Đang tải... (xem toàn văn)
Luận văn thực hiện với 2 mục tiêu chính sau đây: Xây dựng quy trình PCR đa mồi phát hiện trực tiếp S. suis ở bệnh phẩm người; xây dựng quy trình xử lý bệnh phẩm đơn giản, dễ thực hiện để bộc lộ DNA của S. suis.
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Đặng Thị Kiều Oanh NGHIÊN CỨU PHÁT TRIỂN VÀ HỒN THIỆN QUY TRÌNH PCR ĐA MỒI PHÁT HIỆN TRỰC TIẾP Streptococcus suis TỪ DỊCH NÃO TỦY NGƯỜI LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội – 2013 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Đặng Thị Kiều Oanh NGHIÊN CỨU PHÁT TRIỂN VÀ HỒN THIỆN QUY TRÌNH PCR ĐA MỒI PHÁT HIỆN TRỰC TIẾP Streptococcus suis TỪ DỊCH NÃO TỦY NGƯỜI Chun ngành: Vi sinh vật học Mã số: 60 42 40 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS. PHAN LÊ THANH HƯƠNG Hà Nội 2013 Luận văn thạc sĩ Vi sinh vật học LỜI CẢM ƠN Để hồn thành luận văn này, tơi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS. Phan Lê Thanh Hương, Trưởng Khoa Vi Khuẩn, Trưởng Phòng Vi khuẩn hơ hấp, Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương đã tận tình hướng dẫn, động viên và tạo mọi điều kiện để tơi hồn thành đề tài Tơi cũng xin bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc tới TS. Nguyễn Thanh Thủy – Trưởng Khoa An tồn sinh học Quản lý chất lượng, Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương và tập thể Khoa đã tạo mọi điều kiện về thời gian cho tơi thực hiện đề tài Tơi xin cảm ơn tập thể Phòng Vi khuẩn hơ hấp, Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương học đã chỉ bảo, giúp đỡ, chia sẻ tận tình cho tơi những kinh nghiệm chun mơn trong q trình làm thực nghiệm Tơi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến các thầy, các cơ trong Khoa sinh học, đặc biệt là các thầy cơ trong Bộ mơn Vi sinh vật học, trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội đã tạo điều kiện cho tơi trong q trình học tập Tơi xin cảm ơn gia đình và bạn bè ln ln động viên tinh thần để tơi hồn thành luận văn này Hà Nội, ngày tháng năm 2013 Học viên Đặng Thị Kiều Oanh Đặng Thị Kiều Oanh Cao học K18 Luận văn thạc sĩ Vi sinh vật học Đặng Thị Kiều Oanh Cao học K18 Luận văn thạc sĩ Vi sinh vật học MỤC LỤC Capsular polysaccharide 10 Deoxyribonucleic acid 10 Polymerase chain reaction 10 ĐẶT VẤN ĐỀ 1 1.1. GIỚI THIỆU VỀ Streptococcus suis.suis 3 1.1.1. Giới thiệu chung 3 1.1.2. Một số yếu tố độc lực chính của vi khuẩn liên quan đến chẩn đốn 5 1.1.3. Cơ chế gây bệnh của S.suis 7 1.2. SỰ LÂY NHIỄM TRÊN NGƯỜI CỦA S.suis 16 1.3. BỆNH VÀ TRIỆU CHỨNG 20 1.3.1. Đường lây truyền 20 1.3.2. Triệu chứng 21 1.3.3. Biện pháp phòng bệnh 22 1.3.4. Biện pháp chống dịch 23 1.3.5. Nguyên tắc điều trị 23 1.4. CÁC PHƯƠNG PHÁP CHẨN ĐỐN PHỊNG THÍ NGHIỆM 24 1.4.1. Nuôi cấy phân lập 24 1.4.2. Nhuộm Gram 24 1.4.3. Phản ứng catalase 24 1.4.4. Xét nghiệm định danh, định typ: 24 1.4.5. Phát hiện vi khuẩn S. suis b ằng ph ản ứng Realtime PCR 25 1.5. PHƯƠNG PHÁP PCR 26 1.5.1. Giới thiệu v ề ph ương pháp khuếch đại gen (polymerase chain reaction – PCR) 26 1.5.2. Nguyên lý cơ bản của kỹ thuật PCR 27 1.5.3. Giới thiệu v ề ph ản ứng PCR đa mồi 31 CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 37 2.1 .VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 37 2.1.1. Chủng vi khu ẩn s ử dụng trong nghiên cứu 37 2.1.2. Dịch não tủy nền 38 Đặng Thị Kiều Oanh Cao học K18 Luận văn thạc sĩ Vi sinh vật học 2.1.3. Dịch não tủy của bệnh nhân đượ c chẩn đoán lâm sàng viêm màng não cấp tính do S. suis (để đánh giá hiệu quả của quy trình PCR đa mồi được xây dựng trong đề tài): 38 2.1.4. Sinh phẩm nghiên cứu: 38 2.1.5. Trang thi ết bị, dụng c ụ 41 2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU: 41 2.2.1. Nghiên cứu tạo bệnh phẩm mô phỏng 42 2.2.2. Nghiên cứu lựa chọn tổ hợp mồi đại diện cho S. suis và một số yếu tố chủ yếu liên quan