Nghiên cứu phát triển và hoàn thiện quy trình PCR đa mồi để phát hiện trực tiếp streptococcus suis từ dịch não tủy của người (2)

I HC QUC GIA H NI TRNG I HC KHOA HC T NHIấN - ng Th Kiu Oanh NGHIấN CU PHT TRIN V HON THIN QUY TRèNH PCR A MI PHT HIN TRC TIP Streptococcus suis T DCH NO TY NGI LUN VN THC S KHOA HC H Ni 2013 I HC QUC GIA H NI TRNG I HC KHOA HC T NHIấN - ng Th Kiu Oanh NGHIấN CU PHT TRIN V HON THIN QUY TRèNH PCR A MI PHT HIN TRC TIP Streptococcus suis T DCH NO TY NGI Chuyờn ngnh: Vi sinh vt hc Mó s: 60 42 40 LUN VN THC S KHOA HC NGI HNG DN KHOA HC: PGS.TS PHAN Lấ THANH HNG H Ni - 2013 Lun thc s hc Vi sinh vt LI CM N hon thnh lun ny, tụi xin by t lũng bit n sõu sc ti PGS.TS Phan Lờ Thanh Hng, Trng Khoa Vi Khun, Trng Phũng Vi khun hụ hp, Vin V sinh dch t Trung ng ó tn tỡnh hng dn, ng viờn v to mi iu kin tụi hon thnh ti Tụi cng xin by t lũng cm n sõu sc ti TS Nguyn Thanh Thy Trng Khoa An ton sinh hc - Qun lý cht lng, Vin V sinh dch t Trung ng v th Khoa ó to mi iu kin v thi gian cho tụi thc hin ti Tụi xin cm n th Phũng Vi khun hụ hp, Vin V sinh dch t Trung ng hc ó ch bo, giỳp , chia s tn tỡnh cho tụi nhng kinh nghim chuyờn mụn quỏ trỡnh lm thc nghim Tụi xin gi li cm n chõn thnh n cỏc thy, cỏc cụ Khoa sinh hc, c bit l cỏc thy cụ B mụn Vi sinh vt hc, trng i hc Khoa hc T nhiờn, i hc Quc gia H Ni ó to iu kin cho tụi quỏ trỡnh hc Tụi xin cm n gia ỡnh v bn bố luụn luụn ng viờn tinh thn tụi hon thnh lun ny H Ni, ngy thỏng nm 2013 Hc viờn ng Th Kiu Oanh ng Th Kiu Oanh Cao hc K18 Lun thc s hc Vi sinh vt MC LC Capsular polysaccharide Deoxyribonucleic acid Polymerase chain reaction T VN 1.1 GII THIU V Streptococcus suis.suis 1.1.1 Gii thiu chung 1.1.2 Mt s yu t c lc chớnh ca vi khun liờn quan n chn oỏn 1.1.3 C ch gõy bnh ca S.suis 1.2 S LY NHIM TRấN NGI CA S.suis .15 1.3 BNH V TRIU CHNG 19 1.3.1 ng lõy truyn 19 1.3.2 Triu chng 20 1.3.3 Bin phỏp phũng bnh 21 1.3.4 Bin phỏp chng dch 21 1.3.5 Nguyờn tc iu tr .22 1.4 CC PHNG PHP CHN ON PHềNG TH NGHIM 22 1.4.1 Nuụi cy phõn lp 22 1.4.2 Nhum Gram 22 1.4.3 Phn ng catalase 23 1.4.4 Xột nghim nh danh, nh typ: 23 1.4.5 Phỏt hin vi khun S suis bng phn ng Realtime PCR 24 1.5 PHNG PHP PCR 24 1.5.1 Gii thiu v phng phỏp khuch i gen (polymerase chain reaction PCR) 24 1.5.2 Nguyờn lý c bn ca k thut PCR 25 1.5.3 Gii thiu v phn ng PCR a mi 29 CHNG VT LIU V PHNG PHP NGHIấN CU 35 2.1 VT LIU NGHIấN CU 35 2.1.1 Chng vi khun s dng nghiờn cu 35 2.1.2 Dch nóo ty nn 35 2.1.3 Dch nóo ty ca bnh nhõn c chn oỏn lõm sng viờm mng nóo cp tớnh S suis ( ỏnh giỏ hiu qu ca quy trỡnh PCR a mi c xõy dng ti): 36 ng Th Kiu Oanh Cao hc K18 Lun thc s hc Vi sinh vt 2.1.4 Sinh phm nghiờn cu: 36 2.1.5 Trang thit b, dng c 38 2.2 PHNG PHP NGHIấN CU: 39 2.2.1 Nghiờn cu to bnh phm mụ phng 39 2.2.2 Nghiờn cu la chn t hp mi i din cho S suis v mt s yu t ch yu liờn quan n c lc ca vi khun 45 2.2.3 Nghiờn cu ti u chu trỡnh nhit 46 2.2.4 Nghiờn cu ti u cỏc thnh phn tham gia phn ng 48 2.2.5 Nghiờn cu mc phỏt hin vi khun S suis v mt s yu t c lc ca vi khun bi quy trỡnh PCR a mi c xõy dng nghiờn cu Tớnh n nh ca PCR a mi 48 2.2.6 ỏnh giỏ tớnh c hiu ca cỏc cp mi (kh nng bt cp chộo) vi nhng vi khun ph bin gõy hi chng lõm sng viờm mng nóo ging S suis 49 2.2.7 Xõy dng quy trỡnh x lý bnh phm tỏch chit DNA ca S suis 49 2.3 NH GI CC GI TR HU CH CA PHNG PHP 51 2.3.1 Tiờu chun xỏc nh chn oỏn dng tớnh v õm tớnh .51 2.3.2 Cỏc ch s tớnh toỏn tin cy v giỏ tr ca phng phỏp [3, 4] 52 CHNG KT QU V THO LUN 54 3.1 XY DNG QUY TRèNH PCR A MI PHT HIN TRC TIP Streptococcus suis V MT S C LC PH BIN CA VI KHUN .54 3.1.1 To bnh phm mụ phng 54 3.1.2 La chn cỏc cp mi v t hp mi phự hp: 55 3.1.3 Xỏc nh iu kin ti u ca phn ng PCR a mi phỏt hin S suis v mt s yu t c lc ph bin 57 58 58 3.1.4 Ti u húa cỏc thnh phn tham gia phn ng PCR a mi phỏt hin vi khun S suis v mt s yu t c lc ph bin 59 61 62 3.1.5 nhy v tớnh n nh ca quy trỡnh PCR c xõy dng (kh nng lp li kt qu) 63 lp li ca k thut 64 (10 ln th nghim) .64 ng Th Kiu Oanh Cao hc K18 Lun thc s hc Vi sinh vt .64 0/10 64 3.1.6 ỏnh giỏ kh nng bt cp chộo ca cỏc cp mi (tớnh c hiu) vi nhng vi khun ph bin gõy bnh cnh lõm sng ging S suis 65 3.2 XY DNG QUY TRèNH X Lí BNH PHM N GIN, D THC