Nghiên cứu phát triển kỹ thuật phát hiện chủng Escherichia coli O157H7 và tạo kháng thể tái tổ hợp đặc hiệu (LA tiến sĩ)Nghiên cứu phát triển kỹ thuật phát hiện chủng Escherichia coli O157H7 và tạo kháng thể tái tổ hợp đặc hiệu (LA tiến sĩ)Nghiên cứu phát triển kỹ thuật phát hiện chủng Escherichia coli O157H7 và tạo kháng thể tái tổ hợp đặc hiệu (LA tiến sĩ)Nghiên cứu phát triển kỹ thuật phát hiện chủng Escherichia coli O157H7 và tạo kháng thể tái tổ hợp đặc hiệu (LA tiến sĩ)Nghiên cứu phát triển kỹ thuật phát hiện chủng Escherichia coli O157H7 và tạo kháng thể tái tổ hợp đặc hiệu (LA tiến sĩ)Nghiên cứu phát triển kỹ thuật phát hiện chủng Escherichia coli O157H7 và tạo kháng thể tái tổ hợp đặc hiệu (LA tiến sĩ)Nghiên cứu phát triển kỹ thuật phát hiện chủng Escherichia coli O157H7 và tạo kháng thể tái tổ hợp đặc hiệu (LA tiến sĩ)Nghiên cứu phát triển kỹ thuật phát hiện chủng Escherichia coli O157H7 và tạo kháng thể tái tổ hợp đặc hiệu (LA tiến sĩ)Nghiên cứu phát triển kỹ thuật phát hiện chủng Escherichia coli O157H7 và tạo kháng thể tái tổ hợp đặc hiệu (LA tiến sĩ)Nghiên cứu phát triển kỹ thuật phát hiện chủng Escherichia coli O157H7 và tạo kháng thể tái tổ hợp đặc hiệu (LA tiến sĩ)Nghiên cứu phát triển kỹ thuật phát hiện chủng Escherichia coli O157H7 và tạo kháng thể tái tổ hợp đặc hiệu (LA tiến sĩ)Nghiên cứu phát triển kỹ thuật phát hiện chủng Escherichia coli O157H7 và tạo kháng thể tái tổ hợp đặc hiệu (LA tiến sĩ)
Trang 1Tơi xin cam đoan đây là cơng trình nghiên cứu của riêng tơi dưới sự hướng dẫn của PGS TS Lê Quang Huấn và PGS TS Nguyễn Bích Nhi Các số liệu trình bày trong luận án là trung thực
Một số kết quả đã được cơng bố riêng hoặc đồng tác giả, phần cịn lại chưa được ai cơng bố trong bat kỳ cơng trình nào khác
Tơi xin hồn tồn chịu trách nhiệm về những số liệu trong luận án này! Thái Nguyên, ngày 05 tháng 03 năm 2014
Nghiên cứu sinh
Trang 2LOI CAM ON
Trước hết tơi xin bày tỏ lịng biết ơn chân thành và sâu sắc nhất tới PGS TS Lê Quang Huấn, PGS TS Nguyễn Bích Nhi đã hướng dẫn, chỉ bảo tận tình ngay từ những bước đi đầu tiên và tạo mọi điều kiện thuận lợi để tơi hồn thành luận án này
Tơi xin chân thành cảm ơn sự giúp đồ, dạy bảo tận tình của các anh chị và các em trong Phịng Cơng nghệ Tế bào Động vật — Viện Cơng nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Cơng nghệ Việt Nam đã lận tình giúp đỡ tơi trong quá trình nghiên cứu thực hiện đề tài luận án
Tơi xin cảm ơn Bộ mơn Di truyền và SHHĐ, Khoa Sinh-KTNN, Truong Dai học Sư phạm, Đại học Thái Nguyên đã tạo mọi điều kiện và giúp đỗ tơi trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu
Tơi xin cảm ơn gia đình và bạn bè tơi đã tạo mọi điều kiện và động viên tơi trong suốt quá trình học tập và hồn thành luận án
Toi xin tran trong cam on!!!
