Mục đích nghiên cứu của luận án nhằm xây dựng được quy trình kỹ thuật chế tạo bộ sinh phẩm nested-PCR chẩn đoán nhiễm nấm C.neoformans trong dịch não tủy. Đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu và độ ổn định của bộ sinh phẩm được tạo ra trong chẩn đoán nhiễm nấm C.neoformans trong dịch não tủy.
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ VIỆN SỐT RÉT - KÝ SINH TRÙNG - CÔN TRÙNG TRUNG ƯƠNG TRẦN THỊ QUỲNH LIÊN NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH KỸ THUẬT CHẾ TẠO BỘ SINH PHẨM NESTED-PCR CHẨN ĐỐN NHIỄM NẤM Cryptococcus neoformans TRONG DỊCH NÃO TỦY TĨM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SỸ Y HỌC HÀ NỘI - 2019 Cơng trình hồn thành tại: Viện Sốt rét - Ký sinh trùng - Côn trùng Trung ương Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Cao Trường Sinh PGS.TS Nguyễn Thị Hương Bình Phản biện 1: Phản biện 2: Phản biện 3: Luận án bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án cấp Viện họp Viện Sốt rét - Ký sinh trùng - Côn trùng Trung ương Vào hồi ngày tháng năm 2019 Có thể tìm hiểu luận án tại: - Thư viện Quốc gia - Thư viện Viện Sốt rét-Ký sinh trùng-Côn trùng-Trung ương DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH NGHIÊN CỨU CĨ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN ĐÃ CÔNG BỐ Tran Thi Quynh Lien, Cao Truong Sinh, Nguyen Thi Huong Binh, Do Ngoc Anh (2018), “Establish and optimization nested PCR reaction determine Cryptococcus neoformans in cerebrospinal fluid'', Tạp chí Phòng chống bệnh sốt rét bệnh ký sinh trùng, số 6/2018 Tran Thi Quynh Lien, Cao Truong sinh, Nguyen Thi Huong Binh, Nguyen Khac Luc (2018), “Evaluation sensitivity, specificity and stable of nested-PCR kit detect cryptococcus neoformans in cerebrospinal fluid” Tạp chí Phòng chống bệnh sốt rét bệnh ký sinh trùng, số 6/2018 Trần Thị Quỳnh Liên, Cao Trường Sinh, Nguyễn Thị Hương Bình, Trần Thanh Dương (2019), "Đánh giá khả chẩn đoán Cryptococcus neoformans dịch não tủy sinh phẩm nested-PCR với kỹ thuật nuôi cấy, soi tươi sinh phẩm pcr chẩn đoán norgen'' Tạp chí Phòng chống bệnh sốt rét bệnh ký sinh trùng, số 61/20194 -1- ĐẶT VẤN ĐỀ Viêm não, màng não tình trạng nhiễm trùng thần kinh trung ương gây nguyên khác vi khuẩn, virus, vi nấm ký sinh trùng Trong số trường hợp biểu lâm sàng viêm não, màng não nguyên khác giống nên dựa vào lâm sàng khó phân biệt Do vậy, để xác định nguyên gây viêm não, màng não cần phải dựa vào xét nghiệm cận lâm sàng Trong số loài vi nấm gây viêm não màng não, nấm Cryptococcus neoformans xác định loài gây viêm màng não phổ biến nhất, đặc biệt bệnh nhân HIV/AIDS, ung thư, bệnh nhân suy kiệt Trên lâm sàng, biểu viêm màng não nấm C neoformans giống với nguyên vi sinh vật khác Ngoài ra, giống vi nấm gây bệnh khác, viêm màng não C neoformans thường nghĩ tới sau nguyên khác nên thường chẩn đoán muộn, triệu chứng trở nên trầm trọng Trong khi, viêm màng não nấm C neoformans bệnh nguy hiểm, tiến triển nhanh, khơng chẩn đốn sớm điều trị kịp thời để lại di chứng trầm trọng có tử vong nhanh Trong kỹ thuật chẩn đoán dựa phản ứng PCR, nested – PCR kỹ thuật có độ nhạy, độ đặc hiệu cao nhất, không sử dụng trang thiết bị đắt tiền real-time PCR lựa chọn tiến hành đề tài "Nghiên cứu xây dựng quy trình kỹ thuật chế tạo sinh phẩm nested-PCR chẩn đoán nhiễm nấm C neoformans dịch não tủy" Với 02 mục tiêu: Xây dựng quy trình kỹ thuật chế tạo sinh phẩm nested-PCR chẩn đoán nhiễm nấm C.neoformans dịch não tủy Đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu độ ổn định sinh phẩm tạo chẩn đoán nhiễm nấm C.neoformans dịch não tủy -2- NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI VỀ MẶT KHOA HỌC VÀ Ý NGHĨA THỰC TIỄN