HIN BC L DNA CA VI KHUN Streptococcus suis T HIU QU (NH GI BNG KT QU PHT HIN CA PCR A MI) 66 3.3 NH GI CC GI TR HU CH CA PHNG PHP PCR A MI KHI P DNG VI BNH PHM LM SNG 70 3.3.1 Kt qu nuụi cy phõn lp/xỏc nh c vi khun t bnh phm: 70 3.3.2 Cỏc chi s ỏnh giỏ chớnh xỏc v giỏ tr hu ớch ca cỏc phng phỏp 71 KT LUN 75 TI LIU THAM KHO 77 ng Th Kiu Oanh Cao hc K18 Lun thc s hc Vi sinh vt DANH MC HèNH Hỡnh 1.1: Vi khun liờn cu lnliờn cu khun ln qua kớnh hin vi in t (http://genome.jgi-psf.org/strsu/strsu.home.html) Hỡnh 1.2: Khun lc S suis trờn mụi trng thch mỏu cu v thch mỏu nga Hỡnh 1.3 Bnh nhõn b nhim S suis (http://www.pig333.com/what_the_experts_say/streptococcus-suiszoonotic-epidemic-in-asia_4091/) 20 Hỡnh 1.4 S phn ng PCR 26 (http://fmel.ifas.ufl.edu/buzz/csPCR.shtml) 26 Hỡnh 3.1 Th nghim cỏc t hp mi phự hp (t t hp n t hp 8) 55 Hỡnh 3.2.Th nghim cỏc t hp mi phự hp (t t hp n t hp 16) 56 Hỡnh 3.3 PCR a mi vi cỏc iu kin phn ng ti u phỏt hin trc tip S suis bnh phm 59 Hỡnh 3.4 Th nghim hm lng cỏc mi vi nng mi mi l 20pmol/àl 60 Hỡnh 3.5 Th nghim hm lng mi vi nng mi khỏc 61 Hỡnh 3.6 Th nghim Quy trỡnh PCR ó xõy dng trờn mu bnh phm 62 vi cỏc th tớch mu khỏc 62 Hỡnh 3.7 Mc phỏt hin vi khun S suis v yu t c lc ca vi khun bi PCR a mi ó hon thin (kt qu vi bnh phm mụ phng) 64 Hỡnh 3.8 Kim tra tớnh c hiu ca t hp gen mimi & quy trỡnh PCR a mi 65 ng Th Kiu Oanh Cao hc K18 Lun thc s hc Vi sinh vt Hỡnh 3.9 X lý mu bnh phm dch nóo ty nhit 850C v 900C 60 phỳt 67 Hỡnh 3.10 Hiu qu x lý dch nóo ty nhit 800C vi thi gian khỏc 68 Hỡnh 3.11 Hiu qu x lý dch nóo ty bng Kit v bng nhit 800C/60 68 Hỡnh 3.12 Hiu qu x lý dch nóo ty ca bnh nhõn 800C/60(ỏnh giỏ bi PCR n mi) 69 Hỡnh 3.13 ng dng quy trỡnh PCR a mi ó c xõy dng trờn mu bnh phm 70 ng Th Kiu Oanh Cao hc K18 Lun thc s hc Vi sinh vt DANH MC BNG Bng 1.1 H gen ca mt s chng Sreptococcus suis .4 Bng 2.1 Mt s trỡnh t mi ch yu (primer) c s dng nghiờn cu [11,25,39,41] .38 Bng 2.2 Cỏc t hp mi c s dng th nghim .45 Bng Cỏc chu trỡnh PCR a mi c th nghim 46 Bng 2.3 Bng s liu c bn tớnh toỏn cỏc ch s 52 Bng 2.4 Mc LR+, LR - liờn quan n kh nng mc bnh v khụng mc bnh 52 Bng 3.1 Kt qu khng nh li c tớnh ca vi khun dựng lm mu 54 Bng 3.2 Cỏc t hp mi thớch hp c la chn thớ nghim 56 Bng 3.3 nh hng ca cỏc chu trỡnh PCR n kh nng phỏt hin S.suis .57 Bng 3.4 Kh nng phỏt hin vi khun v cỏc yu t c lc thay i iu kin quy trỡnh PCR a mi 58 Bng 3.5 Thnh phn tham gia phn ng PCR a mi c kho sỏt 59 Bng 3.6 Tớnh n nh ca Quy trỡnh PCR thc hin trờn mu bnh phm .64 Bng 3.7 nh hng ca cỏc phng phỏp x lý bnh phm dựng/khụng dựng kit 66 Bng 3.8 nhy v c hiu ca phng phỏp PCR a mi so vi phng phỏp nuụi cy phõn lp (chun vng) vi n = 144 71 Bng 3.9 So sỏnh kt qu ba hai phng phỏp: PCR n mi, a mi v nuụi cy phõn lpNCPL 72 Bng 3.10 Cỏc ch s ỏnh giỏ chớnh xỏc v s hu ớch ca phng phỏp PCR a mi v nuụi cy phõn lp (n=153) 72 ng Th Kiu Oanh Cao hc K18 Lun thc s hc ng Th Kiu Oanh Vi sinh vt Cao hc K18 Lun thc s hc Vi sinh vt Kt qu hỡnh 3.11 cho thy tt c cỏc nng vi khun phng phỏp x lý bng kớt v phng phỏp x lý bng nhit u thy vch DNA tng ng vi sn phm ca cp mi CPS 2J, Sly v 16S rDNA Nh vy nhy cng nh hiu qu ca phng phỏp x lý bng nhit hon ton tng ng vi phng phỏp x lý bng kit chun Nh vy, nhit 800C 60 phỳt l iu kin n gin nht x lý bnh phm dch nóo ty cú cha vi khun S suis nhm mc ớch tỏch chit c DNA s dng phn ng PCR Hin nay, trờn th trng b kit dựng tỏch chit DNA cú giỏ thnh khỏ cao Vỡ vy, s thnh cụng ca nghiờn cu phng phỏp x lý mu bnh phm n gin bng nhit s gúp phn ỏng k vic lm gim giỏ thnh ca mi mu xột nghim, lm gim gỏnh nng v kinh t cho ngi bnh c bit tỡnh trng kinh t khú khn nh hin Hỡnh 3.12 Hiu qu x lý dch nóo ty ca bnh nhõn 800C/60(ỏnh giỏ bi PCR n mi) M: thang chun DNA; (+): chng dng; (-): chng õm; Sp1-Sp5: mu bnh phm lõm sng (DNT) c x lý 800C/60 ng Th Kiu Oanh 69 Cao hc K18 Lun thc s hc Vi sinh vt c mu bnh phm, vch DNA v trớ kớch thc 498 bp ca cp mi c hiu cho typ ca vi khun S.suis u xut hin rt rừ nột Nh vy phng phỏp x lý mu bnh phm 800C 60 phỳt thớch hp x lý mu bnh phm dch nóo ty bc l DNA ca vi khun S.suis M (+) 19 20 21 22 23 24 10 11 12 13 14 15 25 26 27 M 28 29 30 31 32 33 34 16 17 18 35 101 (-) Hỡnh 3.13 ng dng quy trỡnh PCR a mi ó