đến độc lực của vi khuẩn 48 2.2.3. Nghiên cứu tối ưu chu trình nhiệt 49 2.2.4. Nghiên cứu tối ưu các thành phần tham gia ph ản ứng 51 2.2.5. Nghiên cứu mức độ phát hiện vi khuẩn S. suis và một số yếu tố độc lực của vi khuẩn bởi quy trình PCR đa mồi đượ c xây dựng trong nghiên cứu. Tính ổn định của PCR đa mồi. 52 2.2.6. Đánh giá tính đặc hiệu của các cặp mồi (khả năng bắt cặp chéo) với những vi khuẩn phổ bi ến gây hội chứng lâm sàng viêm màng não giống S. suis 52 2.2.7. Xây dựng quy trình xử lý bệnh phẩm để tách chiết DNA của S. suis 53 2.3. ĐÁNH GIÁ CÁC GIÁ TRỊ HỮU ÍCH CỦA PHƯƠNG PHÁP 54 2.3.1. Tiêu chuẩn xác định chẩn đốn dương tính và âm tính 54 2.3.2. Các chỉ số tính tốn độ tin cậy và giá trị của phương pháp [3, 4] 55 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 57 3.1 XÂY DỰNG QUY TRÌNH PCR ĐA MỒI PHÁT HIỆN TRỰC TIẾP Streptococcus suis VÀ MỘT SỐ ĐỘC LỰC PHỔ BIẾN CỦA VI KHUẨN 57 3.1.1. Tạo bệnh ph ẩm mô phỏng 57 3.1.2. Lựa chọn các cặp mồi và tổ hợp mồi phù hợp: 58 3.1.3. Xác định điều kiện tối ưu của phản ứng PCR đa mồi phát hiện S. suis và một số yếu tố độc lực phổ biến 60 61 61 3.1.4. Tối ưu hóa các thành phần tham gia ph ản ứng PCR đa mồi phát hiện vi khuẩn S. suis và một số yếu tố độc lực phổ biến 62 65 Đặng Thị Kiều Oanh Cao học K18 Luận văn thạc sĩ Vi sinh vật học 65 3.1.5. Độ nhạy và tính ổn định của quy trình PCR đượ c xây dựng (khả năng lặp lại kết quả) 67 Độ lặp lại của kỹ thuật 68 (10 lần thử nghiệm) 68 1 68 0/10 68 3.1.6. Đánh giá khả năng bắt cặp chéo của các cặp mồi (tính đặc hiệu) với những vi khuẩn phổ bi ến gây bệnh cảnh lâm sàng giống S. suis 69 3.2. XÂY DỰNG QUY TRÌNH XỬ LÝ BỆNH PHẨM ĐƠN GIẢN, DỄ THỰC HIỆN ĐỂ BỘC LỘ DNA CỦA VI KHUẨN Streptococcus suis ĐẠT HIỆU QUẢ (ĐÁNH GIÁ BẰNG KẾT QUẢ PHÁT HIỆN CỦA PCR ĐA MỒI) 70 3.3. ĐÁNH GIÁ CÁC GIÁ TRỊ HỮU ÍCH CỦA PHƯƠNG PHÁP PCR ĐA MỒI KHI ÁP DỤNG VỚI BỆNH PHẨM LÂM SÀNG 75 3.3.1. Kết quả nuôi cấy phân lập/xác định đượ c vi khuẩn từ bệnh phẩm: 75 3.3.2. Các chi số đánh giá độ chính xác và giá trị hữu ích của các phươ ng pháp 76 KẾT LUẬN 80 TÀI LIỆU THAM KHẢO 83 Đặng Thị Kiều Oanh Cao học K18 Luận văn thạc sĩ Vi sinh vật học DANH MỤC HÌNH Hình 1.1: Vi khuẩn liên cầu lợnliên cầu khuẩn lợn qua kính hiển vi điện tử 3 (http://genome.jgipsf.org/strsu/strsu.home.html) 3 Hình 1.2: Khuẩn lạc S. suis trên mơi trường thạch máu cừu và thạch máu ngựa 4 Hình 1.3. Bệnh nhân bị nhiễm S. suis (http://www.pig333.com/what_the_experts_say/streptococcussuis zoonoticepidemicinasia_4091/) 22 Hình 1.4. Sơ đồ phản ứng PCR 27 (http://fmel.ifas.ufl.edu/buzz/csPCR.shtml) 28 Hình 3.1. Thử nghiệm các tổ hợp mồi phù hợp (từ tổ hợp 1 đến tổ hợp 8) 58 Hình 3.2.Thử nghiệm các tổ hợp mồi phù hợp (từ tổ hợp 9 đến tổ hợp 16) 59 Hình 3.3. PCR đa mồi với các điều kiện phản ứng tối ưu phát hiện trực tiếp S. suis trong bệnh phẩm 62 Hình 3.4. Thử nghiệm hàm lượng các mồi với nồng độ mỗi mồi là 20pmol/µl 64 Hình 3.5. Thử nghiệm hàm lượng mồi với nồng độ mồi khác nhau 65 Hình 3.6. Thử nghiệm Quy trình PCR đã xây dựng trên mẫu bệnh phẩm 66 với các thể tích mẫu khác nhau 66 Hình 3.7. Mức độ phát hiện vi khuẩn S. suis và 2 yếu tố độc lực của vi khuẩn bởi PCR đa mồi đã hồn thiện (kết quả với bệnh phẩm mơ phỏng) 67 Đặng Thị Kiều Oanh Cao học K18 Luận văn thạc sĩ Vi sinh vật học Hình 3.8. Kiểm tra tính đặc hiệu của tổ hợp gen mồimồi & quy trình PCR đa mồi 69 Hình 3.9. Xử lý mẫu bệnh phẩm dịch não tủy ở nhiệt độ 850C và 900C trong 60 phút 71 Hình 3.10. Hiệu quả xử lý dịch não tủy ở nhiệt độ 800C với thời gian ủ khác nhau 72 Hình 3.11. Hiệu quả xử lý dịch não tủy bằng Kit và bằng nhiệt độ 800C/60’ 73 Hình 3.12. Hiệu quả xử lý dịch não tủy của bệnh nhân ở 800C/60’(đánh giá bởi PCR đơn mồi) 74 Hình 3.13. Ứng dụng quy trình PCR đa mồi đã được xây dựng trên mẫu bệnh phẩm 75 Đặng Thị Kiều Oanh Cao học K18 Luận văn thạc