng nh lm tng hiu qu ca quy trỡnh PCR a mi c xõy dng S phự hp v nng ca gen ớch (hay lung th tớch bnh phm) vi hm lng cỏc thnh phn c bn ca phn ng cng úng vai trũ quan trng vic xỏc nh cỏc gen ớch ú Quỏ trỡnh th nghim ca chỳng tụi ó chng minh s c ch quỏ trỡnh to sn phm PCR phn ng PCR a mi l th tớch khuụn DNA ln hn yờu cu gõy nờn Trong nhng trng hp nghi ng, tng kh nng phỏt hin ti a vi khun cú mt bnh phm, chỳng tụi ó phi gim th tớch khuụn ớch (pha loóng bnh phm v gim th tớch khuụn ớch) cựng vi vic m bo cỏc iu kin ti u khỏc ca PCR Nh vy quy trỡnh PCR a mi ti u c xõy dng nh sau Thnh phn phn ng: - Taq polymerase: 2,5 n v/1 phn ng 200àM mi loi dNTP MgCl2: 2,5 - mM/1 phn ng Thnh phn v nng cỏc cp mi + Mi 16SrDNA: 10 pmol/phn ng; + Mi Sly (enzyme ly gii): 10pmol/phn ng; + Mi cps2J (typ huyt 2): 40pmol/phn ng; 27 - Th tớch mu: 1àl Quy trỡnh PCR: Thờm chu trỡnh nhit ph: cú chu k ca: 960C x phỳt; 600C x 30 giõy; 720C x phỳt Nhit bt cp thớch hp, thi gian v s chu k hp lý chu trỡnh chớnh: l chu trỡnh nhit th hai vi 40 chu k ca: 940C x 30 giõy; 600C x 30 giõy; 720C x phỳt Thi gian kộo di sn phm giai on nhit cui cựng: 720C x phỳt 3.1.5 nhy v tớnh n nh ca quy trỡnh PCR c xõy dng (kh nng lp li kt qu) Hỡnh 3.7 Mc phỏt hin vi khun S suis v yu t c lc ca vi khun bi PCR a mi ó hon thin (kt qu vi bnh phm mụ phng) M: Thang chun DNA; = bng DNA c hiu ca typ huyt 2 = bng DNA c hiu S Suis 3= bng DNA c hiu enzym ly gii 100vk: ng phn ng cha 100 vi khun 10 vk: ng phn ng cha 10 vi khun 01 vk: ng phn ng cha vi khun Vi quy trỡnh PCR ó xõy dng hon chnh, nhúm nghiờn cu ó thc hin th nhy ca quy trỡnh trờn cỏc mu bnh phm mụ phng vi cỏc nng t 100 vk/phn ng n 01 vk/phn ng Kt qu cho thy c nng , tt c cỏc sn phm ca cp mi u biu hin y Nh vy, mc phỏt hin ca quy trỡnh t ti khong 01 vi khun/phn ng So sỏnh vi cỏc quy trỡnh n mi v a mi ó c cụng b thỡ kt qu ca chỳng tụi tng t (chc chn phỏt hin c 10 vi khun/phn ng) hoc cao hn (cú kh nng phỏt hin c vi khun/1 ng phn ng) 28 3.1.6 ỏnh giỏ kh nng bt cp chộo ca cỏc cp mi (tớnh c hiu) vi nhng vi khun ph bin gõy bnh cnh lõm sng ging S suis 500 300 Hỡnh 3.8 Kim tra tớnh c hiu ca t hp mi & quy trỡnh PCR a mi M: thang DNA chun 100bp C(+): chng dng (chng chun S suis) th hin yu t ca vi khun Spn: chng õm (vi S pneumoniae, cựng h vi S suis) Spy: chng õm (vi S pyogenes) Nm: chng õm (vi N meningitidis; gõy bnh cnh ging S suis) Hib: chng vi khun H influenzae typ b gõy bnh VMN ging S suis Nhúm nghiờn cu ó tin hnh th nghim kim tra tớnh c hiu ca t hp mi v quy trỡnh PCR a mi Trong th