c xõy dng trờn mu bnh phm M: thang chun DNA; 1, 2, 35: 35 mu bnh phm (+): chng dng; (-): chng õm 101: mu bnh phm mụ phng vi nng 10 vk/p Hỡnh 3.13 cho thy kt qu chy PCR a mi trờn 35 mu bnh phm, ú cú cỏc mu bnh phm 16, 17, 24, 25, 26, 31,32 khụng thy xut hin sn phm ca PCR a mi Trong s cỏc mu cũn li ch yu hin hoc vch sn phm, ch cú mu 8, 23, 27 v 29 l cú vch sn phm khng nh li kt qu phõn tớch, i vi nhng mu ny cú th kim tra li bng phng phỏp PCR n mi 3.3 NH GI CC GI TR HU CH CA PHNG PHP PCR A MI KHI P DNG VI BNH PHM LM SNG 3.3.1 Kt qu nuụi cy phõn lp/xỏc nh c vi khun t bnh phm: S bnh phm ca bnh nhõn c chn oỏn VMN m nghi S suis: 53 ng Th Kiu Oanh 70 Cao hc K18 Lun thc s hc Vi sinh vt S bnh phm nuụi cy phõn lp xỏc nh l S suis : 44 mu (44/53 trng hp nhim S suis) S bnh phm xỏc nh l S suis bng PCR a mi: 53 mu (53/53 trng hp nhim S suis ) 3.3.2 Cỏc chi s ỏnh giỏ chớnh xỏc v giỏ tr hu ớch ca cỏc phng phỏp Trong trng hp tiờu chun xỏc nh viờm mng nóo S suis l phi dng tớnh phng phỏp nuụi cy phõn lp (c coi nh chun vng) S mu c phõn tớch bao gm: tng s mu bnh phm c chn oỏn lõm sng VMN m nghi vi khun S suis l 44 mu v s mu õm tớnh thc s (100 mu): n = 44 +100 = 144 Bng 3.8 nhy v c hiu ca phng phỏp PCR a mi so vi phng phỏp nuụi cy phõn lp (chun vng) vi n = 144 Kt qu chn oỏn S suis bng nuụi cy phõn lp Dng tớnh m tớnh Phng phỏp Dng tớnh a mi PCR (phng phỏp th m tớnh nghim) Tng Ch s ỏnh giỏ chớnh xỏc Tng 44 144 100 100 44 100 144 Phng phỏp nuụi cy nhy c hiu 100% 100% Phng phỏp PCR a mi 100% 100% Kt qu Bng 3.8 cho thy, phng phỏp PCR a mi phỏt hin liờn cu lnliờn cu khun ln so vi nuụi cy phõn lp cú nhy t 100% v c hiu t 100% Trong trng hp ny tiờu chun xỏc nh viờm mng nóo S suis l dng tớnh vi hai phng phỏp l nuụi cy phõn lp hoc PCR a mi ng Th Kiu Oanh 71 Cao hc K18 Lun thc s hc Vi sinh vt S mu c phõn tớch bao gm: tng s mu bnh phm c chn oỏn lõm sng VMN m nghi vi khun S suis l 53 mu v s mu õm tớnh thc s (100 mu): n = 53 +100 = 153 Bng 3.9 So sỏnh kt qu ba hai phng phỏp: PCR n mi, a mi v nuụi cy phõn lpNCPL K thut chn oỏn Kt qu phỏt hin vi khun S suis tng s mu bnh phm nghi ng (n = 53) Dng tớnh (+) m tớnh (-) (%) (%) Nuụi cy phõn lp PCR a mi PCR a mi Bnh nhõn c chn oỏn lõm sng VMN nghi S suis 44 (83,02%) (16,98%) 53 53 (100%) 53 (100%) (0%) (0%) 53 53 Bng 3.9 cho thy kt qu phỏt hin ca PCR n mi tng t PCR a mi (cú cp mi khỏc nhau) v nhiu hn phng phỏp NCPL l 16,98%, núi cỏch khỏc t l õm tớnh gi ca NCPL l 16,98% Bng 3.10 Cỏc ch s ỏnh giỏ chớnh xỏc v s hu ớch ca phng phỏp PCR a mi v nuụi cy phõn lp (n=153) Kt qu chn oỏn S suis Tng Dng tớnh m tớnh Phng phỏp Dng tớnh 53 53 a mi PCR m tớnh 100 100 Tng 53 100 153 Phng phỏp nuụi Dng tớnh 44 44 cy phõn lp m tớnh 100 109 Tng 53 100 153 So sỏnh cỏc giỏ tr ca hai phng phỏp vi tng s mu = 153 Phng phỏp nuụi cy Phng phỏp PCR a mi Ch s ỏnh giỏ chớnh xỏc: nhy 83,02% 100% c hiu 100% 100% T l dng tớnh gi 0 T l õm tớnh gi 16,98% Ch s ỏnh giỏ s hu ớch: LR+ - ng Th Kiu Oanh 72 Cao hc K18 Lun thc s hc LRGiỏ tr d oỏn dng tớnh (PPV) Giỏ tr d oỏn õm tớnh (NPV) Vi sinh vt 0,17 1.00 0.917 1.00 1.00 Kt qu Bng 3.10 cho thy, phng phỏp PCR a mi phỏt hin liờn cu lnliờn cu khun ln cú nhy rt cao vi 100%; ú phng phỏp nuụi cy cú nhy l 83,02% T l õm tớnh gi ca phng phỏp PCR a mi l 0%, ú t l õm tớnh gi ca phng phỏp nuụi cy gn 17% (16,98%) C hai phng phỏp u cú c hiu 100% v t l dng tớnh gi l 0% Nu xột nghim PCR a mi dng tớnh vi vi khun S suis, xỏc xut mc bnh l 100%, ú nu nuụi cy õm tớnh vi S suis, xỏc xut khụng mc bnh S suis l 91,7% Núi cỏch khỏc, giỏ tr d oỏn dng tớnh ca PCR a mi v nuụi cy l 100% v giỏ tr d oỏn õm tớnh ca PCR a mi l 100% v ca nuụi cy l 91,7% Vi iu kin Vit Nam hin nay, cú nhiu lý giỏ tr õm tớnh nuụi cy cú nhiu kh nng l õm tớnh gi (do dựng khỏng sinh trc vo bnh vin, vi khun b khỏng sinh c ch khụng phỏt trin c trờn mụi trng nuụi cy, k nng nuụi cy khụng chun, mụi trng nuụi cy khụng m bo cht lng), nhng bnh phm cha DNA ca vi khun nờn cú kt qu dng tớnh s dng phng phỏp PCR, vúi lý nh vy nờn cỏc mu õm tớnh nuụi cy nhng dng tớnh PCR khụng th coi l cỏc mu õm tớnh thc ( tớnh theo cụng thc) c Cng nh vy, s khụng chớnh xỏc nu ch coi cỏc mu bnh phm phỏt hin c vi khun bng nuụi cy phõn lp l t l dng tớnh