sĩ Vi sinh vật học Số bệnh phẩm xác định là S. suis bằng PCR đa mồi: 53 mẫu (53/53 trường hợp nhiễm S. suis ) 3.3.2. Các chi số đánh giá độ chính xác và giá trị hữu ích của các phương pháp Trong trường hợp tiêu chuẩn để xác định viêm màng não do S. suis là phải dương tính ở phương pháp ni cấy phân lập (được coi như chuẩn vàng) Số mẫu được phân tích bao gồm: tổng số mẫu bệnh phẩm được chẩn đốn lâm sàng VMN mủ nghi do vi khuẩn S. suis là 44 mẫu và số mẫu âm tính thực sự (100 mẫu): n = 44 +100 = 144 Bảng 3.8. Độ nhạy và độ đặc hiệu của phương pháp PCR đa mồi so với phương pháp ni cấy phân lập (chuẩn vàng) với n = 144 Kết quả chẩn đốn S. suis bằng ni cấy phân lập Dương tính Âm tính Phương pháp Dương tính đa mồi PCR (phương pháp Âm tính thử nghiệm) Tổng Chỉ số đánh giá độ chính xác Tổng 44 144 100 100 44 100 144 Phương pháp nuôi cấy Độ nhạy Độ đặc hiệu 100% 100% Phương pháp PCR đa mồi 100% 100% Kết quả Bảng 3.8 cho thấy, phương pháp PCR đa mồi phát hiện liên cầu lợnliên cầu khuẩn lợn khi so với ni cấy phân lập có độ nhạy đạt 100% và độ đặc hiệu đạt 100%. Đặng Thị Kiều Oanh 76 Cao học K18 Luận văn thạc sĩ Vi sinh vật học Trong trường hợp này tiêu chuẩn để xác định viêm màng não do S. suis là dương tính với 1 trong hai phương pháp là ni cấy phân lập hoặc PCR đa mồi Số mẫu được phân tích bao gồm: tổng số mẫu bệnh phẩm được chẩn đốn lâm sàng VMN mủ nghi do vi khuẩn S. suis là 53 mẫu và số mẫu âm tính thực sự (100 mẫu): n = 53 +100 = 153 Bảng 3.9. So sánh kết quả ba hai phương pháp: PCR đơn mồi, đa mồi và ni cấy phân lậpNCPL Kỹ thuật chẩn đốn Ni cấy phân lập PCR đa mồi PCR đa mồi Kết quả phát hiện vi khuẩn S. suis trong tổng số mẫu bệnh phẩm nghi ngờ (n = 53) Dương tính (+) Âm tính () (%) (%) Bệnh nhân được chẩn đoán lâm sàng VMN nghi do S. suis 44 (83,02%) 9 (16,98%) 53 53 (100%) 53 (100%) 0 (0%) 0 (0%) 53 53 Bảng 3.9 cho thấy kết quả phát hiện của PCR đơn mồi tương tự PCR đa mồi (có 3 cặp mồi khác nhau) và nhiều hơn phương pháp NCPL là 16,98%, nói cách khác tỷ lệ âm tính giả của NCPL là 16,98% Bảng 3.10. Các chỉ số đánh giá độ chính xác và sự hữu ích của phương pháp PCR đa mồi và ni cấy phân lập (n=153) Dương tính Phương pháp Âm tính đa mồi PCR Tổng Phương pháp Dương tính ni cấy phân lập Âm tính Tổng Kết quả chẩn đốn S. suis Dương Âm tính tính 53 0 100 53 100 44 100 53 100 Đặng Thị Kiều Oanh 77 Tổng 53 100 153 44 109 153 Cao học K18 Luận văn thạc sĩ Vi sinh vật học So sánh các giá trị của hai phương pháp với tổng số mẫu = 153 Phương pháp ni cấy Phương pháp PCR đa mồi Chỉ số đánh giá độ chính xác: Độ nhạy 83,02% 100% Độ đặc hiệu 100% 100% Tỷ lệ dương tính giả 0 Tỷ lệ âm tính giả 16,98% Chỉ số đánh giá sự hữu ích: LR+ LR 0,17 Giá trị dự đốn dương tính (PPV) 1.00 1.00 Giá trị dự đốn âm tính (NPV) 0.917 1.00 Kết quả Bảng 3.10 cho thấy, ph ương pháp PCR đa mồi phát hiện liên cầu lợnliên cầu khuẩn lợn có độ nhạy rất cao với 100%; trong khi đó phương pháp ni cấy có độ nhạy là 83,02%. Tỷ lệ âm tính giả của phương pháp PCR đa mồi là 0%, trong khi đó tỷ lệ âm tính giả của phương pháp ni cấy gần 17% (16,98%). Cả hai phương pháp đều có độ đặc hiệu 100% và tỷ lệ dương tính giả là 0%. Nếu xét nghiệm PCR đa mồi dương tính với vi khuẩn S. suis, xác xuất mắc bệnh là 100%, trong khi đó nếu ni cấy âm tính với S. suis, xác xuất khơng mắc bệnh do S. suis là 91,7%. Nói cách khác, giá trị dự đốn dương tính của PCR đa mồi và ni cấy là 100% và giá trị dự đốn âm tính của PCR đa mồi là 100% và của ni cấy là 91,7% Với điều kiện Việt Nam hiện nay, có nhiều lý do giá trị âm tính trong ni cấy có nhiều khả năng là âm tính giả (do dùng kháng sinh trước khi vào bệnh viện, vi khuẩn bị kháng sinh ức chế khơng phát triển được trên mơi trường ni cấy, do kỹ năng ni cấy khơng chuẩn, mơi trường ni cấy khơng đảm bảo chất lượng…), nhưng bệnh phẩm vẫn chứa DNA của vi khuẩn nên vẫn