nghim ny, chỳng tụi ó s dng cỏc chng vi khun l tỏc nhõn cựng h v gõy bnh cnh ging S.suis bao gm S Pneumoniae, S pyogenes, S pyogenes v H influenza, ngoi cũn s dng bch cu n nhõn l loi t bo chim s lng ln cỏc mu bnh phm Kt qu th nghim cho thy ch cú mu cha tỏc nhõn gõy bnh S.suis xut hin vch DNA tng ng vi sn phm ca cp mi c s dng cỏc mu cũn li, khụng cú mu no xut hin sn phm ca phn ng PCR Nh vy, quy trỡnh PCR v t hp mi c xõy dng mang tớnh c hiu cao, ch phỏt hin S.suis m khụng phỏt hin c nhng loi vi khun khỏc Tớnh c hiu ca quy trỡnh nhiu yu t quyt nh song trỡnh t cỏc cp mi l yu t ch yu nht õy, cỏc cp mi l nhng trỡnh t ó c nghiờn cu v cụng b t tớnh c hiu cao (ch bt cp vi trỡnh t c hiu ca vi khun S suis m khụng bt cp vi gen ca nhng vi khun khỏc) 3.2 XY DNG QUY TRèNH X Lí BNH PHM N GIN, D THC HIN BC L DNA CA VI KHUN Streptococcus suis T HIU QU (NH GI BNG KT QU PHT HIN CA PCR A MI) 29 M K107 T1.107 T1.106 T1.105 T1.104 T2.107 T2.106 T2.105 T2.104 C (-) Hỡnh 3.9 X lý mu bnh phm dch nóo ty nhit 850C v 900C 60 phỳt M: thang chun DNA 100bp; Kit 107 : vi khun chun c x lý bng b sinh phm tỏch chit DNA v s dng nh chng dng; T1.107 n T1.104: vi khun chun nng khỏc v c x lý nhit 850C 60 phỳt T2.107 n T2 104: vi khun chun nng khỏc v c x lý nhit 900C 60 phỳt m bo tớnh tit kim, nhúm nghiờn cu ó s dng quy trỡnh PCR n mi phỏt hin typ huyt ó c xõy dng nghiờn cu trc õy tin hnh th nghim trờn Hỡnh 3.9 cho thy, x lý mu bnh phm nhit 850C hoc 900C 60 phỳt thỡ ch thy vch DNA ớch xut hin nng 107 v 106vk/p, cũn nng 105 v 104 vk/p, khụng thy xut hin vch DNA Nh vy x lý bnh phm cỏc nhit trờn ch phỏt hin c vi khun n nng 106vk/p M (+) T1.1 T1.2 T1.3 T2.1 T2.2 T2.3 T3.1 T3.2 T3.3 (-) 500 bp Hỡnh 3.10 Hiu qu x lý dch nóo ty nhit 800C vi thi gian khỏc M: thang chun DNA; (+): chng dng T1.1-T1.3: x lý 800C 35 phỳt vi cỏc nng vk t 106 n 104 30 T2.1 T2.3: x lý 800C 75 phỳt vi cỏc nng vk t 106 n 104 T3.1 T3.3: x lý 800C 90 phỳt vi cỏc nng vk t 106 n 104 Hỡnh 3.10 cho thy, x lý bnh phm 800C 35, 75 v 90 phỳt, tt c cỏc nng vi khun t 106 n 104 vk/p u khụng thy xut hin vch DNA ớch Nh vy phng phỏp x lý bnh phm dch nóo ty iu kin 800C 35, 75 v 90 phỳt khụng t hiu qu M (+) K106 K105 K104 K103 K102 K10 K5 K2 K1 T104 103 T102 T10 T1 Hỡnh 3.11 Hiu qu x lý dch nóo ty bng Kit v bng nhit 800C/60 (ỏnh giỏ bi PCR a mi) M: thang chun DNA; (+): chng dng K: X lý mu bnh phm bng kit 106,105,5, 2, 1: S lng vk/p T: X lý mu bnh phm bng nhit Kt qu hỡnh 3.11 cho thy tt c cỏc nng vi khun phng phỏp x lý bng kớt v phng phỏp x lý bng