thc Chỳng tụi ó tớnh toỏn nhy, c hiu v cỏc giỏ tr hu ớch khỏc ỏp dng PCR a mi trờn 153 mu bnh phm (bao gm 53 mu ca bnh nhõn cú biu hin viờm mng nóo m nghi vi khun S suis v 100 mu DNT ca bnh nhõn viờm nóo vi rut (da trờn lõm sng v xột nghim sinh húa - t bo ca DNT) da trờn nguyờn tc nh sau: - ỏnh giỏ hiu qu phỏt hin ca PCR a mi vi qui nh l dng tớnh kt qu phỏt hin vi khun dng tớnh phng phỏp ó c coi l chun ng Th Kiu Oanh 73 Cao hc K18 Lun thc s hc Vi sinh vt vng (nuụi cy phõn lp), khụng tớnh cỏc trng hp ch dng tớnh PCR a mi (l phng phỏp ang c ỏnh giỏ) (n=144) nhy ca mi phng phỏp xột nghim so sỏnh vi phng phỏp c coi l chun vng l t l dng tớnh thc ca mu bnh phm m xột nghim cn c so sỏnh cú th phỏt hin c Vi c mu l 144, phng phỏp PCR a mi phỏt hin liờn cu lnliờn cu khun ln so vi nuụi cy phõn lp cú nhy t 100% v c hiu t 100% Ch s LR + cho thy t l dng tớnh thc ca c hai phng phỏp nh v nu ó phỏt hin c vi khun hay yu t di truyn ca vi khun thỡ chc chn l dng tớnh, ch s LR - cho thy t l õm tớnh gi ca PCR a mi ỏp dng vi S suis l 0% - So sỏnh hiu qu phỏt hin vi khun ca phng phỏp PCR a mi vi PCR n mi v nuụi cy phõn lp.Trong trng hp ny tiờu chun xỏc nh viờm mng nóo S suis l dng tớnh vi hai phng phỏp: nuụi cy phõn lp hoc PCR (n=153) phn phõn tớch ny, c s thit lp cỏc bng tớnh toỏn l: cỏc mu c coi l dng tớnh cú ớt nht mt hai phng phỏp dng tớnh v cỏc mu õm tớnh c hai phng phỏp u õm tớnh Trong 53 mu bnh phm t 53 bnh nhõn c chn oỏn lõm sng l VMN nghi S suis cú 44 mu nuụi cy dng tớnh, 09 mu nuụi cy õm tớnh Nu phỏt hin bng PCR a mi cú 100% s mu dng tớnh (53/53) Nu tớnh theo quy nh viờm mng nóo xỏc nh S suis l dng tớnh vi hai phng phỏp: nuụi cy phõn lp hoc PCR thỡ nhy ca phng phỏp nuụi cy l 83,02% v nhy ca PCR a mi l 100% (Bng 3.10), tớnh xỏc thc ca PCR a mi c kim chng vi PCR n mi (quy trỡnh chun ca phũng thớ nghim Liờn cu, Vin Quc gia cỏc Bnh nhim trựng, Tokyo, Nht Bn) Trong trng hp ny, c hiu ca phng phỏp PCR a mi so sỏnh vi nuụi cy phõn lp l 100% hay t l õm tớnh gi ca phng phỏp PCR a mi l 0%, ú t l õm tớnh gi phng phỏp nuụi cy xp x 17% (Bng 3.10) Ngoi ra, chỳng ng Th Kiu Oanh 74 Cao hc K18 Lun thc s hc Vi sinh vt tụi s dng mi tham kho t ti liu khoa hc ó cụng b cho k thut PCR a mi th nghim ny nờn t hp mi ó la chn cng ó c kho sỏt tớnh c hiu KT LUN Xõy dng c quy trỡnh PCR a mi phỏt hin trc tip vi khun S suis (liờn cu lnliờn cu khun ln) v mt s yu t c lc c bn ca vi khun bnh phm ngi t cỏc yờu cu v gii hn phỏt hin/ nhy v - tớnh c hiu/ c hiu v tớnh lp li kt qu nh sau: Vi bnh phm mụ phng (m bo ging bnh phm tht bao gm vi khun c thun nht v chun dch nóo ty ca ngi (t bnh nhõn b hi chng nóo cp): + Gii hn phỏt hin t vi khun/1 ng phn ng + Tớnh c hiu: khụng cú hin tng bt cp nhm vi vi khun khỏc loi - Vi bnh phm lõm sng: + nhy: t 100% + c hiu so vi cỏc phng phỏp phỏt hin khỏc (nuụi cy phõn lp, PCR n mi): t 100% - Kh nng lp li kt qu ca PCR a mi: t 100% vi bnh phm mụ phng v bnh phm lõm sng Xõy dng c quy trỡnh x lý mu bnh phm dch nóo ty n gin khụng dựng sinh phm thng mi m t hiu qu phỏt hin bng PCR a - mi: X lý bng nhit 800C/60 phỳt m bo cht lng (bc l DNA ca vi khun, kh cht c ch) tng ng nh tỏch chit bng b sinh phm ng Th Kiu Oanh 75 Cao hc K18 Lun thc s hc Vi sinh vt KIN NGH Phng phỏp PCR a mi l mt phng phỏp sinh hc phõn t chn oỏn nhanh Streptococcus suis t dch nóo ty ngi Phng phỏp PCR a mi tit kim thi gian, cụng sc cng nh lm gim giỏ thnh xột nghim ca mu bnh phm Vỡ th, nu phng phỏp ny c trin khai ti cỏc bnh vin v Trung tõm y t d phũng tuyn tnh thỡ vic iu tr giỏm sỏt bnh S.suis gõy s t hiu qu tt ng Th Kiu Oanh 76 Cao hc K18 Lun thc s hc Vi sinh vt TI LIU THAM KHO Ti liu Ting Vit B Y t - Cc Y t d phũng v mụi trng (2009), Cm nang phũng chng bnh truyn nhim, H Ni Nguyn Th Hng Lan, Trn Tnh Hin (2007), Nhim liờn cu ln ti Bnh vin Bnh nhit i t thỏng 1/2005 n thỏng 12/2006, K yu Hi tho khoa hc Thỏch thc chn oỏn v iu tr Bnh nhim trựng, Bnh vin Bnh Nhit i, Thnh ph H Chớ Minh Dng ỡnh Thin (2006), Dch t hc lõm sng, Nh xut bn y hc Nguyn Vn Tun (2008), Y hc thc chng, Nh xut bn y hc Ti liu Ting Anh Astrid de Greeff,Andrea Hamilton,Iain C Sutcliffe,Herma Buys,Loek van Alphen, Hilde E Smith (2003), Lipoprotein signal peptidase of Streptococcus suis