Thái Nguyên, ngày 05 tháng 03 năm 2014 Nghiên cứu sinh
Trang 3MỤC LỤC 952719525 -.:1 1 1 bhiÊ NT “ .‹g£Œ., HHH 1 2 Muc tiéu nghicn Cwisno! 2 3 I\(O4011-i1319i 0i: 011 .4 2
Chương I TƠNG QUAN TÀI LIỆU . 2-2 ©522£EE+EE£2EE+EE£2EE2EEvrEerxzrrxee 3 1.1 VIKHUẨN E COLI O157:H7 25-225 22EEEE 2211271127112 xe 3 1.1.1 Đặc điểm chung của chủng vi khuẩn E eoli O157:H7 -c-sccs2 3 1.1.2 Độc tơ Shiga-like toxin: Bản chất và tác hại 2-¿csz+cse+cxeesrxs 7 1.1.3 Nguyên nhân và diễn biến khi ngộ độc -¿- 2+ ©s+©++2zxrcrxezrxrrrs 11 1.1.4 Tình hình ngộ độc thực phẩm do vi khuẩn ở Việt Nam 13
1.2 CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN VÀ XÁC ĐỊNH VI KHUAN E COLI O157:H cssesssscssssessssessssessssesssuesssucesssesssessssessssessssesssuecssuessseesssessseessseessseeess 14 1.2.1 Phương pháp PCR dựa trên DNA - 5-55 StS + sreekesererrrrrreree 14 1.2.2 Kỹ thuật LAMP 22<22+c 221C221122112711271127117112 711.11 Cecrre 18 1.2.3 Sử dụng kháng thê tái tổ hợp trong phát hiện E coli O157:H7 19
1.3 KHANG THE cccccessesssesssesssesssesssecssecssecssecssecssecssecssecssesssecssecssecssecssecssecssesss 23 1.3.1 Mamnh khang thé cccccccccccccsssssssessssecsssecsssecsssecsssessssessssccsueessuecssscesseeesseeeasesees 25 1.3.2 Khang thé tai t6 Wop occ eeceeceecscecseecseecsecseessecssvesssessvesseesseesseesseessessseesseesseessees 26 1.3.3 Ky thuat phage display .- 27
1.3.4 Tình hình nghiên cứu sử dụng kháng thể ở Việt NĐam : + 32
Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 35
2.1 (rã ái on .e 35
Trang 4"hố nh 35
2.1.3 Các cặp mỗi được sử dụng -2-©2s+ x22 E2211711111211 11111111 xe 36
2.2 Thiết bị 5c te 1E EE 1211211111211 T1 111 11 11g11 1x 111x111 cre 36
2.3, Phương phápnghiẾn CỨH:s:scassssssssiaiiitstvilsiao365010306183113445591686185486833ãE 37 2.3.1 Phương pháp nghiên cứu DNA -. csc+Sc+tSSssrirrsrrrrrrrrrrree 37
2.3.2 Kỹ thuật bộc lộ trên thực khuẩn thể (phage display) -5+- 43
2.3.3 Phương pháp nghiên cứu pTO€1TI «+ 56x *S**vEEeEekreerkrrkrrereree 45 2.3.4 Phương pháp phân tích và xử lý SỐ ÏỆU 2 22-2 E2 EEEEEEEEEEEEerrrrrkrer 51
Chương 3 KÉT QUÁ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN .-. -+- 52
So dé nghién u00: 00 Pẽ 52
3.1 XÁC DINH VI KHUAN E COLI 0157:H7 BANG KY THUAT GEN 52
3.1.1 Xác định chủng vi khuân E coli O157:H7 bằng kỹ thuật phân tích
gen ma héa, L6S TRN Ave sscsa anacnnacsm nim ncn ace nanan 52 3.1.2 Sử dụng đoạn gen $/x/ va Stx2 để xác định E coli O157:H7 58 3.1.3 Sử dụng kỹ thuật LAMP xác định vi khuẩn E coii O157:H7 63
3.2 NGHIÊN CỨU THU NHAN KHANG THE DAC HIEU DOI VOI VI KHUAN E COLI 0157:H7 VA TACH DONG XÁC ĐỊNH TRÌNH TỰ
GEN MÃ HĨA KHÁNG THẼ -2¿++++Ek+2EESEEEEEEE1227112712271227122212 2 .e 69
3.2.1 Sang lọc kháng thể từ thư viện Griffin I ¿- +5cc2cxxvscxercrxeeee 70 3.2.2 Chọn dịng phage kháng thé đặc hiệu với vi khuẩn E coli O157: H7 72
3.2.3 Nhân bản gen mã hĩa kháng thể bằng PCR -2- 22©22z+cx+rxzrseee 74
3.2.4 Giải trình tự gen mã hố kháng thê -¿- + ++++++£x+zxzrxezrxezrxeee 75
3.3 TẠO DỊNG VÀ BIÊU HIỆN PROTEIN KHÁNG THẺ TÁI TƠ HỢP 79
3.3.1 Tạo dịng gen mã hĩa kháng thẻ tái tổ hợp -. 2 zz2cxz+cxzcxeee 79
Trang 53.3.4 Tối ưu hố các điều kiện biểu hiện gen mã hĩa kháng thể 83 3.4 TINH SẠCH VÀ XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH CỦA KHÁNG THẺ
TÁI TỔ HỢP - 2-22 2SE2EEE E2 12E1211121112117111711711211211711711711 111.1 85
3.4.1 Kiểm tra độ hoa tan va tinh sạch kháng thể tái tổ hợp . - 85
3.4.2 Xác định tính đặc hiệu của kháng thể tái tổ hợp bằng các phương