nhit u thy vch DNA tng ng vi sn phm ca cp mi CPS 2J, Sly v 16S rDNA Nh vy nhy cng nh hiu qu ca phng phỏp x lý bng nhit hon ton tng ng vi phng phỏp x lý bng kit chun Nh vy, nhit 800C 60 phỳt l iu kin n gin nht x lý bnh phm dch nóo ty cú cha vi khun S suis nhm mc ớch tỏch chit c DNA s dng phn ng PCR Hin nay, trờn th trng b kit dựng tỏch chit DNA cú giỏ thnh khỏ cao Vỡ vy, s thnh cụng ca nghiờn cu phng phỏp x lý mu bnh phm n gin bng nhit s gúp phn ỏng k vic lm gim giỏ thnh ca mi mu xột nghim, lm gim gỏnh nng v kinh t cho ngi bnh c bit tỡnh trng kinh t khú khn nh hin 31 M (+) 19 10 11 12 13 14 15 20 21 22 23 24 25 26 27 M 28 29 30 31 32 33 34 16 17 18 35 10 (-) Hỡnh 3.13 ng dng quy trỡnh PCR a mi ó c xõy dng trờn mu bnh phm M: thang chun DNA; 1, 2, 35: 35 mu bnh phm (+): chng dng; (-): chng õm 101: mu bnh phm mụ phng vi nng 10 vk/p Hỡnh 3.13 cho thy kt qu chy PCR a mi trờn 35 mu bnh phm, ú cú cỏc mu bnh phm 16, 17, 24, 25, 26, 31,32 khụng thy xut hin sn phm ca PCR a mi Trong s cỏc mu cũn li ch yu hin hoc vch sn phm, ch cú mu 8, 23, 27 v 29 l cú vch sn phm khng nh li kt qu phõn tớch, i vi nhng mu ny cú th kim tra li bng phng phỏp PCR n mi 3.3 NH GI CC GI TR HU CH CA PHNG PHP PCR A MI KHI P DNG VI BNH PHM LM SNG 3.3.1 Kt qu nuụi cy phõn lp/xỏc nh c vi khun t bnh phm: S bnh phm ca bnh nhõn c chn oỏn VMN m nghi S suis: 53 S bnh phm nuụi cy phõn lp xỏc nh l S suis : 44 mu (44/53 trng hp nhim S suis) S bnh phm xỏc nh l S suis bng PCR a mi: 53 mu (53/53 trng hp nhim S suis ) 3.3.2 Cỏc chi s ỏnh giỏ chớnh xỏc v giỏ tr hu ớch ca cỏc phng phỏp Trong trng hp tiờu chun xỏc nh viờm mng nóo S suis l phi dng tớnh phng phỏp nuụi cy phõn lp (c coi nh chun vng) S mu c phõn tớch bao gm: tng s mu bnh phm c chn oỏn lõm sng VMN m nghi vi khun S suis l 44 mu v s mu õm tớnh thc s (100 mu): 32 n = 44 +100 = 144 Bng 3.8 nhy v c hiu ca phng phỏp PCR a mi so vi phng phỏp nuụi cy phõn lp (chun vng) vi n = 144 Kt qu chn oỏn S suis bng nuụi cy phõn lp Dng tớnh m tớnh Phng phỏp Dng tớnh a mi PCR (phng phỏp th m tớnh nghim) Tng Ch s ỏnh giỏ chớnh xỏc Tng 44 144 100 100 44 100 144 Phng phỏp nuụi cy nhy c hiu 100% 100% Phng phỏp PCR a mi 100% 100% Kt qu Bng 3.8 cho thy, phng phỏp PCR a mi phỏt hin liờn cu khun ln so vi nuụi cy phõn lp cú nhy t 100% v c hiu t 100% Trong trng hp ny tiờu chun xỏc nh viờm mng nóo S suis l dng tớnh vi hai phng phỏp l nuụi cy phõn lp hoc PCR a mi S mu c phõn tớch bao gm: tng s mu bnh phm c chn oỏn lõm sng VMN m nghi vi khun S suis l 53 mu v s mu õm tớnh thc s (100 