serotype 2, Microbiology, 149, 13991407 Benga L, Goethe R, Rohde M, Valentin-Weigand P (2004), Non-encapsulated strains reveal novel insights in invasion and survival of Streptococcus suis in epithelial cells, Cell Microbioly, 6(9),867881 Berthelot-Herault F, Cariolet R, Labbe A, Gottschalk M, Cardinal JY, Kobisch M (2001), Experimental infection of specific pathogen free piglets with French strains of Streptococcus suis capsular Type Can J Vet Res, 65(3),196200 Berthelot-Herault F, Gottschalk M, Morvan H, Kobisch M (2005), Dilemma of virulence of Streptococcus suis: Canadian isolate 89-1591 characterized as a virulent strain using a standardized experimental model in pigs, Can J Vet Res., 69(3), 236240 Chang B, Wada A, Ikebe T, Ohnishi M, Mita K, Endo M, Matsuo H, Asatuma Y, Kuramoto S, Sekiguchi H, Yamazaki M, Yoshikawa H, Watabe N, Yamada H, Kurita S, Imai Y, Watanabe H (2006), Characteristics of Streptococcus suis Isolated from Patients in Japan, Jpn J Infect Dis., 59 (6), 397-399 ng Th Kiu Oanh 77 Cao hc K18 Lun thc s hc Vi sinh vt 10 Constance Schultsz, Ewout Jansen, Wendy Keijzers, Anja Rothkamp, Birgitta Duim, A Wagenaar, Arie van der Ende (2012), Differences in the Population Structure of Invasive Streptococcus suis Strains Isolated from Pigs and from Humans in the Netherlands,PLoS ONE, 7(5), 11 Corinne Marois, Laởtitia Le Devendec, Marcelo Gottschalk, and Marylốne Kobisch (2006), Molecular characterization of Streptococcus suis strains by 16S 23S intergenic spacer polymerase chain reaction and restriction fragment length polymorphism analysis, Can J Vet Res, 70(2): 94104 12 Dan Takeuchi,Anusak Kerdsin, Anupong Pienpringam, Phacharaphan Loetthong, Sutit Samerchea, Pakkinee Luangsuk, Kasean Khamisara, Nithita Wongwan, Prasanee Areeratana, Piphat Chiranairadul, Suwat Lertchayanti, Sininat Petcharat, Amara Yowang, Phanupong Chaiwongsaen,Tatsuya Nakayama, Yukihiro Akeda, Shigeyuki Hamada, Pathom Sawanpanyalert, Surang Dejsirilert, Kazunori Oishi (2012), Population-Based Study of Streptococcus suis Infection in Humans in Phayao Province in Northern Thailand, PLoS One, 7(2): e31265 13 Dang Trung Nghia Ho, Thi Phuong Tu Le, Marcel Wolbers, Quang Thai Cao,Van Minh Hoang Nguyen, Vu Thieu Nga Tran, Thi Phuong Thao Le, Hoan Phu Nguyen, Thi Hong Chau Tran, Xuan Sinh Dinh, Song Diep To, Thi Thanh Hang Hoang, Truong Hoang, James Campbell, Van Vinh Chau Nguyen, Tran Chinh Nguyen, Van Dung Nguyen, Thi Hoa Ngo, Brian G Spratt, Tinh Hien Tran, Jeremy Farrar,Constance Schultsz (2011), Risk Factors of Streptococcus suis Infection in Vietnam A Case-Control Study, PLoS One, 6(3), e17604 14 De Greeff A, Buys H, Verhaar R, Dijkstra J, Van Alphen L, Smith HE (2002), Contribution of fibronectin-binding protein to pathogenesis of Streptococcus suis serotype 2, Infect Immun,70(3),13191325 15 Esgleas M, Dominguez-Punaro Mde L, Li Y, Harel J, Dubreuil JD, Gottschalk M (2009), Immunization with SsEno fails to protect mice against challenge with Streptococcus suis serotype 2, FEMS Microbiol Lett., 294(1),8288 ng Th Kiu Oanh 78 Cao hc K18 Lun thc s hc Vi sinh vt 16 Esgleas M, Lacouture S, Gottschalk M (2005), Streptococcus suis serotype binding to extracellular matrix proteins, FEMS Microbiol Lett., 244(1),3340 17 Ferrando ML, Fuentes S, De Greeff A, Smith H, Wells JM (2010), ApuA, a multifunctional -glucan-degrading enzyme of Streptococcus suis, mediates adhesion to porcine epithelium and mucus, Microbiology, 156(Pt 9),28182828 18 Ge J, Feng Y, Ji H et al (2009), Inactivation of dipeptidyl peptidase IV attenuates the virulence of Streptococcus suis serotype that causes streptococcal toxic shock syndrome, Curr Microbiol, 59(3),248255 19 Gottschalk M., Karriker L, Ramirez A, Schwartz KJ, Stevenson G, Zimmerman J (Eds) (2011), Streptococcosis In: Diseases of Swine, Wiley Publishers, NJ, USA 20 Gottschalk MG, Lacouture S, Dubreuil JD.