pHấP lãï blODEsszxzssrbtsiititsitittidfEDRGEEEEERSEEEEEISEREESEGHSISGIEMSEXESSERSESETSESSSSEESSSEE3SgXSriRgaaxi 88
3.4.3 Kiểm tra hoạt tính của kháng thể tái tổ hợp bằng ELISA 90 3.4.4 Xác định tính đặc hiệu của kháng thể tái tổ hợp bằng gắn hạt nano 91 KÉT LUẬN VÀ KIÊN NGHỊ, - - 2c 6 SE t‡EEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEkEEkrrkkerkerkeerkrrs 93 DANH MUC CAC CONG TRINH CONG BO KET QUÁ NGHIÊN CỨU
CỦA LUẬN ÁN - 6 5c TT E1E1111111111111111 111111 1111111111111 111111111 te 94 TÀI LIỆU THAM KHẢO 2-2 £©SESE£SEE£EE£EEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEkrrkrrkerrkrrk 95
Trang 6STT \âơỡOS=C.+ WY NK 10 37 38 Ký hiệu Amp bp CDC CDR Cfu ddNTP DNA dNTP E coli EDTA EHEC ELISA EtBr FDA HRP HC HUS IPTG Kana Kb kDa LAMP LB mAb OD PBS PCR PEG rRNA SDS SDS-PAGE STEC TAE TE TEMED v/p Vu Vi THUAT NGU VIET TAT Tên đầy đủ Ampicillin Base pair Centers for Disease Control and Prevention- Trung tam Kiém sốt va Phịng chống Dịch bệnh Mỹ
Complementarity Determining Region- Vùng quyết định tính bổ trợ Colony forming unit
Dideoxynucleotide Deoxyribonucleic Acid Deoxynucleotide Escherichia coli
Ethylene Diamine Tetra acetic Acid
Enterohaemorrhagic E coli- E coli gây xuất huyết ruột Enzyme-linked immunosorbent assay
Ethidium Bromide
Food and Drug Administration Horseradish peroxidase
Hemorrhagic Colitis- Viém dai trang xuat huyét
Hemolytic Uremic Syndrome- H6i ching dung huyét và suy thận Isopropyl-2-D-Thiogalactopyranoside Kanamycin Kilo base pair Kilo Dalton Loop-mediated Isothermal Amplification Lauria Bertani Monoclonal antibody- kháng thể đơn dịng Optical Density
Phosphate buffer saline Polymerase Chain Reaction Polyethylene Glycol
Ribosomal RNA
Sodium Dodecyl Sulphate
SDS- Polyacrylamide gel electrophoresis Shiga-like toxin producing Escherichia coli Tris - Acetate — EDTA
Tris -EDTA
N, N, N’, N’- Tetramethyl ethylenediamine Vong/phut
Variable heavy - Vùng biến đổi chuỗi nặng
Trang 7Số hiệu bảng 11 1.2 21 2.2 2.3 2.4 2.5 2.6 3.1 3.2 3.3 3.4 Tén bang Các thơng số hệ gen của vi khuẩn E coli O0157:H7 Đặc điểm của các mảnh kháng thể
Trình tự các cặp mỗi sử dụng trong nghiên cứu
Thanh phan phan tng PCR
Trang 8Số hiệu hình 11 12 13 14 15 1.6 17 1.8 3.1 3.2 3.3 3.4 3.5 3.6 3.7 3.8 39 3.10 3.11 3.12 3.13 3.14 3.15 3.16 u17 DANH MỤC HÌNH Tén hình
Hình ảnh vi khuẩn coli O157:H7 trên kính hiển vi điện tử Hình ảnh vi khuẩn E col¿ O157:H7 trên mơi trường cĩ MUG Bản đồ hệ gen (genome) của vi khuẩn E coli O157:H7
Cấu trúc độc tố Shiga-like toxin
Nguyên lý gây chết tế bào của Shiga-like toxin Nguyên lý gây bệnh cua E coli O157:H7 Cấu trúc chung của một số loại kháng thé Sơ đồ cấu tạo của mảnh kháng thể đơn chuỗi
Sơ đồ bố trí thí nghiệm của luận án
Hình ảnh điện di tách DNA tổng số của vi khuẩn E coli O157:H7
Hình ảnh điện di sản phẩm PCR nhân gen mã hĩa 16S rRNA
Hình ảnh điện di kiểm tra kết quả tách chiết DNA plasmid
Hình ảnh điện di kiém tra DNA plasmid bang enzyme gidi han BamHI Sơ đồ hình cây thể hiện mối quan hệ giữa E coli O157:H7 với chủng khác được xây dựng trên cơ sở so sánh trình tự gen 16S RNA của chủng E coli O157:H7 nghiên cứu (mã số HQ658163) và các chủng khác trên Ngân hàng Gen Quốc tế
Hình ảnh điện di sản phẩm PCR nhan gen Stx/ va Stx2
Hình ảnh điện di sản phâm PCR nhân gen Šv/ với cặp mỗi vector pJET Hình ảnh điện di sản phẩm PCR nhân gen Š/x2 với cặp mơi vector pJET VỊ trí và trình tự cặp mơi FIP/BIP
Hình ảnh điện di tách chiết DNA tổng số của vi khuẩn Hình ảnh điện di sản phẩm phản ứng LAMP