mu): n = 53 +100 = 153 Bng 3.9 So sỏnh kt qu ba phng phỏp: PCR n mi, a mi v NCPL K thut chn oỏn Nuụi cy phõn lp PCR a mi PCR a mi Kt qu phỏt hin vi khun S suis tng s mu bnh phm nghi ng (n = 53) Dng tớnh (+) m tớnh (-) (%) (%) Bnh nhõn c chn oỏn lõm sng VMN nghi S suis 44 (83,02%) (16,98%) 53 53 (100%) 53 (100%) (0%) (0%) 53 53 Bng 3.9 cho thy kt qu phỏt hin ca PCR n mi tng t PCR a mi (cú cp mi khỏc nhau) v nhiu hn phng phỏp NCPL l 16,98%, núi cỏch khỏc t l õm tớnh gi ca NCPL l 16,98% 33 Bng 3.10 Cỏc ch s ỏnh giỏ chớnh xỏc v s hu ớch ca phng phỏp PCR a mi v nuụi cy phõn lp (n=153) Kt qu chn oỏn S suis Tng Dng tớnh m tớnh Dng tớnh 53 53 Phng phỏp a mi PCR m tớnh 100 100 53 100 153 Tng Phng phỏp nuụi Dng tớnh 44 44 cy phõn lp m tớnh 100 109 53 100 153 Tng So sỏnh cỏc giỏ tr ca hai phng phỏp vi tng s mu = 153 Phng phỏp nuụi cy Phng phỏp PCR a mi Ch s ỏnh giỏ chớnh xỏc: nhy 83,02% 100% c hiu 100% 100% T l dng tớnh gi 0 T l õm tớnh gi 16,98% Ch s ỏnh giỏ s hu ớch: + LR - LR Giỏ tr d oỏn dng tớnh (PPV) Giỏ tr d oỏn õm tớnh (NPV) 0,17 1.00 0.917 1.00 1.00 Kt qu Bng 3.10 cho thy, phng phỏp PCR a mi phỏt hin liờn cu khun ln cú nhy rt cao vi 100%; ú phng phỏp nuụi cy cú nhy l 83,02% T l õm tớnh gi ca phng phỏp PCR a mi l 0%, ú t l õm tớnh gi ca phng phỏp nuụi cy gn 17% (16,98%) C hai phng phỏp u cú c hiu 100% v t l dng tớnh gi l 0% Nu xột nghim PCR a mi dng tớnh vi vi khun S suis, xỏc xut mc bnh l 100%, ú nu nuụi cy õm tớnh vi S suis, xỏc xut khụng mc bnh S suis l 91,7% Núi cỏch khỏc, giỏ tr d oỏn dng tớnh ca PCR a mi v nuụi cy l 100% v giỏ tr d oỏn õm tớnh ca PCR a mi l 100% v ca nuụi cy l 91,7% 34 KT LUN Xõy dngquy trỡnh PCR a mi phỏt hin trc tip vi khun S suis (liờn cu khun ln) v mt s yu t c lc c bn ca vi khun bnh phm ngi t cỏc yờu cu v gii hn phỏt hin/ nhy v tớnh c hiu/ c hiu v tớnh lp li kt qu nh sau: - Vi bnh phm mụ phng (m bo ging bnh phm tht bao gm vi khun c thun nht v chun dch nóo ty ca ngi (t bnh nhõn b hi chng nóo cp): + Gii hn phỏt hin t vi khun/1 ng phn ng + Tớnh c hiu: khụng cú hin tng bt cp nhm vi vi khun khỏc loi - Vi bnh phm lõm sng: + nhy: t 100% + c hiu so vi cỏc phng phỏp phỏt hin khỏc (nuụi cy phõn lp, PCR n mi): t 100% - Kh nng lp li kt qu ca PCR a mi: t 100% vi bnh phm mụ phng v bnh phm lõm sng Xõy dng c quy trỡnh x lý mu bnh phm dch nóo ty n gin khụng dựng sinh phm thng mi m t hiu qu phỏt hin bng PCR a mi: - X lý bng nhit 800C/60 phỳt - m bo cht lng (bc l DNA ca vi khun, kh cht c ch) tng ng nh tỏch chit bng b sinh phm KIN NGH Phng phỏp PCR a mi l mt phng phỏp sinh hc phõn t chn oỏn nhanh Streptococcus suis t dch nóo ty ngi Phng phỏp PCR a mi tit kim thi gian, cụng sc cng nh lm gim giỏ thnh xột nghim ca mu bnh phm Vỡ th, nu phng phỏp ny c trin khai ti cỏc bnh vin v Trung tõm y t d phũng tuyn tnh thỡ vic iu tr giỏm sỏt bnh S.suis gõy s t hiu qu tt 35 36 [...]