CỦA LUẬN ÁN Ý nghĩa khoa học luận án Đề tài áp dụng phương pháp nghiên cứu có tính khoa học chuẩn mực áp dụng rộng rãi Việt Nam Thế giới như: Hồn thiện quy trình chế tạo sinh phẩm nested-PCR định loài nấm C neoformans dịch não tủy người Việt Nam;Trên sở áp dụng tổng hợp phương pháp nghiên cứu truyền thống đại, phù hợp, bố trí thí nghiệm, tính tốn thống kê cách khoa học nên kết để tài có giá trị độ tin cậy cao Đây nghiên cứu nghiên cứu xây dựng sinh phẩm chẩn đoán nấm C neoformans dịch não tủy phương pháp nested-PCR Việt Nam Nghiên cứu xây dựng quy trình kỹ thuật chế tạo sinh phẩm nested-PCR dựa kết hợp mồi ITS1, ITS4 CN4, CN5 Ý nghĩa thực tiễn luận án Kết đề tài bước đầu khẳng định việc sở nghiên cứu khoa học Việt Nam sản xuất sinh phẩm chẩn đốn có độ nhạy, độ đặc hiệu, ngưỡng phát tương đương với nghiên cứu tương tự giới Bộ sinh phẩm đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu tính ổn định phòng thí nghiệm thực địa hẹp (02 bệnh viện) đảm bảo tính xác khả áp dụng diện rộng sinh phẩm Là sở để tiếp tục triển khai, sản xuất, ứng dụng sinh phẩm chẩn đoán nhiễm nấm C neoformans đơn vị xét nghiệm chẩn đoán lâm sàng, cung cấp kết xét nghiệm nhanh, xác từ đề xuất phương án điều trị sớm, hiệu phù hợp Qua đề tài này, cán nghiên cứu tiếp tục mở rộng xây dựng sinh phẩm chẩn đoán với đối tượng nghiên cứu khác dựa kỹ thuật sinh học phân tử -3- CẤU TRÚC CỦA LUẬN ÁN Luận án có 134 trang (không kể phụ lục) bao gồm phần: Đặt vấn đề (2 trang); chương 1: Tổng quan tài liệu (34 trang); chương 2: Đối tượng phương pháp nghiên cứu (31 trang); chương 3: Kết nghiên cứu (41 trang); chương 4: Bàn luận (24 trang); Kết luận (2 trang); cơng trình cơng bố tác giả có liên quan đến nội dung luận án (1 trang); đóng góp luận án (1 trang); tài liệu tham khảo 113 (13 trang, gồm 10 tài liệu tiếng việt, 103 tài liệu tiếng Anh) phụ lục (35 trang) Luận án trình bày với 39 bảng, 17 hình -4- Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Đặc điểm sinh học vai trò y học nấm C neoformans Giống nấm Cryptococcus có khoảng 70 lồi định loại dựa vào hình thái lồi gây bệnh chủ yếu C neoformans chiếm 80% [18],[19] Bệnh nấm C neoformans gây gọi Cryptococcosis Triệu chứng bệnh Zenker miêu tả năm 1861, đến năm 1864, hai nhà bác học Busse Buschkle người Đức phân lập nuôi cấy nấm C neoformans từ bệnh nhân có triệu chứng giống Zenker miêu tả [18],[20],[21] Ngoài C.neoformans, lồi C albidus C laurentii có khả gây bệnh gặp [19] 1.1.1 Đặc điểm sinh học nấm C neoformans 1.1.1.1 Đặc điểm hình thể C neoformans nấm men, đường kính tế bào khoảng 5-10 µm, bao ngồi nang (capsule) hình cầu hình bầu dục, kích thước nang thay đổi từ 2-40µm 1.1.1.2 Mơi trường sống C neoformans sinh vật sống hoại sinh, ngồi thể vật chủ, sống tự bên ngồi mơi trường Nấm phân bố tồn cầu tìm thấy chất thải gia cầm, chim bồ câu, vẹt, yến Trong hang động, nước trái lên men, sữa, đường ruột số động vật ăn cỏ, thể dơi, gián, đất hốc khác Nấm tìm thấy thân gỗ mục số loài như: bạch đàn, cao su màu đỏ [18], [24], [26] 1.1.1.3 Tính chất ni cấy Nấm C neoformans mọc thạch Sabouraud dextrose, thạch máu cừu, thạch chocolate môi trường khác nhiệt độ từ 20-370C, nấm bắt đầu mọc vòng khoảng 72 giờ, nhiệt độ thích hợp cho nấm phát triển 300C [27] C neoformans triển tốt môi trường chứa khoảng % CO2, pH kiềm lượng nhỏ chất sắt [28] -5- Trên môi trường thạch Sabouraud dextrose 25-370C, nấm C neoformans mọc thành khuẩn lạc lồi, mịn, nhày, màu trắng màu kem, đường kính đến vài milimet [28] 1.1.2 Vai trò y học Do tế bào nấm C neoformans có thể có mặt khơng khí, đất phân gia cầm nên người rấ t dễ bi ̣ nhiễm loa ̣i nấ m này hít vào qua đường hơ hấp Tuy nhiên, không phải thể nào bi ̣ nhiễm cũng biể u hiê ̣n thành bê ̣nh mà bê ̣nh thường biể u hiê ̣n ở những thể có ̣ thố ng miễn dich ̣ bi ̣tổ n thương bệnh nhân AIDS, phải dùng các thuốc ức chế miễn dịch, ung thư, ghép tạng, ghép tủy xương Mức độ nặng triệu chứng lâm sàng phụ thuộc vào tình trạng suy giảm miễn dịch thể người nhiễm [3], [18], [22], [30] Nấm thường gây bệnh não màng não nấm có đặc tính ưa tổ chức thần kinh Ngồi nấm gây bệnh quan phận khác phổi, da, hệ tiết niệu… 1.1.3 Tình hình viêm màng não nấm C neoformans giới Việt Nam 1.1.3.1 Viêm màng não nấm C neoformans giới Từ cuối năm 1970 đến đầu năm 1980, gia tăng mạnh trường hợp nhiễm nấm C neoformans Kinshasa người Zairian nhập cư Châu Âu Hiện nay, viêm màng não nấm C neoformans bệnh nhân HIV/AIDS vấn đề nước phương Tây Tại Nam Trung châu Phi vùng sa mạc cận Sahara [11], [20], [36], việc nguyên nhân hàng đầu gây viêm màng não, 13-44% tổng số ca tử vong liên quan đến AIDS Theo kết loạt nghiên cứu Park cs (2009) thấy tỉ lệ mắc thay đổi từ 0,04-12% năm bệnh nhân HIV/AIDS Một số vùng Đông Âu, Trung Á, Bắc Phi Trung Đông có tỉ lệ tương tự (1,7% năm) Vùng biển Caribbean Mỹ Latin có tỉ -6- lệ khoảng 3,4% năm Trên tồn cầu hàng năm có khoảng 957.900 trường hợp nhiễm bệnh [20] Ước tính có khoảng 624.725 ca (từ 124.956-1.124.494) tử vong viêm màng não nấm C neoformans [20] Châu Đại Dương (9 ca tử vong) khu vực châu Phi cận Sahara nhiều (504.000 ca (từ 100.800 - 907.200)) [20] Rajasingham cs, (2017) điều trị thuốc chống nấm, năm 2007 ước tính có đến 223.100 trường hợp viêm màng não cryptococcus 181.100 ca tử vong bệnh toàn giới [38], [39] 1.1.3.2 Viêm màng não nấm C neoformans Việt Nam Ở Việt Nam, chưa có số thống kê rõ ràng tình hình viêm màng não nấm C neformans bệnh nhân AIDS nước Năm 1928, BV Bệnh Nhiệt Đới có ca nhiễm C neoformans báo cáo với biểu viêm màng não; Trong nghiên cứu Trần Phủ Mạnh Siêu cs, (2006) tình hình nhiễm vi nấm nội tạng bệnh nhân HIV/AIDS Bệnh viện Bệnh Nhiệt đới Thành phố - Hồ Chí Minh từ năm 2003-2005 cho thấy C neoformans nguyên phổ biến (chiếm 90% nhiễm trùng thần kinh bệnh nhân HIV/AIDS) [41] Thực tế tình hình nhiễm nấm nội tạng bệnh nhân HIV/AIDS Bệnh viện Nhiệt đới Tp HCM từ 11/2008 đến 6/2009 có 98 trường hợp viêm não, màng não C neoformans [41] 1.2 Các phương pháp chẩn đoán nhiễm nấm C neoformans 1.2.1 Soi phát nang nấm kính hiển vi Phát nang polysaccharide nấm Cryptococcus mẫu xét nghiệm quan sát kính hiển vi thấy C neoformans tế bào nấm men, hình cầu hình bầu dục, bao quanh lớp vỏ dày 1.2.2 Nuôi cấy phát nấm môi trường chọn lọc -7- Nuôi cấy coi phương pháp quan trọng để chẩn đoán viêm màng não Cryptococcus, có số nhược điểm như: Đòi hỏi sở hạ tầng phòng thí nghiệm, điện, kỹ thuật viên đào tạo [13] Ni cấy cần ngày để nấm phát triển đến 10 ngày để có số liệu đáng tin cậy Các phương pháp nuôi cấy tạo kết âm tính giả mật độ nấm thấp Sử dụng 100 μL dịch não tủy khơng pha lỗng so với 10 μl pha lỗng tỷ lệ 1:10 làm tăng độ nhạy từ 82,4% đến 94,2%, với mức tối thiểu đơn vị khuẩn lạc CFU cần thiết cho tăng trưởng giảm từ 100 xuống 10 CFU/ml [43] 1.2.2 Chẩn đốn miễn dịch học phát kháng nguyên Độ nhạy phương pháp cao xét nghiệm mẫu dịch não tủy, đặc biệt mẫu dịch não tủy bệnh nhân nhiễm HIV Hầu hết bệnh nhân HIV có nhiễm C neoformans có phản ứng dương tính xét nghiệm miễn dịch dịch não tủy [43] Tuy nhiên tỷ lệ đạt 60% bệnh nhân nhiễm nẫm khơng có HIV Những phương pháp xét nghiệm miễn dịch học thơng thường có: Thử nghiệm đông kết latex (Latex agglutination assay - LAT); thử nghiệm miễn dịch enzym (enzym immunoassay – IEA), thử nghiệm miễn dịch dòng chảy (Lateral Flow Assay - LFA) 1.2.3 Chẩn đoán kỹ thuật sinh học phân tử Sinh học phân tử công