( (1995), Characterization of Streptococcus suis capsular type haemolysin, Microbiology, 141(Pt 1),189195 21 Gottschalk M, Segura M (2000), The pathogenesis of the meningitis caused by Streptococcus suis: the unresolved questions, Vet Microbiol.,76(3),259272 22 Gottschalk M, Xu J, Calzas C, Segura M (2010), Streptococcus suis: a new emerging or an old neglected zoonotic pathogen, Fut Microbiol.,5(3),371391 23 Heiman F L Wertheim, Ho Dang Trung Nghia, Walter Taylor, Constance Schultsz (2009), Streptococcus suis: An Emerging Human Pathogen, Clin Infect Dis., 48 (5): 617-625 24 Henegariu O, Heerema NA, Dlouhy SR, Vance GH, Vogt PH (1997), Multiplex PCR: critical parameters and step-by-step protocol, BioTechniques, 23(3), 504-511 25 Henk J Wisselink, Jeroen J Joosten, and Hilde E Smith (2002), Multiplex PCR Assays for Simultaneous Detection of Six Major Serotypes and Two VirulenceAssociated Phenotypes of Streptococcus suis in Tonsillar Specimens from Pigs, J Clin Microbiol., 40(8): 29222929 26 Hilde E Smith, Vincent Veenbergen, Joeke van der Velde, Marloes Damman, Henk J Wisselink,Mari A Smits (1999), The cps Genes of Streptococcus suis Serotypes 1, 2, and 9: Development of Rapid Serotype-Specific PCR Assays, J Clin Microbiol.,37 (10), 3146-3152 ng Th Kiu Oanh 79 Cao hc K18 Lun thc s hc Vi sinh vt 27 Ho Dang Trung Nghia, Ngo Thi Hoa, Le Dieu Linh, James Campbell, To Song Diep, Nguyen Van Vinh Chau, Nguyen Thi Hoang Mai, Tran Tinh Hien, Brian Spratt, Jeremy Farrar, Constance Schultsz (2008), Human Case of Streptococcus suis Serotype 16 Infection, Emerg Infect Dis., 14(1), 155157 28 Hongjie Yu, Huaiqi Jing, Zhihai Chen, Han Zheng, Xiaoping Zhu, Hua Wang, Shiwen Wang, Lunguang Liu, Rongqiang Zu, Longze Luo, Nijuan Xiang, Honglu Liu, Xuecheng Liu, Yuelong Shu, Shui Shan Lee, Shuk Kwan Chuang, Yu Wang, Jianguo Xu, Weizhong Yang, and the Streptococcus suis study groups2 (2006), Human Streptococcus suis Outbreak, Sichuan, China, Emerging Infectious Diseases, 12 (6), 914-920 29 Hsih-Yen Tsai, Liao CH, Liu CY, Huang YT, Teng LJ, Hsueh PR (2012), Streptococcus suis infection in Taiwan, 2000-2011, Diagnostic microbiology and infectious disease, 74(1),75-7 30 Kay R, Cheng AF, Tse CY., (1995), Streptococcus suis infection in Hong Kong., QJM., 8(1), 39-47 31 Kerdsin A, Dejsirilert S, Sawanpanyalert P et al.(2011), Sepsis and spontaneous bacterial peritonitis in Thailand Lancet, 378(9794),960 32 Lalonde M, Segura M, Lacouture S, Gottschalk M (2000), Interactions between Streptococcus suis serotype and different epithelial cell lines, Microbiology, 146(Pt 8), 19131921 33 Lecours MP, Fittipaldi N, Takamatsu D, Okura M, Segura M, Goyette-Desjardins G, Van Calsteren MR, Gottschalk M (2012), Sialylation of Streptococcus suis serotype is essential for capsule expression but is not responsible for the main capsular epitope, Microbes Infect., 14(11), 941-950 34 Liu LN, Hu FQ, Zhu JM, Zhao Y, Pan Q, Li M, Tang JQ (2007), Study on expression of Streptococcus suis serotype sly gene, purification and activity of its product, Zhonghua Liu Xing Bing Xue Za Zhi.,28(12):1198-202 ng Th Kiu Oanh 80 Cao hc K18 Lun thc s hc Vi sinh vt 35 Lun ZR, Wang QP, Chen XG, Li AX, Zhu XQ (2007), Streptococcus suis: an emerging zoonotic pathogen, Lancet Infect Dis.,7(3):201-9 36 M Gottschalk, R Higgins, M Jacques, K R Mittal, and J Henrichsen (1989), Description of 14 new capsular types of Streptococcus suis, J Clin Microbiol., 27(12): 26332636 37 Ma E, Chung PH, So T, Wong L, Choi KM, Cheung DT, Kam KM, Chuang SK, Tsang T, ; Collaborative Study Group on Streptococcus suis infection in Hong Kong (2008), Streptococcus suis infection in Hong Kong: an emerging infectious disease?, Epidemiol Infect., 136(12):1691-7 38 Markoulatos P, Mangana-Vougiouka O, Koptopoulos G, Nomikou K, Papadopoulos O (2000), Detection of sheep poxvirus in skin biopsy samples by a multiplex polymerase chain reaction, J Virol Methods., 84(2):161-7 39 Marois C, Bougeard S, Gottschalk M, Kobisch M (2004), Multiplex PCR assay for detection of Streptococcus suis species and serotypes and 1/2 in tonsils of live and dead pigs, J Clin Microbiol., 42(7):3169-75 40 Mohini Joshi, Dr.Deshpande J.D (2010), Polymerase chain reaction: Methods, principles and application, International Journal of Biomedical Research, 1(5), 81-97 41 M S Princivalli1, C Palmieri1, G Magi1, C Vignaroli1, A Manzin2, A Camporese3, S Barocci4, C Magistrali4, B