... giá bằng PCR đa mồi đã đƣợc tối ƣu điều kiện ở trên Lựa chọn thạch điện di và nồng độ thạch điện di để đảm bảo phát hiện sản phẩm PCR đa mồi 2.2.5 Nghiên cứu mức độ phát hiện vi khuẩn S suis và một số yếu tố độc lực của vi khuẩn bởi quy trình PCR đa mồi đƣợc xây dựng trong nghiên cứu Tính ổn định của PCR đa mồi - Sử dụng bệnh phẩm mô phỏng chứa DNA đã tinh chế của vi khuẩn ở một dải nồng độ từ 106 đến... trị dự đoán dƣơng tính của PCR đa mồi và nuôi cấy là 100% và giá trị dự đoán âm tính của PCR đa mồi là 100% và của nuôi cấy là 91,7% 34 KẾT LUẬN 1 Xây dựngquy trình PCR đa mồi phát hiện trực tiếp vi khuẩn S suis (liên cầu khuẩn lợn) và một số yếu tố độc lực cơ bản của vi khuẩn ở bệnh phẩm ngƣời đạt các yêu cầu về giới hạn phát hiện/ độ nhạy và tính đặc hiệu/độ đặc hiệu và tính lặp lại kết quả nhƣ sau:... khuẩn Với quy trình PCR đã xây dựng hoàn chỉnh, nhóm nghiên cứu đã thực hiện thử độ nhạy của quy trình trên các mẫu bệnh phẩm mô phỏng với các nồng độ từ 100 vk/phản ứng đến 01 vk/phản ứng Kết quả cho thấy ở cả 3 nồng độ, tất cả các sản phẩm của 3 cặp mồi đều biểu hiện đầy đủ Nhƣ vậy, mức độ phát hiện của quy trình đạt tới khoảng 01 vi khuẩn/phản ứng So sánh với các quy trình đơn mồi và đa mồi đã đƣợc... độ mồi và nồng độ DNA đích: Trong giới hạn, khi tăng nồng độ mồi có thể tăng kết quả phát hiện gen đích của phản ứng PCR Do vậy, tăng nồng độ mồi cũng đƣợc coi nhƣ một cách tối ƣu phản ứng PCR 10 CHƢƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 2.1.1 Chủng vi khuẩn sử dụng trong nghiên cứu Chủng vi khuẩn Streptococcus suis Để hoàn thiện và chuẩn hoá các điều kiện của phản ứng PCR, ... PCR Nhƣ vậy, quy trình PCR và tổ hợp mồi đƣợc xây dựng mang tính đặc hiệu cao, chỉ phát hiện S .suis mà không phát hiện đƣợc những loại vi khuẩn khác Tính đặc hiệu của quy trình do nhiều yếu tố quy t định song trình tự các cặp mồi là yếu tố chủ yếu nhất Ở đây, các cặp mồi là những trình tự đã đƣợc nghiên cứu và công bố đạt tính đặc hiệu cao (chỉ bắt cặp với trình tự đặc hiệu của vi khuẩn S suis mà không... của phản ứng PCR đa mồi phát hiện S suis và một số yếu tố độc lực phổ biến Bảng 3.3 Ảnh hƣởng của các chu trình PCR đến khả năng phát hiện S .suis Các điều kiện phản ứng đƣợc thử nghiệm Ảnh hƣởng tốt đến khả năng phát hiện của PCR Không tác động đến khả năng phát hiện của phản ứng PCR Thêm 1 bƣớc gia nhiệt phụ lúc khởi đầu X Tăng thời gian bắt cặp X Tăng số chu kỳ chính X Tăng cả thời gian bắt cặp và. .. dụng để xác định giới hạn phát hiện (độ nhạy) của quy trình PCR đa mồi 2.2.2 Nghiên cứu lựa chọn tổ hợp mồi đại diện cho S suis và một số yếu tố chủ yếu liên quan đến độc lực của vi khuẩn Yêu cầu về tổ hợp mồi: - Thành phần của tổ hợp mồi có thể có ít nhất 3 cặp mồi của 3 gen khác nhau luôn phải có cặp mồi đặc hiệu chung cho vi khuẩn S suis - Kích thƣớc sản phẩm PCR khác nhau để có thể phân biệt đƣợc... có S suis và/ hoặc không phát hiện đƣợc vật liệu di truyền của vi khuẩn bởi PCR Chú ý: Tiêu chuẩn trên được sử dụng trong trường hợp phân tích, so sánh kết quả của phương pháp nuôi cấy và PCR đa mồi (phương pháp thử nghiệm) Kết quả của PCR đa mồi cũng đƣợc so sánh với kết quả phát hiện của PCR đơn mồi (đƣợc tiến hành trên cùng 1 mẫu bệnh phẩm) 19 2.3.2 Các chỉ số tính toán độ tin cậy và giá trị của phƣơng... tiếp từ bệnh phẩm lâm sàng 18 - Sử dụng mẫu bệnh phẩm dịch não tủy từ bệnh nhân có triệu chứng lâm sàng nghi viêm màng não mủ do vi khuẩn S suis để đánh giá tính hiệu quả của kỹ thuật xử lý đơn giản và quy trình PCR đa mồi Số lƣợng mẫu bệnh phẩm tùy thuộc điều kiện thực tế thu đƣợc trong thời gian nghiên cứu, cụ thể ở nghiên cứu (NC) này là 53 mẫu bệnh phẩm thu đƣợc từ ngƣời mắc bệnh nghi do S suis. .. loại dịch não tủy đƣợc thu thập từ những bệnh nhân có hội chứng não cấp hoặc viêm não vô khuẩn: 100 mẫu dịch não tủy thu đƣợc từ bệnh nhân có hội chứng não cấp (HCNC) hoặc viêm não vi rút, đã đƣợc khẳng định âm tính với vi khuẩn để tạo bệnh phẩm nền và sử dụng nhƣ mẫu chứng âm tính thật với S suis 2.1.3 Dịch não tủy của bệnh nhân đƣợc chẩn đoán lâm sàng viêm màng não cấp tính do S suis (để đánh giá ... tài Nghiên cứu phát triển hoàn thiện quy trình PCR đa mồi để phát trực tiếp Streptococcus suis từ dịch não tủy ngƣời” với mục tiêu sau đây: - Xây dựng quy trình PCR đa mồi phát trực tiếp S suis. .. độ thạch điện di để đảm bảo phát sản phẩm PCR đa mồi 2.2.5 Nghiên cứu mức độ phát vi khuẩn S suis số yếu tố độc lực vi khuẩn quy trình PCR đa mồi đƣợc xây dựng nghiên cứu Tính ổn định PCR đa mồi. .. 800C/90phút 2.2.8 Áp dụng toàn quy trình xây dựng (xử lý bệnh phẩm, PCR đa mồi) để phát vi khuẩn S suis trực tiếp từ bệnh phẩm lâm sàng 18 - Sử dụng mẫu bệnh phẩm dịch não tủy từ bệnh nhân có triệu chứng