cụ chẩn đoán bệnh với độ nhạy, độ đặc hiệu cao thời gian chẩn đoán nhanh Các kỹ thuật có tính đặc hiệu cao việc thiết kế cặp mồi đặc hiệu cho đối tượng nghiên cứu có độ nhạy cao cần lượng nhỏ (vài picrogam) ADN cho kết chẩn đốn Có nhiểu phương pháp sinh học phân tử áp dụng để chẩn đốn nấm C neoformans Mitchell cs (1994) người sử dụng kỹ thuật PCR để định loại nấm C neoformans [46] Prariayachatigul cs (1996) dùng PCR để định loại nấm dựa trình tự gen đích 18S [47] - 10 - 2.4.1 Xây dựng quy trình chế tạo sinh phẩm nested-PCR chẩn đoán nấm C neoformans - Xây dựng quy trình kỹ thuật nested-PCR xác định nấm C neoformans - Xây dựng sinh phẩm nested-PCR xác định C neoformans 2.4.2 Đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu, tính ổn định sinh phẩm - Chuẩn bị mẫu để đánh giá độ nhạy độ đặc hiệu - Thực kỹ thuật nested – PCR để đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu, độ tương đồng với xét nghiệm khác, độ ổn định sinh phẩm 2.5 Phương pháp nghiên cứu: NC thực nghiệm phòng thí nghiệm Các kỹ thuật sử dụng nghiên cứu:Thu thập dịch não tủy, nuôi cấy, soi tươi nhuộm mực tàu, tách chiết AND, tạo panel, kỹ thuật PCR, kỹ thuật điện di… 2.6 Phân tích xử lý số liệu: phần mềm Blast ClustalX, BioEdit, Mega 7.0.9, SPSS 20.0 2.7 Đạo đức nghiên cứu: Tuân thủ quy định nghiên cứu y, sinh học Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1 Kết xây dựng quy trình kỹ thuật chế tạo sinh phẩm nested-PCR chẩn đoán nhiễm nấm C neoformans 3.1.2.1 Kết lựa chọn trình tự cặp mồi cho phản ứng nested PCR Cặp mồi cho phản ứng PCR1 theo Mitchell TG CS, 1994; SH Mirhendi CS, 2001: ITS1 F: 5’-TCC GTA GGT GAA CCT GCG G-3’ ITS4 R:5’-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3’ Khuếch đại đoạn gen có kích thước 555-556 bp đặc trưng cho nấm C neoformans Cặp mồi cho phản ứng PCR theo Guizhen Luo CS, 2002: CN4 F: 3’-ATC ACC TTC CCA CTA ACA CAT T-5’ CN5 R: 3’-GAA GGG CAT GCC TGT TTG AGA G-5’ - 11 - Khuếch đại đoạn ADN có kích thước 135-136 bp nằm đoạn giao gen ITS1-ITS2 3.1.3 Kết xác định điều kiện cho kỹ thuật nested-PCR chẩn đoán nhiễm nấm C neoformans Bảng 3.10 Kết chuẩn hóa thành phần phản ứng cho PCR1 TT Thành phần Nồng độ, hàm Thể tích sử dụng cho lượng cuối phản ứng (µl) Nước khử ion Vừa đủ tới 25 µl 8,5 Master Mix X có 1X 12,5 chứa MgCl2 nồng độ mM Mồi xi PCR1 0,02 µM Mồi ngược PCR1 0,02 µM ADN khn Tổng 100pg – 100ng/25µl 25 Bảng 3.11 Kết chu trình nhiệt phản ứng PCR1 Bước phản ứng Nhiệt độ 0C Thời gian Số chu kỳ Tách sợi ban đầu 94 phút 01 Tách sợi 94 40 giây Bám mồi 56 40 giây 25 Kéo dài mồi 72 40 giây ổn định mồi 72 phút 01 3.1.3.4 Kết xác định điều kiện cho phản ứng PCR2 - Kết chuẩn hóa nồng độ Mg2+ Bảng 3.13 Kết thử nghiệm nồng độ Mg2+ phản ứng PCR2 TT Nồng độ Số lượng mẫu lên băng 135bp với nồng độ Mg2+ ADN khác (mM) khuôn 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 1 pg 0/8 6/8 7/8 7/8 7/8 7/8 - 12 - 10 pg 1/8 6/8 8/8 7/8 7/8 6/8 100 pg 1/8 7/8 8/8 7/8 6/8 8/8 1000 pg 1/8 7/8 8/8 7/8 6/8 6/8 2+ Kết bảng 3.13 cho thấy Mg nồng độ 2,0 mM nồng độ ADN ≥ 10 pg tất mẫu xét nghiệm có sản phẩm PCR 3.1.3.5 Xác định ngưỡng phát tính đặc hiệu kỹ thuật nested-PCR Hình 3.14 Kết PCR theo nồng độ ADN khuôn Ngưỡng phát kỹ thuật nested -PCR chẩn đoán nhiễm nấm C neoformans dịch não tủy nghiên cứu 10pg 3.1.4 Kết chế tạo sinh phẩm nested-PCR chẩn đoán nhiễm nấm C neoformans Bảng 3.25 Thành phần sinh phẩm nested-PCR chẩn đoán nhiễm nấm C neoformans TT Tên dung dịch Bản chất Số lượng Thể tích/ống (µl) Dung dịch MC-CR1 Master mix 02 ống 1012 Dung dịch MC-CR2 Master mix 01 ống 720 Dung dịch CR1 Master mix 02 ống 1012 Dung dịch CR2 Master mix 01 ống 840 Dung dịch M100 Marker 01 ống 200 100bp