Hình ảnh điện di sản phẩm LAMP xác định hàm lượng DNA
Sản phẩm LAMP khi nhuộm bằng SYBR Green I
Kha nang gắn kết của hỗn hợp phage thu được sau mỗi vịng sàng lọc với dịng tế bào E coli O157:H7
Sơ đồ nguyên lý kỹ thuật ELISA dùng trong xác định ái lực của phage với E coli O157:H7
Trang 93.18 3.19 3.20 3.21 3.22 3.23 3.24 3.25 3.26 3.27 3.28 3.29 3.30
và tế bào E coli ATCC 25922
Kết quả điện di sản phẩm PCR của dịng 20 với cặp mỗi LABF/LABR Cấu trúc 3D kháng thẻ tái tổ hợp
Hình ảnh điện di sản phâm PCR gen mã hĩa kháng thể Thiết kế vector pET28a-TRX biểu hiện gen mã hĩa kháng thể Hình ảnh điện di xác định dịng biểu hiện bằng điện di SDS-PAGE
Hình ảnh điện di SDS-PAGE xác định nồng độ IPTG cảm ứng biểu hiện
kháng thể tái tổ hợp
Khảo sát nhiệt độ biểu hiện của kháng thể tái tổ hợp
Hình ảnh điện di SDS-PAGE kiểm tra độ hịa tan của kháng thể tái tổ hợp
Hình ảnh kết quả điện di SDS-PAGE quá trình tỉnh sạch protein tái tổ
hợp bằng phương pháp Hybrid
Hình ảnh điện di kết quả phản ứng Western blot của kháng thể tái tổ hợp
voi anti His-tag
Hình ảnh kết quả phản ứng Dot blot của kháng thể tái tổ hợp với kháng
thể chuẩn mã số AB75244 (Hang Abcam)
Trang 101 Đặt vẫn đề
Ngộ độc thực phẩm xảy ra khi chúng ta sử dụng thức ăn, nước uống khơng được bảo quản đúng cách dẫn đến sản phẩm bị hư thối do nhiễm khuẩn hoặc hĩa chất độc hại Các nghiên cứu gần đây đã xác định một trong những nguyên nhân của nhiều trường hợp ngộ độc thức ăn là do vi khuân E coli
E coli thuộc nhĩm vi khuẩn đường ruột Eerobacteriacede, cĩ nhiều trong tự nhiên, trong ruột của người và gia súc Trong đường ruột, chúng hiện diện chủ yếu ở đại tràng nên cịn được gọi là vi khuẩn đại tràng E coi nhiễm vào đất, nước từ phân của động vật Khi gặp điều kiện thuận lợi cho sự phát triển chúng sẽ gây bệnh Đa số các chủng E coii là những chủng ít độc hại, tuy nhiên cũng cĩ vài chủng rất độc như chủng E cofi O157:H7 cĩ thể tìm thấy trong ruột và trong phân của các lồi gia súc, đặc biệt là trong phân bị, chất thải của bị và các sản phẩm như thịt bị, sữa bị chưa khử trùng [49]
Các bệnh cĩ liên quan đến E coli là tiêu chảy, viêm phổi, viêm đường dẫn tiểu và một số bệnh khác Triệu chứng bị nhiễm trùng vi khuẩn thường khác nhau, nhưng nhìn chung, bệnh nhân hay cĩ các triệu chứng như: nơn, đau bụng, sốt, xuất huyết dưới da, tăng huyết áp, tiêu chảy thường cĩ máu Đại đa số bệnh nhân phục hồi sau 5 đến 7 ngày Vì vi khuân E coli qué phé biến, nên hàng năm trên khắp thế giới đều cĩ người mắc bệnh do vi khuẩn này Các chuyên gia ước tính rằng ở Mỹ mỗi năm cĩ
khoảng 70 nghìn người mắc bệnh liên quan đến E coli O157:H7 [106]
Ở Việt Nam, theo thống kê của Cục Vệ sinh An tồn Thực phẩm, năm 2010 cĩ 175 vụ ngộ độc với 5664 người mắc, trong đĩ cĩ 3978 người phải nhập viện và 51 người tử vong Năm 2011 cĩ 148 vụ ngộ độc, trong đĩ cĩ 4700 người mắc với 3663 người phải nhập viện và 27 người tử vong Năm 2012 cĩ 168 vụ ngộ độc, trong đĩ cĩ 5541 người mắc với 4335 người nhập viện và 34 người tử vong Như vậy, trong ba năm liên tiếp cĩ 491 vụ ngộ độc với l 12 người tử vong Trong năm 2013 nước ta xảy ra nhiều vụ ngộ độc nghiêm trọng nhất là những tháng cuối năm Số liệu thống kê trong quý III năm 2013 cho thấy, trong 40 vụ ngộ độc thực phẩm thì 23 vụ do vi sinh
Trang 11E coli O157:H7, tuy nhiên những vi khuẩn thuộc các nhĩm khác gây ngộ độc và các bệnh liên quan đã được phát hiện trong nhiều trường hợp [35] Trong sinh hoạt hàng ngày, khơng ngoại trừ trường hợp chúng ta bị nhiễm E coii O157:H7 thơng qua tiếp xúc hay phơi nhiễm với phân người, động vật và gia cầm