Facinelli (2009), Genetic diversity of streptococcus suis clinical isolates from pigs and humans in Italy (2003-2007), Euro Surveill., 14(33) pii: 19310 42 Nahuel Fittipaldi, Mariela Segura1, Daniel Grenier, Marcelo Gottschalk (2012), Virulence factors involved in the pathogenesis of the infection caused by the swine pathogen and zoonotic agent Streptococcus suis, Future Microbiology, (2), 259-279 43 Nguyen Thi Hoang Mai, Ngo Thi Hoa,Tran Vu Thieu Nga,Le Dieu Linh,Tran Thi Hong Chau,Dinh Xuan Sinh, Nguyen Hoan Phu,Ly Van Chuong,To Song Diep,James Campbell,Ho Dang Trung Nghia,Tran Ngoc Minh,Nguyen Van Vinh Chau,Menno D de Jong, Nguyen Tran Chinh, Tran Tinh Hien, Jeremy Farrar, Constance Schultsz ng Th Kiu Oanh 81 Cao hc K18 Lun thc s hc Vi sinh vt (2008), Streptococcus suis Meningitis in Adults in Vietnam, Clin Infect Dis., 46 (5): 659-667 44 Norton PM, Rolph C, Ward PN, Bentley RW, Leigh JA (1999), Epithelial invasion and cell lysis by virulent strains of Streptococcus suis is enhanced by the presence of suilysin, FEMS Immunol Med Microbiol.,26(1),2535 45 P Markoulatos, N Siafakas, M Moncany (2002), Multiplex polymerase chain reaction: A practical approach, Journal of Clinical Laboratory Analysis, 16(1), 4751 46.Pan X, Ge J, Li M et al.(2009), The orphan response regulator CovR: a globally negative modulator of virulence in Streptococcus suis serotype 2, J Bacteriol., 191(8), 26012612 47 Pian Y, Gan S, Wang S, Guo J, Wang P, Zheng Y, Cai X, Jiang Y, Yuan Y (2012), " Fhb, a Novel Factor H-Binding Surface Protein, Contributes to the Antiphagocytic Ability and Virulence of Streptococcus suis, Infect Immun.,80(7):2402-13 48 R Higgins, M Gottschalk, M Boudreau,A Lebrun, J Henrichsen (1995), Description of six new capsular types (29-34) of Streptococcus suis, J Vet Diagn Invest, 7, 405-406 49 Salles MW, Perez-Casal J, Willson P, Middleton DM (2002), Changes in the leukocyte subpopulations of the palatine tonsillar crypt epithelium of pigs in response to Streptococcus suis Type infection,Vet Immunol Immunopathol., 87(12),5163 50 Samantha J King, Andrew G Allen, Duncan J Maskell, Christopher G Dowson and Adrian M Whatmore(2004), Distribution, Genetic Diversity, and Variable Expression of the Gene Encoding Hyaluronate Lyase within the Population Streptococcus suis, J Bacteriol., 186(14), 4740 51 Seong-Min Choi, Bang-Hoon Cho, Kang-Ho Choi, Tai-Seung Nam, Joon-Tae Kim, Man-Seok Park, Byeong C Kim, Myeong-Kyu Kim, Ki-Hyun Cho (2012), Meningitis Caused by Streptococcus suis, J Clin Neurol, 8, 79-82 ng Th Kiu Oanh 82 Cao hc K18 Lun thc s hc Vi sinh vt 52 Smith HE, Buijs H, De Vries RR, Wisselink HJ, Stockhofe-Zurwieden N, Smits MA (2001) Environmentally regulated genes of Streptococcus suis: identification by the use of iron-restricted conditions in vitro and by experimental infection of piglets, Microbiology, 147(Pt 2),271280 53 Staats JJ, Feder I, Okwumabua O, Chengappa MM (1997), Streptococcus suis: past and present, Vet Res Commun.,21(6),381-407 54 Tang Y, Zhang X, Wu W, Lu Z, Fang W (2012), Inactivation of the sodA gene of Streptococcus suis type encoding superoxide dismutase leads to reduced virulence to mice, Vet Microbiol.,158(3-4), 360-6 55 Vanier G, Sekizaki T, Dominguez-Punaro MC et al (2008), Disruption of srtA gene in Streptococcus suis results in decreased interactions with endothelial cells and extracellular matrix proteins, Vet Microbiol., 127(34),417424 56 Wangkaew S, Chaiwarith R, Tharavichitkul P, Supparatpinyo K (2006), Streptococcus suis infection: a series of 41 cases from Chiang Mai University Hospital, J Infect., 52(6), 455-60 57 Wu T, Chang H, Tan C, Bei W, Chen H, (2009), The orphan response regulator RevSC21 controls the attachment of Streptococcus suis serotype-2 to human laryngeal epithelial cells and the expression of virulence genes, FEMS Microbiol Lett., 292(2),170181 58 Zhang A, Chen B, Mu X et al (2009), Identification and characterization of a novel protective antigen, Enolase of Streptococcus suis serotype 2, Vaccine 27(9),13481353 59 Zhang A, Mu X, Chen B et al (2010), Identification and characterization of IgA1 protease from Streptococcus suis, Vet Microbiol., 140(12),171175 ng Th Kiu Oanh 83 Cao hc K18 [...]