Dung dịch LD100 Loading dye 01 ống 200 - 13 - Chứng dương ADN nấm C.neoforma ns ADN người 01 ống 200 Chứng âm 01 ống 200 Hướng dẫn sử dụng 01 tờ Bộ sinh phẩm đóng gói gồm 08 thành phần với 10 ống hóa chất kèm theo hướng dẫn sử dụng tiếng Việt (Phụ lục) Hình 3.16 Bộ sinh phẩm nested - PCR chẩn đốn C neoformans Ngồi hộp gồm có nhãn hộp có đầy đủ thơng tin lơ sản xuất, ngày hết hạn, điều kiện bảo quản, nơi sản xuất 3.2 Kết đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu độ ổn định sinh phẩm chẩn đoán nhiễm nấm C neoformans DNT Bảng 3.27 Kết đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu sinh phẩm mẫu chuẩn Kết kit Mẫu chuẩn Tổng nested– số PCR Có C Khơng có C.neoformans neoformans Dương tính 60 60 Âm tính 40 40 Tổng số 60 40 100 Độ nhạy Se = 100%, Độ đặc hiệu Sp = 100% - 14 - Bộ sinh phẩm nested PCR thử nghiệm chủng chuẩn độ nhạy, độ đặc hiệu 100% 3.2.2.2 Đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu DNT nhiễm giả định Bảng 3.32 Kết đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu sinh phẩm mẫu nhiễm giả định nồng độ từ 102CFU/ ml trở lên Kết kit Mẫu chuẩn Tổng Nested – PCR số Có C Khơng có C neoformans neoformans Dương tính 74 74 Âm tính 40 46 Tổng số 80 40 120 Độ nhạy Se = 92,5%; Độ đặc hiệu Sp = 100% ; Giá trị tiên đoán dương: 100% Giá trị tiên đoán âm: 87% Bảng 3.34 Kết đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu sinh phẩm chủng C neoformans phân lập Việt Nam Kết kit C.neoformans phân lập VN Tổng số nested – PCR Có C neoformans Khơng có C.neoformans Dương tính 102 102 Âm tính 40 40 Tổng số 102 40 142 Độ nhạy Se = 100%; Độ đặc hiệu Sp = 100% 3.2.2.2 Kết đánh giá độ tương đồng sinh phẩm mẫu DNT bệnh nhân VMN Bảng 3.36 Độ nhạy, độ đặc hiệu so với phương pháp nuôi cấy Kết kit Phương pháp nuôi cấy Tổng số nested – PCR Dương tính Âm tính Dương tính 7 Âm tính 112 113 - 15 - Tổng số 112 120 Độ nhạy Se = 87,5%; Độ đặc hiệu Sp = 100%; Giá trị tiên đoán dương: 100%; Giá trị tiên đoán âm: 99,1% Bảng 3.37 Độ tương đồng so với phương pháp soi tươi Kết kit Phương pháp soi tươi nhuộm mực Tổng số nested – PCR tàu Dương tính Âm tính Dương tính Âm tính 111 113 Tổng số 113 120 Tỉ lệ phù hợp quan sát Po: 96,7% Tỷ lệ phù hợp mong muốn Pe: 89,0% K = 0,697 Bảng 3.38 Độ tương đồng so với sinh phẩm Norgen Kết kit Bộ sinh phẩm Norgen Tổng số nested – PCR Dương tính Âm tính Dương tính 7 Âm tính 113 113 Tổng số 110 120 Độ nhạy Se = 100%; Độ đặc hiệu Sp = 100%; Giá trị tiên đoán dương: 100%; Giá trị tiên đoán âm: 100%; K = So sánh kết xét nghiệm sinh phẩm nested-PCR với sinh phẩm Norgen hệ số tương đồng phương pháp xét nghiệm 1-hoàn toàn tương đồng 3.2.3 Xây dựng tiêu chuẩn sở kiểm định chất lượng sinh phẩm chế tạo Bảng 3.39 Tóm tắt tiêu chuẩn sở TT Chỉ tiêu đánh giá Tiêu chuẩn sở Nhận dạng Phản ứng PCR2 cho bang kích thước 135 bp đặc trưng cho nấm C.neoformans - 16 - Độ nhạy ≥ 95% Độ đặc hiệu ≥ 99% Ngưỡng phát ≥ 10pg/µl Thời gian phát Khơng q 48 Độ ổn định ≥ 12 tháng Bảo quản - 20oC 3.2.3.2 Đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu sinh phẩm nested-PCR Viện kiểm định quốc gia vắc xin sinh phẩm y tế Viện kiểm định quốc gia vắc xin sinh phẩm y tế có giấy chứng nhận kết kiểm định số 00515/SPCD-NC kết luận sinh phẩm chẩn đoán nested-PCR phát nấm C neoformans loạt số #A011-02 Học viện quân y sản xuất có độ nhạy đạt 99,11%; độ đặc hiệu 100%; ngưỡng phát 0,4pg/µl thực mẫu chuẩn nhà sản xuất Chương BÀN LUẬN 4.1 Về kết xây dựng quy trình kỹ thuật chế tạo sinh phẩm nested-PCR chẩn đoán nhiễm nấm C neoformans Trong nghiên cứu này, lựa chọn cặp mồi cho PCR1 ITS1, ITS4, cặp mồi vòng CN4, CN5 cho nấm C neoformans Cặp mồi CN4, CN5 nhân đoạn gen nằm đoạn khuếch đại