có kết dương tính khi sử dụng phương pháp PCR, vói lý do nh ư vậy nên các mẫu âm tính ni cấy nhưng dương tính PCR khơng thể coi là các mẫu âm tính thực (để tính theo cơng thức) được. Cũng như vậy, sẽ khơng chính xác nếu chỉ Đặng Thị Kiều Oanh 78 Cao học K18 Luận văn thạc sĩ Vi sinh vật học coi các mẫu bệnh phẩm phát hiện được vi khuẩn bằng ni cấy phân lập là tỷ lệ dương tính thực. Chúng tơi đã tính tốn độ nhạy, độ đặc hiệu và các giá trị hữu ích khác khi áp dụng PCR đa mồi trên 153 mẫu bệnh phẩm (bao gồm 53 mẫu của bệnh nhân có biểu hiện viêm màng não mủ nghi do vi khuẩn S. suis và 100 mẫu DNT của bệnh nhân viêm não do vi rut (dựa trên lâm sàng và xét nghiệm sinh hóa tế bào của DNT) dựa trên ngun tắc như sau: Đánh giá hiệu quả phát hiện của PCR đa mồi với qui định là d ương tính khi kết quả phát hiện vi khuẩn d ương tính ở phương pháp đã được coi là chuẩn vàng (ni cấy phân lập), khơng tính các trường hợp chỉ dương tính PCR đa mồi (là phương pháp đang được đánh giá) (n=144) Độ nhạy của mỗi phương pháp xét nghiệm khi so sánh với phương pháp được coi là ‘chuẩn vàng’ là tỷ lệ dương tính thực của mẫu bệnh phẩm mà xét nghiệm cần được so sánh có thể phát hiện được. Với cỡ mẫu là 144, phương pháp PCR đa mồi phát hiện liên cầu lợnliên cầu khuẩn lợn khi so với ni cấy phân lập có độ nhạy đạt 100% và độ đặc hiệu đạt 100%. Chỉ số LR+ cho thấy tỷ lệ dương tính thực của cả hai phương pháp như nhau và nếu đã phát hiện được vi khuẩn hay yếu tố di truyền của vi khuẩn thì chắc chắn là dương tính, chỉ số LR cho thấy tỷ lệ âm tính giả của PCR đa mồi áp dụng với S. suis là 0% So sánh hiệu quả phát hiện vi khuẩn của phương pháp PCR đa mồi với PCR đơn mồi và ni cấy phân lập.Trong tr ường hợp này tiêu chuẩn để xác định viêm màng não do S. suis là dương tính với 1 trong hai phương pháp: ni cấy phân lập hoặc PCR (n=153) Ở phần phân tích này, cơ sở để thiết lập các bảng tính tốn là: các mẫu được coi là dương tính khi có ít nhất một trong hai phương pháp dương tính và các mẫu âm tính khi cả hai phương pháp đều âm tính. Trong 53 mẫu bệnh phẩm từ 53 bệnh nhân được chẩn đốn lâm sàng là VMN nghi do S. suis có 44 mẫu ni cấy dương tính, 09 mẫu ni cấy âm tính Đặng Thị Kiều Oanh 79 Cao học K18 Luận văn thạc sĩ Vi sinh vật học Nếu phát hiện bằng PCR đa mồi có 100% số mẫu dương tính (53/53). Nếu tính theo quy định “viêm màng não xác định do S. suis là dương tính với 1 trong hai phương pháp: ni cấy phân lập hoặc PCR” thì độ nhạy của phương pháp ni cấy là 83,02% và độ nhạy của PCR đa mồi là 100% (Bảng 3.10), tính xác thực của PCR đa mồi được kiểm chứng với PCR đơn mồi (quy trình chuẩn của phòng thí nghiệm Liên cầu, Viện Quốc gia các Bệnh nhiễm trùng, Tokyo, Nhật Bản) Trong trường hợp này, độ đặc hiệu của phương pháp PCR đa mồi khi so sánh với ni cấy phân lập là 100% hay tỷ lệ âm tính giả của phương pháp PCR đa mồi là 0%, trong khi đó tỷ lệ âm tính giả phương pháp ni cấy xấp xỉ 17% (Bảng 3.10). Ngồi ra, chúng tơi sử dụng mồi tham khảo từ tài liệu khoa học đã cơng bố cho kỹ thuật PCR đa mồi thử nghiệm này nên tổ hợp mồi đã lựa chọn cũng đã được khảo sát tính đặc hiệu. KẾT LUẬN Xây dựng được quy trình PCR đa mồi phát hiện trực tiếp vi khuẩn S. suis (liên cầu lợnliên cầu khuẩn lợn) và một số yếu tố độc lực cơ bản của vi khuẩn ở bệnh phẩm người đạt các u cầu về giới hạn phát hiện/độ nhạy và tính đặc hiệu/độ đặc hiệu và tính lặp lại kết quả như sau: Với bệnh phẩm mơ phỏng (đảm bảo giống bệnh phẩm thật bao gồm vi khuẩn được thuần nhất và chuẩn độ trong dịch não tủy của người (từ bệnh nhân bị hội chứng não cấp): + Giới hạn phát hiện đạt 1 vi khuẩn/1 ống phản ứng Đặng Thị Kiều Oanh 80 Cao học K18 Luận văn thạc sĩ Vi sinh vật học + Tính đặc hiệu: khơng có hiện tượng bắt cặp nhầm với vi khuẩn khác loại Với bệnh phẩm lâm sàng: + Độ nhạy: đạt 100% + Độ đặc hiệu so với các phương pháp