Việc xác định nhanh, chính xác sự cĩ mặt của vi khuẩn E coli O157:H7 trong các mẫu thực phẩm gĩp phần bảo vệ sức khỏe cho con người là cần thiết Việc sử dụng kháng thể kháng E.coli O157:H7, một trong những yếu tố quan trọng để phát hiện E coli O157:H7 vẫn cịn chưa được nghiên cứu Chính vì vậy, chúng
tơi đã lựa chọn đề tài: “Nghiên cứu phát triển kỹ thuật phát hiện chủng vi khuẩn
Escherichia coli O157:H7 và tạo kháng thể tái tổ hợp đặc hiệu”
2 Mục tiêu nghiên cứu
Nghiên cứu các kỹ thuật phát hiện chủng vi khuẩn E coli O157:H7 và tạo
kháng thể tái tổ hợp đặc hiệu với E coli O157:H7
3 Nội dung nghiên cứu
()_ Xác định chủng E coii O157:H7 bằng các kỹ thuật đi truyền: (1) Tách dịng
và xác định trinh tu gen 16S rRNA; (2) Tach dong va xac dinh trinh tu gen ma héa cho cac doc té Stx/, Stx2 va (3) Kỹ thuật LAMP
(ii) Tao dong gen mã hĩa cho kháng thể đặc hiệu chủng vi khuẩn E coli O157:H7 bằng kỹ thuật phage display;
Trang 121.1 VI KHUAN E COLI 0157:H7
1.1.1 Đặc điểm chung của chủng vi khuẩn E coli O157:H7
Vi khuẩn E coli O157:H7 hiện diện một cách tự nhiên trong ruột người và
động vật, cĩ thể được tìm thấy trong ruột và trong phân của các lồi gia súc, đặc biệt
là trong phân bị Thịt băm, thịt xay, thịt hamburger thường cĩ tỷ lệ nhiễm khuẩn cao nhất, ngồi ra E coli cũng cịn cĩ thể nhiễm vào nguồn nước, rau xanh, trái cây, giá sống, rượu táo, sữa và các loại nước trái cây trong lon, trong hộp nếu chúng
khơng được hấp khử trùng trước khi bán ra Ở những người bình thường, E coli
OI57:H7 gây rối loạn tiêu hĩa như đau bụng, tiêu chảy, nơn, thân nhiệt cĩ thé ting
chút ít Bình thường bệnh tự khỏi sau 1 tuần hay 10 ngày Bệnh cĩ thé rất nặng ở trẻ em, người cao tuổi và ở những người mà hệ miễn dịch đã bị suy yếu do bệnh tật 3- 5% trường hợp cĩ thê gây biến chứng sau vài ba tuần bị nhiễm bệnh Độc tố Shiga-
like toxin của £ coli O157:H7 gây sung huyết, hủy hoại niêm mạc ruột, gây tiêu chảy cĩ máu, làm hư thận và đồng thời làm giảm lượng nước tiểu Đây là hội chứng xuất huyết đường ruột (Hemolytic Uremic Syndrome, HUS), rất nguy hiểm cĩ thể gây tử vong, hoặc phải lọc thận suốt đời [72] VỊ trí phân loại: Giới : Bacteria Nganh(phylum): Proteobacteria Lop (class): Gamma Proteobacteria Bộ (ordo): Enterobacteriales Ho (familia): Enterobacteriaceae Chi (genus): Escherichia Lồi (specles): E coli Hình 1.1 Hình ảnh vi khuẩn E coli Chung: O157: H7
Trang 13giản gồm bên ngồi là vách tế bào, tiếp theo là màng sinh chất, hai lớp màng này
liên kết chặt chẽ với nhau đề bảo vệ tế bào Bên trong lớp màng là tế bào chất, nơi chứa các enzyme, đường, ATP, và các phân tử khác [60], [641]
E coli O157:H7 là vi sinh vật kị khí khơng bắt buộc, cĩ khả năng hơ hấp và
lên men, khơng sinh bào tử, tế bào tồn tại dạng đơn lẻ hoặc theo cặp đơi Khoảng
nhiệt độ tồn tại của vi khuẩn này từ 7-50°C, tối thích ở 37°C, bị tiêu diệt ở nhiệt độ
trén 70°C E coli O157:H7 sinh trưởng được trên mơi trường cĩ pH từ 4,4-9,0 và cĩ thể tổn tại được ở điều kiện pH 2,5 ở 37°C trong 2-7 giờ, pH tối ưu cho vi khuẩn
hoạt động là từ 6-7 [16] Vi khuẩn bị ức chế trong mơi trường cĩ nồng độ muối là 8,5%, chậm phát triển ở nồng độ muối trên 2,5% E coli O157:H7 sản sinh ra độc
tố gọi là Shiga-like toxin (hoặc Verocytoxin) do cĩ sự giống nhau với độc tố gây bệnh lị được tạo ra bởi Shigella dysenteria type 1, vi khuan nay cing gay ra hdi chứng xuất huyết đường ruột (HUS) ở nhiều quốc gia trên thế giới Cĩ rất nhiều chủng vi khuẩn E coli cing san sinh Shiga-like toxin nhung E coli O157:H7 1a