cặp mồi ITS1, ITS4 Đây cặp mồi nhiều tác giả sử dụng nghiên cứu loài nấm C neoformans số vi nấm gây bệnh khác Cặp mồi CN4, CN5 Mitchell TG cs (1994) nghiên cứu phát nấm C neoformans từ năm 1994 [46] Nghiên cứu Martins MA CS (2015) cho thấy, cặp mồi CN4, CN5, 100% mẫu DNA nấm C neoformans cho kết dương tính bệnh phẩm dịch não tủy nhiễm C neoformans tỷ lệ dương tính 94,8% [102] Cidiane GM CS (2016) sử dụng cặp mồi CN4, CN5 phản - 17 - ứng realtime PCR phát nhiễm C neoformans[14] … Cặp mồi sử dụng phổ biến nghiên cứu nấm C neoformans cho thấy, vị trí sợi ADN nấm C neoformans vị trí có biến đổi Trình tự mồi CN4, CN5 lại đặc hiệu cho C neoformans Điều rằng, lựa chọn cặp mồi để nhân gen nấm C neoformans phù hợp 4.1.2.2 Về kết xác định điều kiện kỹ thuật nested PCR phát C neoformans gây VMN Từ kết lựa chọn cặp mồi, xác định điều kiện cho phản ứng PCR để khuếch đại ADN vi nấm Theo đó, phản ứng PCR với cặp mồi ITS1, ITS4 có kết tốt Mg2+ = 2,0mM, mồi 0,1µM, nồng độ ADN đưa vào phản ứng PCR từ 10pg đến 10ng, nhiệt độ gắn mồi 56oC So với nghiên cứu giới, điều kiện có nhiều điểm phù hợp không phù hợp [105], [106] Tuy nhiên, hầu hết nghiên cứu, điều kiện quan trọng nồng độ Mg2+ từ 1,5 đến 2,0mM nhiệt độ gắn mồi cặp mồi 55oC đến 56oC Kế t quả xác định ngưỡng phát cho thấ y, nested - PCR cho phép nhìn rõ kết ổn định lượng ADN nấm đưa vào 25μl phản ứng PCR1 > 1pg Một số tác giả phát triển kỹ thuật nested-PCR để phát nấm riêng lẻ C neoformans, C albicans Paola Rappelli cs (1998) [52], Jahromi S B cs (2006) [27], Victor A Makene cs (2013) [107] cho kết ngưỡng phát nhạy nghiên cứu (có thể phát nồng độ ADN nấm thấp 1pg) Guizhen Luo cs (2002) sử dụng kỹ nested multiplex-PCR để phát C albicans, C glabrata, C parapsilosis, C tropicalis, C neoformans A fumigatus [108]; Taira CL cs (2014) [64] sử dụng kỹ thuật Nested Multiplex-PCR để phát nguyên Candida gây nhiễm nấm máu trẻ sơ sinh cho kết ngưỡng phát thấp nghiên cứu chúng tơi Điều số chu kỳ phản ứng khác Các tác giả thường chạy PCR1 với số chu kỳ 35, PCR2 với 20 chu kỳ Trong - 18 - đó, số chu kỳ vòng nghiên cứu 25 Do đó, cần phải tiếp tục tìm hiểu, đánh giá để hạ thấp ngưỡng phát nâng cao hiệu chẩn đoán Mặc dù vậy, kết cho thấy tiềm ứng dụng kỹ thuật chẩn đoán nhiễm C neoformans Việt Nam 4.2 Bàn luận độ nhạy, độ đặc hiệu sinh phẩm nested-PCR chẩn đoán nhiễm nấm C neoformans dịch não tủy Để đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu sinh phẩm chẩn đoán cần so sánh kết xét nghiệm sinh phẩm muốn đánh giá với chuẩn vàng mẫu khác Đồng thời so sánh với sinh phẩm, phương pháp xét nghiệm đánh giá thương mại hóa thị trường Trước hết đánh giá sinh phẩm mẫu chuẩn, sở để xác định ngưỡng phát hiện, mẫu chuẩn bao gồm chuẩn dương, chuẩn âm, chuẩn trắng Bước đánh giá sinh phẩm mẫu nhiễm giả định mẫu mà tiến hành phân tích mẫu xét nghiệm thông thường Cuối đánh giá mẫu dịch não tủy thu từ bệnh nhân có biểu lâm sàng viêm màng não Các bước đánh giá mẫu chuẩn giả định thường nhà sản xuất tiến hành trình xây dựng thử nghiệm lại sinh phẩm Cũng hầu hết nghiên cứu, độ nhạy độ đặc hiệu sinh phẩm chẩn đoán mẫu chuẩn phản ánh độ nhạy, độ đặc hiệu phương pháp tạo nên sinh phẩm Đối với sinh phẩm dựa kỹ thuật PCR độ nhạy, độ đặc hiệu mẫu chuẩn phản ánh độ nhạy, độ đặc hiệu cặp mồi quy trình thực phản ứng PCR Ở hầu hết trường hợp, khơng có nhiễm chéo độ nhạy độ đặc hiệu đạt 100% 4.2.2.2 Bàn luận kết đánh giá độ tương đồng sinh phẩm tạo mẫu DNT bệnh nhân có biểu lâm sàng VMN Hầu hết công bố độ nhạy, độ đặc hiệu kỹ thuật sinh phẩm đánh giá mẫu lâm sàng Đây sở để - 19 - đánh giá chất lượng sinh phẩm Sử dụng 120 mẫu dịch não tủy thu thập từ bệnh nhân có biểu lâm sàng viêm màng não