phát hiện khác (ni cấy phân lập, PCR đơn mồi): đạt 100% Khả năng lặp lại kết quả của PCR đa mồi: đạt 100% với bệnh phẩm mơ phỏng và bệnh phẩm lâm sàng Xây dựng được quy trình xử lý mẫu bệnh phẩm dịch não tủy đơn giản không dùng sinh phẩm thương mại mà vẫn đạt hiệu quả phát hiện bằng PCR đa mồi: Xử lý bằng nhiệt độ 800C/60 phút Đảm bảo chất lượng (bộc lộ DNA của vi khuẩn, khử chất ức chế…) tương đương như khi tách chiết bằng bộ sinh phẩm Đặng Thị Kiều Oanh 81 Cao học K18 Luận văn thạc sĩ Vi sinh vật học KIẾN NGHỊ Phương pháp PCR đa mồi là một phương pháp sinh học phân tử chẩn đoán nhanh Streptococcus suis từ dịch não tủy người Phương pháp PCR đa mồi tiết kiệm thời gian, cơng sức cũng như làm giảm giá thành xét nghiệm của mẫu bệnh phẩm. Vì thế, nếu phương pháp này được triển khai tại các bệnh viện và Trung tâm y tế dự phòng tuyến tỉnh thì việc điều trị giám sát bệnh do S.suis gây ra sẽ đạt hiệu quả tốt Đặng Thị Kiều Oanh 82 Cao học K18 Luận văn thạc sĩ Vi sinh vật học TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu Tiếng Việt 1. Bộ Y tế Cục Y tế dự phòng và mơi trường (2009), Cẩm nang phòng chống bệnh truyền nhiễm, Hà Nội 2. Nguyễn Thị Hồng Lan, Trần Tịnh Hiền (2007), Nhiễm liên cầu lợn tại Bệnh viện Bệnh nhiệt đới từ tháng 1/2005 đến tháng 12/2006, Kỷ yếu Hội thảo khoa học Thách thức trong chẩn đốn và điều trị Bệnh nhiễm trùng, Bệnh viện Bệnh Nhiệt đới, Thành phố Hồ Chí Minh 3. Dương Đình Thiện (2006), Dịch tễ học lâm sàng, Nhà xuất bản y học. 4. Nguyễn Văn Tuấn (2008), Y học thực chứng, Nhà xuất bản y học Tài liệu Tiếng Anh Astrid de Greeff,Andrea Hamilton,Iain C Sutcliffe,Herma Buys,Loek van Alphen, Hilde E. Smith (2003), “Lipoprotein signal peptidase of Streptococcus suis serotype 2”, Microbiology, 149, 1399–1407 6. Benga L, Goethe R, Rohde M, ValentinWeigand P. (2004), “Nonencapsulated strains reveal novel insights in invasion and survival of Streptococcus suis in epithelial cells”, Cell. Microbioly, 6(9),867–881 7. BerthelotHerault F, Cariolet R, Labbe A, Gottschalk M, Cardinal JY, Kobisch M (2001), “Experimental infection of specific pathogen free piglets with French strains of Streptococcus suis capsular Type 2”. Can. J. Vet. Res, 65(3),196–200 8. BerthelotHerault F, Gottschalk M, Morvan H, Kobisch M (2005), “Dilemma of virulence of Streptococcus suis: Canadian isolate 891591 characterized as a virulent strain using a standardized experimental model in pigs”, Can. J. Vet. Res., 69(3), 236–240 9. Chang B, Wada A, Ikebe T, Ohnishi M, Mita K, Endo M, Matsuo H, Asatuma Y, Kuramoto S, Sekiguchi H, Yamazaki M, Yoshikawa H, Watabe N, Yamada H, Đặng Thị Kiều Oanh 83 Cao học K18 Luận văn thạc sĩ Vi sinh vật học Kurita S, Imai Y, Watanabe H (2006), “Characteristics of Streptococcus suis Isolated from Patients in Japan”, Jpn. J. Infect. Dis., 59 (6), 397399 10 Constance Schultsz, Ewout Jansen, Wendy Keijzers, Anja Rothkamp, Birgitta Duim, A Wagenaar, Arie van der Ende (2012), “Differences in the Population Structure of Invasive Streptococcus suis Strains Isolated from Pigs and from Humans in the Netherlands”,PLoS ONE, 7(5), 1 11 Corinne Marois, Laëtitia Le Devendec, Marcelo Gottschalk, and Marylène Kobisch (2006), “Molecular characterization of Streptococcus suis strains by 16S– 23S intergenic spacer polymerase chain reaction and restriction fragment length polymorphism analysis”, Can J Vet Res, 70(2): 94–104 12 Dan Takeuchi ,Anusak Kerdsin, Anupong Pienpringam, Phacharaphan Loetthong, Sutit Samerchea, Pakkinee Luangsuk, Kasean Khamisara, Nithita Wongwan, Prasanee Areeratana, Piphat Chiranairadul, Suwat Lertchayanti, Sininat Petcharat, Amara Yowang, Phanupong Chaiwongsaen,Tatsuya Nakayama, Yukihiro Akeda, Shigeyuki Hamada, Pathom Sawanpanyalert, Surang Dejsirilert, Kazunori Oishi (2012), “PopulationBased Study of Streptococcus