... công sức và có độ đặc hiệu cao Đặng Thị Kiều Oanh 1 Cao học K18 Luận văn thạc sĩ học Vi sinh vật Chính vì vậy, chúng tôi đã thực hiện đề tài Nghiên cứu phát triển và hoàn thiện quy trình PCR đa mồi để phát hiện trực tiếp Streptococcus suis từ dịch não tủy của người với 2 mục tiêu chính sau đây: - Xây dựng quy trình PCR đa mồi phát hiện trực tiếp S suis ở bệnh phẩm người; - Xây dựng quy trình xử lý... phương pháp hiện đại, nhanh và chính xác, phương pháp PCR đa mồi (nhân gen đa mồi) là phương pháp có tính khả thi hơn cả về mặt kinh tế và kỹ năng thực hiện so với phương pháp PCR định lượng (Real time PCR) Với phương pháp PCR đa mồi, chúng ta có thể đồng thời phát hiện được sự có mặt của vi khuẩn S suis, xác định được typ huyết thanh (typ 2) và có thể một hoặc vài gen độc lực của vi khuẩn Phương pháp... Streptococcus suis A7 6 Streptococcus suis D12 7 Streptococcus suis D9 8 Streptococcus suis GZ1 9 Streptococcus suis JS14 10 Streptococcus suis SC84 11 Streptococcus suis SS12 12 Streptococcus suis ST1 13 Streptococcus suis ST3 Streptococcus suis 14 05HAS68 Streptococcus suis 15 89/1591 16 Streptococcus suis R61 17 Streptococcus suis S735 Chr Plasmids KT (Mb) GC % Gene Protein 1 1 1 1 1 1 1 1 1 - 2.04 2.18... deminase và các protein gắn IgG Có 17 chủng S suis đã được giải trình tự gen Tùy từng chủng, bộ ben có kích thước từ 2,01 đến 2,18 Mb với tỷ lệ GC từ 41 đến 41,7% Trong bộ gen của 17 chủng chứa từ 1607 đến 2427 gen và có từ 1559 đến 2334 loại protein (Bảng 1.1) Bảng 1.1 Hệ gen của một số chủng Sreptococcus suis Chromosomes [13] TT Vi sinh vật 1 S suis 05ZYH33 2 Streptococcus suis P1/7 Streptococcus suis. .. tuổi> 50 DNA của vi khuẩn vẫn được phát hiện trong 58 (63%) trong tổng số 92 mẫu dịch não tủy sau 6-10 ngày điều trị kháng sinh 91/92 mẫu dịch não tủy nhiễm chủng S suis có týp huyết thanh 2 [43] 1.3 BỆNH VÀ TRIỆU CHỨNG 1.3.1 Đường lây truyền Streptococcus suis có thể lây truyền qua người khi tiếp xúc với lợn bệnh hay lợn mang vi khuẩn qua các tổn thương nhỏ, trầy xước trên da của những người giết mổ,... ương S suis có thể kích thích các tế bào BMEC tiết acid arachidonic, tạo điều kiện thuận lợi cho vi khuẩn xâm nhập vào hệ thần kinh trung ương [135] Các nghiên cứu khác đã chỉ ra rằng S suis có thể kích thích tế bào BMEC của người và lợn tiết ra các cytokine tiền viêm và chemokines, tiểu thần kinh đệm và các tế bào hình sao ở chuột [42] 1.2 SỰ LÂY NHIỄM TRÊN NGƯỜI CỦA S .suis Streptococcus suis (S suis) ... bệnh khác, S suis phải vượt qua hàng rào máu não (BBB) và / hoặc chất dịch máu não tủy (CSF) để gây ra nhiễm trùng hệ thần kinh trung ương BBB là một rào cản duy nhất về giải phẫu và chức năng ngăn cách giữa não và nội mạch bằng cách duy trì sự cân bằng nội môi của môi trường hệ thần kinh trung ương [42] Các loại tế bào chính của hàng rào máu não là tế bào nội mô vi mạch của não( BMEC) S .suis bám dính... nghiêm trọng của vi khuẩn Streptococcus suis (S suis) như một tác nhân gây bệnh nguy hiểm cho người và có tiềm năng gây các vụ bùng phát dịch Tại Việt Nam, nhiễm trùng cấp tính ở người do S suis đã và đang được coi là một bệnh nhiễm trùng mới nổi, có khả năng gây tỷ lệ tử vong và di chứng cao Rất nhiều trường hợp mắc bệnh có các biểu hiện lâm sàng rất nặng như: nhiễm khuẩn huyết, viêm màng não có ban... polysaccharide (CPS) của chúng Sự bám dính và sự xâm nhập của S .suis vào tế bào biểu mô HEP-2 ở người diễn ra mạnh mẽ hơn ở những chủng không có vỏ đã được báo cáo bởi Benga et al [6] Vì vậy, điều đó có thể được đưa ra giả thuyết rằng S suis giảm sự biểu hiện của CPS trong các bước đầu của quá trình lây nhiễm Giả thuyết này cần được nghiên cứu sâu hơn S suis tương tác với các thành phần của chất nền ngoại... thế giới và hầu hết ở các nước có ngành chăn nuôi lợn phát triển Các biểu hiện bệnh lý của lợn bao gồm viêm màng não, viêm khớp, viêm phổi, nhiễm trùng huyết, viêm nội tâm mạc, các ổ áp xe Nghiêm trọng hơn, vi khuẩn có thể gây bệnh cho người với các biểu hiện của viêm màng não, nhiễm trùng máu, viêm nội tâm mạc v.v Chính vì vậy, bệnh được xếp vào nhóm các bệnh chung của người và động vật S suis lần