từ Bệnh viện Phạm Ngọc Thạch Bệnh viện Quân Y để thử nghiệm chẩn đoán sinh phẩm nested-PCR so sánh với phương pháp xét nghiệm truyền thống bao gồm: soi tươi nhuộm mực tàu, nuôi cấy 01 sinh phẩm thương mại hóa thị trường sinh phẩm Cryptococcus neoformans PCR Kit EP-42720 hãng Norgen Kết bảng 3.35 cho thấy 120 mẫu nghiên cứu xác định có 6/120 mẫu dương tính với nấm C.neoformans phương pháp soi tươi nhuộm mực tàu; 8/120 mẫu dương tính phương pháp ni cấy; tỷ lệ sinh phẩm nested PCR 7/120 sinh phẩm Norgen 7/120 Tỉ lệ nhiễm C neoformans dịch não tủy 6,67% với phương pháp nuôi cấy 3.36 cho thấy kết so sánh sinh phẩm nested PCR #A011-02 với phương pháp soi tươi nhuộm mực tàu cho giá trị tiên đoán dương 71,4% giá trị tiên đoán âm 98,2% Hệ số tương đồng phương pháp xét nghiệm 0,697 Bảng 3.37 cho thấy kết so sánh sinh phẩm nested-PCR #A011 - 02 với phương pháp ni cấy có độ nhạy 87,5% ; độ đặc hiệu 100% ; giá trị tiên đoán dương 100%và giá trị tiên đoán âm 98,2% Hệ số tương đồng phương pháp xét nghiệm 0,929 mức tương đồng cao Bảng 3.38 cho thấy hệ số tương đồng sinh phẩm PCR ngưỡng tương đồng cao; độ nhạy đạt = 100%; độ đặc hiệu 100% Giá trị tiên đoán dương 100%và giá trị tiên đoán âm 100% Kết tương đồng với kết nghiên cứu Hetal cs (2011) đánh giá tính khả áp dụng que thử nhanh để chẩn đoán viêm màng não tủy nấm C neoformans 63 mẫu dịch não tủy xác định tỷ lệ nhiễm nấm 14,28% phương pháp latex; 11,11% - 20 - phương pháp nhuộm mực tàu; 9,5% phương pháp nuôi cấy [84] Độ nhạy độ đặc hiệu phương pháp nhuộm mực tàu 83,3% 96,49% Trong giá trị phương pháp Latex 100% 94,7% so với phương pháp nuôi cấy [84] Tuy nhiên nghiên cứu Hetal khả phát phương pháp nhuộm mực tàu cao phương pháp nuôi cấy Trong nghiên cứu chúng tơi ngược lại, phương pháp nuôi cấy cho tỷ lệ kết xét nghiệm dương tính cao nhất, sau phương pháp xét nghiệm kỹ thuật PCR, phương pháp soi tươi nhuộm mực tàu cho kết thấp nghiên cứu cho thấy tỷ lệ mẫu dịch não tủy dương tính với nấm phát biện sinh phẩm nested-PCR #A011-02 cao kỹ thuật soi tươi nhuộm mực tàu thấp kỹ thuật nuôi cấy tương đương với sinh phẩm hãng Norgen (Canada) Chúng nhận định rằng, lượng dịch não tủy q ảnh hưởng tới kết phân tích mật độ nấm dịch não tủy thường thấp [30] Khi phân tích kỹ thuật truyền thống soi tươi nuôi cấy, thường phải ly tâm, loại bỏ dịch để tập trung nấm thông thường khoảng 3-5 lần sau tiến hành kỹ thuật Hơn nữa, thực tế mẫu dịch não tủy thường ưu tiên thực chẩn đoán kỹ thuật truyền thống trước sau phần lại tiến hành thử nghiệm kỹ thuật sinh học phân tử nên lượng bệnh phẩm lại có Đây nguyên nhân dẫn đến khác biệt kết kỹ thuật nested-PCR thấp so với nuôi cấy số giá trị tiên đốn dương tính, giá trị tiên đốn âm tính số phù hợp chẩn đoán K appa sử dụng để đánh giá hiệu sinh phẩm sinh phẩm nested PCR #A011-02, so với kỹ thuật nuôi cấy bảng 3.37 chẩn đoán nhiễm C.neoformans kỹ thuật cho giá trị tiên đoán dương 100%, giá trị tiên đoán âm 99,1% số phù hợp chẩn đoán 0,929 Các kết rằng, phương pháp - 21 - nested PCR cho giá trị tiên đoán dương mức độ phù hợp cao so với nuôi cấy Điều có nghĩa 100% trường hợp chẩn đốn dương tính kỹ thuật nested PCR nghĩ tới nhiễm nấm C.neoformans thực 99,1% không nghĩ tới nhiễm C.neoformans kỹ thuật nested PCR cho kết âm tính Nếu coi ni cấy phương pháp chuẩn vàng để so sánh chẩn đốn C neoformans dịch não tủy, sinh phẩm nested PCR #A011-02 có độ nhạy Se=87,5%, độ đặc hiệu Sp=100% K ết sinh phẩm có tỷ lệ chẩn đốn dương tính bệnh nhân thực nhiễm C.neformans dịch não tủy 100% tỷ lệ chẩn đốn âm tính với C.neformans dịch não tủy sinh phẩm 99,1% - 22 - KẾT LUẬN Xây dựng quy trình kỹ thuật chế tạo sinh phẩm nested-PCR chẩn đoán nhiễm nấm C.neoformans