suis Infection in Humans in Phayao Province in Northern Thailand”, PLoS One, 7(2): e31265 13 Dang Trung Nghia Ho , Thi Phuong Tu Le, Marcel Wolbers, Quang Thai Cao,Van Minh Hoang Nguyen, Vu Thieu Nga Tran, Thi Phuong Thao Le, Hoan Phu Nguyen, Thi Hong Chau Tran, Xuan Sinh Dinh, Song Diep To, Thi Thanh Hang Hoang, Truong Hoang, James Campbell, Van Vinh Chau Nguyen, Tran Chinh Nguyen, Van Dung Nguyen, Thi Hoa Ngo, Brian G. Spratt, Tinh Hien Tran, Jeremy Farrar,Constance Schultsz (2011), “Risk Factors of Streptococcus suis Infection in Vietnam. A CaseControl Study”, PLoS One, 6(3), e17604 14. De Greeff A, Buys H, Verhaar R, Dijkstra J, Van Alphen L, Smith HE (2002), “Contribution of fibronectinbinding protein to pathogenesis of Streptococcus suis serotype 2”, Infect. Immun,70(3),1319–1325 Đặng Thị Kiều Oanh 84 Cao học K18 Luận văn thạc sĩ Vi sinh vật học 15. Esgleas M, DominguezPunaro Mde L, Li Y, Harel J, Dubreuil JD, Gottschalk M (2009), “Immunization with SsEno fails to protect mice against challenge with Streptococcus suis serotype 2”, FEMS Microbiol. Lett., 294(1),82–88 16 Esgleas M, Lacouture S, Gottschalk M (2005), “Streptococcus suis serotype 2 binding to extracellular matrix proteins”, FEMS Microbiol. Lett., 244(1),33–40 17 Ferrando ML, Fuentes S, De Greeff A, Smith H, Wells JM (2010), “ApuA, a multifunctional αglucandegrading enzyme of Streptococcus suis, mediates adhesion to porcine epithelium and mucus”, Microbiology, 156(Pt 9),2818–2828 18. Ge J, Feng Y, Ji H et al. (2009), “Inactivation of dipeptidyl peptidase IV attenuates the virulence of Streptococcus suis serotype 2 that causes streptococcal toxic shock syndrome”, Curr. Microbiol, 59(3),248–255 19. Gottschalk M., Karriker L, Ramirez A, Schwartz KJ, Stevenson G, Zimmerman J (Eds) (2011), Streptococcosis. In: Diseases of Swine, Wiley Publishers, NJ, USA 20 Gottschalk MG, Lacouture S, Dubreuil JD.( (1995), “Characterization of Streptococcus suis capsular type 2 haemolysin”, Microbiology, 141(Pt 1),189–195 21. Gottschalk M, Segura M. (2000), “ The pathogenesis of the meningitis caused by Streptococcus suis: the unresolved questions”, Vet. Microbiol.,76(3),259–272 22 Gottschalk M, Xu J, Calzas C, Segura M. (2010), “Streptococcus suis: a new emerging or an old neglected zoonotic pathogen”, Fut. Microbiol.,5(3),371–391 23 Heiman F L Wertheim, Ho Dang Trung Nghia, Walter Taylor, Constance Schultsz (2009), “Streptococcus suis: An Emerging Human Pathogen”, Clin Infect Dis., 48 (5): 617625 24. Henegariu O, Heerema NA, Dlouhy SR, Vance GH, Vogt PH (1997), “Multiplex PCR: critical parameters and stepbystep protocol”, BioTechniques, 23(3), 504511 25. Henk J. Wisselink , Jeroen J. Joosten, and Hilde E. Smith (2002), “Multiplex PCR Assays for Simultaneous Detection of Six Major Serotypes and Two Virulence Đặng Thị Kiều Oanh 85 Cao học K18 Luận văn thạc sĩ Vi sinh vật học Associated Phenotypes of Streptococcus suis in Tonsillar Specimens from Pigs”, J Clin Microbiol., 40(8): 2922–2929 26 Hi l de E. Smith , Vincent Veenbergen, Joeke van der Velde, Marloes Damman, Henk J Wisselink,Mari A Smits (1999), “The cps Genes of Streptococcus suis Serotypes 1, 2, and 9: Development of Rapid SerotypeSpecific PCR Assays”, J. Clin Microbiol.,37 (10), 31463152 27 Ho Dang Trung Nghia , Ngo Thi Hoa, Le Dieu Linh, James Campbell, To Song Diep, Nguyen Van Vinh Chau, Nguyen Thi Hoang Mai, Tran Tinh Hien, Brian Spratt, Jeremy Farrar, Constance Schultsz (2008), “Human Case of Streptococcus suis Serotype 16 Infection”, Emerg Infect Dis., 14(1), 155–157 28 Hongjie Yu, Huaiqi Jing, Zhihai Chen, Han Zheng, Xiaoping Zhu, Hua Wang, Shiwen Wang, Lunguang Liu, Rongqiang Zu, Longze Luo, Nijuan Xiang, Honglu Liu, Xuecheng Liu, Yuelong Shu, Shui Shan Lee, Shuk Kwan Chuang, Yu Wang, Jianguo Xu, Weizhong Yang, and the Streptococcus suis study groups2 (2006), “Human Streptococcus suis Outbreak, Sichuan, China”, Emerging Infectious Diseases, 12 (6), 914920 29 HsihYen Tsai, Liao CH, Liu CY, Huang YT, Teng LJ, Hsueh PR (2012), Streptococcus suis infection in Taiwan, 20002011, Diagnostic microbiology and infectious disease, 74(1),757 30. Kay R, Cheng AF, Tse CY., (1995), “Streptococcus suis infection in Hong Kong.”, QJM., 8(1), 3947 31. Kerdsin A, Dejsirilert S, Sawanpanyalert P et al.