chủng phơ biến nhất Độc tố này được cho là yếu tố gây bệnh của vi khuẩn [33]
FE coli O157:H7 EF coli
Hinh 1.2 Hinh anh vi khuan E coli 0157:H7 trén méi trường cĩ MUG [103] Dưới ánh sáng UV 365 nm, trên mơi trường cĩ MUG vi khuẩn E coli O157:H7
khơng phát quang, các chủng vi khuẩn E coli khác phát quang
E coli O157:H7 khơng cĩ khả năng lên men đường sorbitol va cellobiose, khơng tạo ra B-D-glucuronidase do đĩ khơng chuyển hĩa 4-methylumbelliferyl-J- D-glucuronide (MUG) thành 4- methylumbelliferone nên khi chiếu đưới đèn UV
Trang 14lạc cĩ màu vàng do lên men được đường sorbitol Đây là đặc điểm được sử dụng
trong xét nghiệm đề phát hiện sự cĩ mặt của vi khuẩn này [60] E coli O157:H7 Genome etter plasmid
Hình 1.3 Bản đồ hệ gen (genome) của vi khuẩn E coli O157:H7 [105]
DNA của vi khuẩn E coii O157:H7 gồm hệ gen vùng nhân cĩ kích thước
khoảng 5,5 triệu bp, gồm 5483 gen va 2 plasmid: plasmid 16n (pO157) c6 kich thudc 9,3 kb va plasmid nho (pOSAKI) kich thuéc 3,3 kb, 7 chuỗi rRNA (16S, 23S,
5S); s6 chudi ca tRNA va mRNA 1a 102 (Bang 1.1) Tỷ lệ G+C là 50,5 % Chủng
E coli 0157:H7 1a loai vi khuan sinh độc tố, trong hệ gen vùng nhân chứa 2 gen mã hĩa cho độc tố đặc trưng của vi khuẩn này là S/x/ va Stx2 [62], duoc sir dung như là
những marker cho việc phân loại và phát hiện Mặt khác các phương pháp này cho thấy các chủng là thể liên tục chứ khơng phải phân thành các chủng khác nhau
Trang 15Bảng 1.1 Các thơng số hệ gen của vi khuẩn E coli O157:H7 Đặc điểm Hệ gen pO157 pOSAKI Kích thước (bp) 5498450 92721 3306 Tỉ lệ G+C (%) 50,5 47,6 43,4 Khung doc mo (ORF): 5361 83 3 Vùng mã hĩa protein (%) 88,1 825 52,8 Chiều dài trung bình của các ORF (bp) 904 922 579 rRNA (16S-23§-5S) 7 0 0 tRNA va mRNA 103 0 0
Khái niệm về type gây bệnh chỉ hữu ích cho việc nghiên cứu về tác nhân gây
bệnh, truyền bệnh và cĩ thê cĩ cĩ ích trong thiết lập các quy trình chân đốn Cách
phân loại như vậy cho thấy sự đa dạng giữa các chủng STEC (Shiga Toxin-Producing E.coli) Nielsen tim thay 312 chủng STEC phân lập từ bệnh nhân ở Đan Mạch thuộc 50 nhĩm O và 75 type O:H [64] Phương pháp phân loại dựa vào kháng nguyên O và
H là chủ yếu, tuy nhiên nhiều vi khuân E coli được phân lập bao gồm cả một số
nhĩm STEC chỉ cĩ một kháng nguyên O hoặc một kháng nguyên H hoặc khơng cĩ cả hai trong hệ thống quốc tế, do đĩ khơng thể phân loại bằng type huyết thanh
Trang 161.1.2 Độc tố Shiga-like toxin: Bản chất và tác hại
Theo CDC (Centers for Disease Control and Prevention-Trung tâm Kiểm
sốt và Phịng chống Dịch bệnh Mỹ), E coli O157:H7 là một trong bốn chủng vi
khuẩn gây bénh tiéu chay sau cdc ching Campylobacter sp., Salmonella sp.va Shigella sp Bốn chủng này nằm trong nhĩm độc tố Shiga toxin được sản xuất bởi E coli (shiga toxin-producing E.coli, STEC) Nhân tổ gây bệnh chính của STEC là prophage mã hĩa cho độc tố Shiga Độc tố này gây bệnh tiêu chảy và cả hội chứng HC và HUS [86] STEC sinh ra hai loại độc tố goi la Shiga toxin | va Shiga toxin 2 Các yếu tố gây độc khác bao gồm một protein màng ngồi gọi là intimin (protein quan trọng giúp vi khuẩn tổn tại trong ruột) và enterhemolysin mã hĩa bởi một plasmid được gọi là pO157 Enterohemolysin gĩp phần gây độc bằng cách phân hủy tế bào hồng cầu giúp tạo ra nguồn cung cấp sắt cho vi khuẩn
Tiểu phần B
Shiga- like toxin
Hình 1.4 Cấu trúc độc tố Shiga-like toxin [104]
Độc tố Shiga toxin được xác định lần đầu tiên bởi Kiyoshi Shiga vào năm