Đã xây dựng quy trình kỹ thuật chế tạo sinh phẩm chẩn đoán nhiễm nấm C.neoformans tóm tắt sau: Bước Lựa chọn cặp mồi cho 02 phản ứng PCR với trình tự sau + Phản ứng PCR1: ITS1 F: 5’-TCC GTA GGT GAA CCT GCG G-3’; ITS4 R:5’-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3’ + Phản ứng PCR2: CN4 F: 3’-ATC ACC TTC CCA CTA ACA CAT T5’; CN5 R: 3’-GAA GGG CAT GCC TGT TTG AGA G-5’ Bước Xây dựng điều kiện cho kỹ thuật nested-PCR phát C neoformans dịch não tủy + Điều kiện cho phản ứng PCR1: Thành phần phản ứng: Nồng độ dNTPs 200µM, mồi 0,02µM, Mg2+ 2,0 mM, nồng độ Taq DNA polymerase 0,5U 25 µl thể tích phản ứng Chu trình nhiệt là: chu kỳ 94oC/5 phút; 25 chu kỳ, chu kỳ 94oC/40 giây, 56oC/40 giây, 72oC/40 giây; chu kỳ 72oC/7 phút + Điều kiện cho phản ứng PCR2: Thành phần phản ứng: Nồng độ dNTPs 200µM, mồi 0,02µM, Mg2+ 2,0 mM, nồng độ Taq DNA polymerase 0,5U 25 µl thể tích phản ứng Chu trình nhiệt PCR1 nhiệt độ gắn mồi 57oC Bước Xác định ngưỡng phát hiê ̣n của kỹ thuật nested-PCR: ≥ 102 CFU/ml dịch treo nấm; Bước Xây dựng chứng dương cho phản ứng PCR: Chứng dương ADN tách chiết, từ chủng chuẩn ATCC® 90113 Chứng dương đo nồng độ ADN điều chỉnh đến nồng độ 0,5 ng/µl - 23 - Bước Xây dựng chứng âm cho phản ứng PCR: Chứng âm ADN tách chiết từ mẫu dịch não tủy xác định không nhiễm nấm C neoformans kỹ thuật sinh học phân tử Bước Đóng gói sinh phẩm: Bao gồm thành phần: 02 ống dung dịch MC-CR1; 01 ống dung dịch MC-CR2; 02 ống dung dịch CR1, Dung dịch CR2; Dung dịch M100, Dung dịch LD100, Chứng dương, Chứng âm Có 01 hướng dẫn sử dụng tiêu chuẩn sở Về độ nhạy, độ đặc hiệu độ ổn định sinh phẩm tạo chẩn đoán nhiễm nấm C neoformans dịch não tủy - Về độ nhạy độ đặc hiệu sinh phẩm: +Trên chủng chuẩn dương 51 chủng C neoformans phân lập Việt Nam độ nhạy, độ đặc hiệu sinh phẩm đạt 100% + Đánh giá 20 dịch não tủy giả định từ nồng độ 102CFU/ml đến 105CFU/ml độ nhạy 92,5%; độ đặc hiệu 100% Giá trị tiên đoán dương 100% giá trị tiên đoán âm 87% với mức độ tin cậy 95% - Đánh 120 mẫu dịch não tủy có biểu lâm sàng viêm màng não: + So sánh với phương pháp soi tươi nhuộm mực tàu hệ số tương đồng 0,697 + So sánh kết với phương pháp nuôi cấy, độ nhạy đạt 87,5%; độ đặc hiệu 100% Giá trị tiên đoán dương 100% giá trị tiên đoán âm 99,1% + So sánh kết với sinh phẩm Norgen hệ số tương đồng - Viện kiểm định quốc gia vắc xin sinh phẩm y tế kết luận sinh phẩm chẩn đốn nested-PCR có độ nhạy đạt 98,11%; độ đặc hiệu 100%; ngưỡng phát 0,4pg/µl thực mẫu chuẩn nhà sản xuất - Bộ sinh phẩm nested-PCR phát nấmC neoformans dịch não tủy đảm bảo tính ổn định sau 12 tháng sản xuất bảo quản nhiệt độ 200C - 24 - KIẾN NGHỊ Căn vào kết nghiên cứu, đề tài có số kiến nghị sau đây: Tiếp tục đánh giá sinh phẩm nested-PCR mẫu lâm sàng diện rộng Đánh giá giá trị kinh tế hiệu áp dụng sinh phẩm thị trường Việt Nam Nghiên cứu cải tạo cách thức đóng gói sinh phẩm phù hợp với yêu cầu đơn vị sử dụng, đăng ký sở hữu trí tuệ công nghệ sản xuất sinh phẩm cung cấp cho bệnh viện tuyến Tỉnh, tuyến Trung ương sở nghiên cứu, giảng dạy nước có máy PCR ... nested-PCR chẩn đoán nhiễm nấm C neoformans dịch não t y" Với 02 mục tiêu: X y dựng quy trình kỹ thuật chế tạo sinh phẩm nested-PCR chẩn đoán nhiễm nấm C .neoformans dịch não t y Đánh giá độ nh y, độ... thực nhiễm C.neformans dịch não t y 100% tỷ lệ chẩn đoán âm tính với C.neformans dịch não t y sinh phẩm 99,1% - 22 - KẾT LUẬN X y dựng quy trình kỹ thuật chế tạo sinh phẩm nested-PCR chẩn đoán nhiễm. .. 2.7 Đạo đức nghiên cứu: Tuân thủ quy định nghiên cứu y, sinh học Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1 Kết x y dựng quy trình kỹ thuật chế tạo sinh phẩm nested-PCR chẩn đoán nhiễm nấm C neoformans