(2011), “ Sepsis and spontaneous bacterial peritonitis in Thailand”. Lancet, 378(9794),960 32. Lalonde M, Segura M, Lacouture S, Gottschalk M (2000), “Interactions between Streptococcus suis serotype 2 and different epithelial cell lines”, Microbiology, 146(Pt 8), 1913–1921 Đặng Thị Kiều Oanh 86 Cao học K18 Luận văn thạc sĩ Vi sinh vật học 33. Lecours MP , Fittipaldi N, Takamatsu D, Okura M, Segura M, GoyetteDesjardins G, Van Calsteren MR, Gottschalk M (2012), “Sialylation of Streptococcus suis serotype is essential for capsule expression but is not responsible for the main capsular epitope”, Microbes Infect . , 14(11), 941950 34 Liu LN , Hu FQ, Zhu JM, Zhao Y, Pan Q, Li M, Tang JQ (2007), “Study on expression of Streptococcus suis serotype 2 sly gene, purification and activity of its product”, Zhonghua Liu Xing Bing Xue Za Zhi.,28(12):1198202 35. Lun ZR , Wang QP, Chen XG, Li AX, Zhu XQ (2007), “Streptococcus suis: an emerging zoonotic pathogen”, Lancet Infect Dis.,7(3):2019 36 M Gottschalk , R Higgins, M Jacques, K R Mittal, and J Henrichsen (1989), “Description of 14 new capsular types of Streptococcus suis”, J Clin Microbiol., 27(12): 2633–2636. 37. Ma E, Chung PH , So T, Wong L, Choi KM, Cheung DT, Kam KM, Chuang SK, Tsang T, ; Collaborative Study Group on Streptococcus suis infection in Hong Kong (2008), “Streptococcus suis infection in Hong Kong: an emerging infectious disease?”, Epidemiol Infect., 136(12):16917 38 Markoulatos P , ManganaVougiouka O, Koptopoulos G, Nomikou K, Papadopoulos O (2000), “Detection of sheep poxvirus in skin biopsy samples by a multiplex polymerase chain reaction”, J Virol Methods . , 84(2):1617 39. Marois C, Bougeard S, Gottschalk M, Kobisch M. (2004), “Multiplex PCR assay for detection of Streptococcus suis species and serotypes 2 and 1/2 in tonsils of live and dead pigs”, J Clin Microbiol., 42(7):316975 40 Mohini Joshi, Dr.Deshpande J.D (2010), “Polymerase chain reaction: Methods, principles and application”, International Journal of Biomedical Research, 1(5), 8197 41 M S Princivalli1, C Palmieri1, G Magi1, C Vignaroli1, A Manzin2, A Camporese3, S Barocci4, C Magistrali4, B Facinelli (2009), “Genetic diversity of Đặng Thị Kiều Oanh 87 Cao học K18 Luận văn thạc sĩ Vi sinh vật học streptococcus suis clinical isolates from pigs and humans in Italy (20032007)”, Euro Surveill., 14(33). pii: 19310. 42 Nahuel Fittipaldi, Mariela Segura1, Daniel Grenier, Marcelo Gottschalk (2012), “Virulence factors involved in the pathogenesis of the infection caused by the swine pathogen and zoonotic agent Streptococcus suis”, Future Microbiology, 7 (2), 259279 43. Nguyen Thi Hoang Mai , Ngo Thi Hoa,Tran Vu Thieu Nga,Le Dieu Linh,Tran Thi Hong Chau,Dinh Xuan Sinh, Nguyen Hoan Phu,Ly Van Chuong,To Song Diep,James Campbell,Ho Dang Trung Nghia,Tran Ngoc Minh,Nguyen Van Vinh Chau,Menno D. de Jong, Nguyen Tran Chinh, Tran Tinh Hien, Jeremy Farrar, Constance Schultsz (2008), “Streptococcus suis Meningitis in Adults in Vietnam”, Clin Infect Dis., 46 (5): 659667 44 Norton PM, Rolph C, Ward PN, Bentley RW, Leigh JA (1999), “Epithelial invasion and cell lysis by virulent strains of Streptococcus suis is enhanced by the presence of suilysin”, FEMS Immunol. Med. Microbiol.,26(1),25–35 45 P Markoulatos, N. Siafakas, M. Moncany (2002), “Multiplex polymerase chain reaction: A practical approach”, Journal of Clinical Laboratory Analysis, 16(1), 47–51 46.Pan X, Ge J, Li M et al.