Trang 17tiểu phần B (mỗi tiểu phần cĩ khối lượng 7,691 kDa) (Hình 1.4) [12], [28], [33]
Trong đĩ tiêu phần A chứa một mảnh AI (27,5 kDa) cĩ chứa các vị trí cắt của enzyme và một mảnh A2 (7,5 kDa) được liên kết thơng qua một cầu disulfide [40] Tiểu phần A nằm trên một mặt phẳng tạo bởi 5 tiểu phần B, đầu C của tiéu phan A được giữ ở vị trí trung tâm của 5 tiểu phần B dz Shiga-like toxin bamvioGh3 a fg nog "3 § 2 $ Cụ, % Subunit A xâra nhập và
biển đơi N glycosidase
Cat 1 adenin của ribosorne 28S Ngăn quá trình tơng hợp protein
TẾ BẢO CHẾT
Hình 1.5 Nguyên lý gây chết tế bào của Shiga-like toxin
Tiểu phần A cĩ vai trị như một enzyme N-glycosidase cắt một base adenine ở
vị trí 4324 cua tiéu phan 28S rRNA thuộc ribosome 60S dẫn tới quá trình tổng hợp
protein trong tế bào nhiễm bệnh bị dừng lại Đây là nguyên nhân chính dẫn đến quá trình chết của tế bào do khơng tạo ra được các sản phẩm cần thiết cho quá trình sống [27] Tiểu phần B cĩ vai trị đưa độc tố vào trong tế bào chủ Năm tiểu phần B cĩ các
vị trí kết hợp với glycolipid trên bề mặt của tế bào đích, do vậy, năm tiểu phần này
Trang 18khơng cĩ Gb3 trên bề mặt thì cĩ khả năng kháng lại độc tố (Hình I.5)
Năm 1977, Konowalchuk và cộng sự đã báo cáo rằng chủng gây bệnh E coli O26:HII thuộc nhĩm EPEC (Em/eropathogemic E coli- E coli gây bệnh đường ruột) sản xuất một chất độc tác động trên té bao Vero va dat tên 1a Vero toxin [46] O'Brien và cộng sự (1987) cho rằng, độc tổ Vero toxin mà Konowalchuk nghiên cứu rất giống với độc tơ Shiga toxin được sản xuất bởi Shigella dysenteriae type 1, và nĩ cĩ thé bi vơ hiệu hĩa bằng anti-Shiga toxin, do đĩ một tên mới được đưa ra là Shiga-like toxin [69] Độc tố Vero toxin do Konowalchuk và cộng sự mơ tả giống với độc tố Shiga toxin về đặc điểm di truyền và protein Do vậy, các tên Shiga-like toxin, Shiga toxin và Vero toxin được sử dụng thay thế cho nhau, kết quả là tên các chủng VTEC (verotoxin producing E coli), SLTEC (Shiga-like toxin producing E coli) va STEC đều được sử dụng Các bệnh như HC, HUS thường gây ra bởi nhĩm STEC hoặc EHEC (Enterohemorrhagic Escherichia coli) Tất cả các chủng EHEC đều được cho là gây bệnh, tuy nhiên khơng phải tất cả các chủng STEC đều gây bệnh HC hoặc
HUS Nhĩm vi khuẩn E coli O157:H7 thuộc nhĩm EHEC Nếu xét về độc tố của nĩ, E coli O157:H7 phải thuộc về nhĩm VTEC, SLEC hoặc STEC Điều này cĩ thé
được khẳng định khi cơ chế gây bệnh của vi khuẩn được mơ tả đầy đủ Shiga-like toxin I
Shiga-like toxin I là một nhân tố độc lực của E coli O157:H7 gây bệnh ở người Giống như các độc tố khác của họ Shiga toxin, nĩ bao gồm một tiêu phần (A) cĩ chức năng enzyme và năm bản sao của một tiểu đơn vị liên kết (B- pentamer) Shiga-like toxin I được mã hĩa bởi gen $x! Các gen 8x7 cĩ cấu trúc bảo tồn cao giống với độc tố Shiga toxin do dysenteriae loại 1 tạo ra Trước đây, gen S/x/ được biết chỉ cĩ duy nhất một biến thể [53], ngày nay người ta biết thêm
một số biến thể khác của S$/x/ là Šx/c [100] và Sx/d [17] Biến thể S:x7c khơng
tìm thấy trong vi khuân STEC và khơng liên quan đến bệnh ở người
Trang 19và tiểu phần B giống hệt nhau Cấu trúc tinh thể 5 mặt pentamer tiểu phần B của
Shiga-like toxin và Shiga holotoxin đã được xác định, cả hai cấu trúc đều chứa cầu
trúc thụ cảm Cấu trúc dự đốn của hai vị trí thụ cảm đã được xây dựng mơ hình dựa trên những đặc điểm bề mặt khác của các độc tố trong họ Đã cĩ báo cáo rằng cầu trúc tỉnh thê của năm mặt Shiga-like toxin I B tao phức hợp với cấu trúc tương