(2009), “The orphan response regulator CovR: a globally negative modulator of virulence in Streptococcus suis serotype 2”, J. Bacteriol., 191(8), 2601–2612 47 Pian Y, Gan S, Wang S, Guo J, Wang P, Zheng Y, Cai X, Jiang Y, Yuan Y (2012), " Fhb, a Novel Factor HBinding Surface Protein, Contributes to the Antiphagocytic Ability and Virulence of Streptococcus suis”, Infect Immun.,80(7):240213. 48 R Higgins, M Gottschalk, M Boudreau,A Lebrun, J Henrichsen (1995), “Description of six new capsular types (2934) of Streptococcus suis”, J Vet Diagn Invest, 7, 405406 Đặng Thị Kiều Oanh 88 Cao học K18 Luận văn thạc sĩ Vi sinh vật học 49. Salles MW, PerezCasal J, Willson P, Middleton DM (2002), “Changes in the leukocyte subpopulations of the palatine tonsillar crypt epithelium of pigs in response to Streptococcus suis Type 2 infection”,Vet. Immunol Immunopathol., 87(1–2),51–63 50. Samantha J. King, Andrew G. Allen, Duncan J. Maskell, Christopher G. Dowson and Adrian M Whatmore(2004), “Distribution, Genetic Diversity, and Variable Expression of the Gene Encoding Hyaluronate Lyase within the Population Streptococcus suis”, J. Bacteriol., 186(14), 4740 51 SeongMin Choi, BangHoon Cho, KangHo Choi, TaiSeung Nam, JoonTae Kim, ManSeok Park, Byeong C. Kim, MyeongKyu Kim, KiHyun Cho (2012), “Meningitis Caused by Streptococcus suis”, J Clin Neurol, 8, 7982 52. Smith HE, Buijs H, De Vries RR, Wisselink HJ, StockhofeZurwieden N, Smits MA (2001). Environmentally regulated genes of Streptococcus suis: identification by the use of ironrestricted conditions in vitro and by experimental infection of piglets”, Microbiology, 147(Pt 2),271–280 53. Staats JJ, Feder I, Okwumabua O, Chengappa MM (1997), “Streptococcus suis: past and present”, Vet Res Commun.,21(6),381407 54 Tang Y, Zhang X, Wu W, Lu Z, Fang W (2012), “ Inactivation of the sodA gene of Streptococcus suis type 2 encoding superoxide dismutase leads to reduced virulence to mice”, Vet Microbiol.,158(34), 3606. 55. Vanier G, Sekizaki T, DominguezPunaro MC et al (2008), “Disruption of srtA gene in Streptococcus suis results in decreased interactions with endothelial cells and extracellular matrix proteins”, Vet. Microbiol., 127(3–4),417–424 56 Wangkaew S, Chaiwarith R, Tharavichitkul P, Supparatpinyo K (2006), Streptococcus suis infection: a series of 41 cases from Chiang Mai University Hospital, J Infect., 52(6), 45560 Đặng Thị Kiều Oanh 89 Cao học K18 Luận văn thạc sĩ Vi sinh vật học 57 Wu T, Chang H, Tan C, Bei W, Chen H, (2009), “The orphan response regulator RevSC21 controls the attachment of Streptococcus suis serotype2 to human laryngeal epithelial cells and the expression of virulence genes”, FEMS Microbiol. Lett., 292(2),170–181 58. Zhang A, Chen B, Mu X et al. (2009), “Identification and characterization of a novel protective antigen, Enolase of Streptococcus suis serotype 2”, Vaccine 27(9),1348–1353 59 Zhang A, Mu X, Chen B et al. (2010), “Identification and characterization of IgA1 protease from Streptococcus suis”, Vet. Microbiol., 140(1–2),171–175 Đặng Thị Kiều Oanh 90 Cao học K18 ... tài Nghiên cứu phát triển và hồn thiện quy trình PCR đa mồi để phát hiện trực tiếp Streptococcus suis từ dịch não tủy của người với 2 mục tiêu chính sau đây: Xây dựng quy trình PCR đa mồi phát hiện trực tiếp ... TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Đặng Thị Kiều Oanh NGHIÊN CỨU PHÁT TRIỂN VÀ HỒN THIỆN QUY TRÌNH PCR ĐA MỒI PHÁT HIỆN TRỰC TIẾP Streptococcus suis TỪ DỊCH NÃO TỦY NGƯỜI Chun ngành: Vi sinh vật học... 2.2.5. Nghiên cứu mức độ phát hiện vi khuẩn S. suis và một số yếu tố độc lực của vi khuẩn bởi quy trình PCR đa mồi đượ c xây dựng trong nghiên cứu. Tính ổn định của PCR đa mồi. 52