tự Gb3 Cấu trúc này đã chỉ ra sự tồn tại của ba vị trí kết hợp với Gb3 của tiểu phần
B, một trong đĩ tương ứng với vị trí được dự đốn trước Kết quả về cấu trúc của Ling và cộng sự là nghiên cứu đầu tiên về sự tương tác giữa độc tố và thụ thê của nĩ (là vị trí trung gian nhận dạng tế bào đích) [50]
Độc tổ Shiga-like toxin H
Độc tổ Shiga-like toxin II trong E coli O157:H7 do gen Stx2 mi héa Gen
Stx2 co nhiéu bién thé nhu Stx2, Stx2b, Stx2c, Stx2d, [44], nhung chi cé biến thé Stx2c duoc tim thay trong ching E coli O157:H7 [27] Các biến thé $¡x2 được phân
biệt với nhau nhờ các đặc điểm như hoạt tính sinh học, phản ứng miễn dịch, hoặc
thụ thể mà nĩ kết hợp Do đặc tính kết hợp với thụ thể khác nhau dẫn đến khả năng
gây độc đối với từng tế bào khác nhau Các nghiên cứu cho thấy chủng vi khuẩn STEC tao Stx2 (Stx2a, 2c va 2d) cĩ liên quan chặt chẽ với hội chứng HUS hơn các
chủng vi khuẩn chi sinh ra Stx/ [29] Shiga-like toxin II khơng giống hồn tồn với
Shiga-like toxin L Shiga-like toxin II cĩ nhiều đặc tính sinh học giống với Shiga toxin đặc biệt là trình tự nucleotide và protein, Shiga-like toxin II cĩ cùng điểm đẳng điện và độ bền nhiệt với Shiga toxin, cùng bị trung hịa bởi huyết thanh Các kỹ thuật giải trình tự nucleotide và so sánh amino acid cho thấy Shiga-like toxin I và Shiga-like toxin II cĩ tỷ lệ tương đồng về gen là 99% và chỉ khác nhau một amino acid trong tiéu phan “A” Tuy nhién Shiga-like toxin II lại cĩ tính kháng nguyên khác với Shiga-like toxin I bên cạnh đĩ Shiga-like toxin I khơng bị vơ hiệu bởi anti-Shiga-like toxin hoặc kháng thể kháng Shiga-like toxin I Shiga-like toxin II cĩ nhiều trình tự và tính kháng nguyên đa dạng hơn Shiga-like toxin I [27], [33]
Shiga-like toxin 2 cĩ liên quan với HUS StxI và Stx2 cĩ độc tính khác nhau
đối với từng loại tế bào So với Shiga-like toxin 1, Shiga-like toxin 2 độc hơn gấp
Trang 20(2003) đã thử nghiệm và so sánh ảnh hưởng của Shiga-like toxin 1 va Shiga-like toxin 2 trên mơ hình động vật linh trưởng [85] Siegler da tiém Shiga-like toxin 2 vào tĩnh mạch dẫn tới biểu hiện lâm sàng và bệnh đặc trưng cho HUS, trong khi tiến
hành tương tự đối với Shiga-like toxin 1 thì khơng thấy cĩ sự phát triển bệnh So
sánh cấu trúc tinh thể của Shiga-like toxin 2 và Shiga toxin cho thấy cĩ 4 điểm cầu trúc khác biệt lớn cĩ thể giải thích cho sự liên quan giữa Shiga-like toxin 2 với HUS Sự khác biệt lớn nhất là do vị trí hoạt động của Shiga-like toxin 2, sự tăng cường khả năng gây độc cĩ thể do tiêu đơn vị A của Shiga-like toxin 2 hình thành cấu trúc xoắn 2 vịng sau khi đi qua vịng trung tâm cấu trúc pentamer của 5 tiểu phần B Một trong ba vị trí liên kết với thụ thể trong cấu trúc pentamer tiểu phần B của Shiga-like toxin 2 cĩ hình dạng khác so với các cấu trúc pentamer-B của Shiga- like toxin Vị trí đầu carboxyl đoạn AI của Shiga-like toxin 2 liên kết với một vị trí trong Shiga-like toxin 2 [27]
Shiga-like toxin 2 khơng chỉ gây độc tế bào đối với tế bào Vero và Hela, mà
cịn gây độc trong ruột thỏ, gây chết do tê liệt trên chuột thí nghiệm Tuy nhiên khi phân tích các mẫu E coi O157:H7 phân lập được từ các đợt dịch và những bệnh nhân mắc HUS cho thấy rằng các chủng này khơng sản sinh một độc tố duy nhất mà cùng sản xuất cả hai loại Shiga-like toxin Như vậy cĩ thể cĩ một mối liên hệ giữa cả hai loại độc tố này trong quá trình gây bệnh của vi khuẩn, tuy nhiên điều này vẫn chưa được làm sáng tỏ [20]
1.1.3 Nguyên nhân và diễn biến khi ngộ độc
Trang 21thời gian dài sẽ làm tăng huyết áp của bệnh nhân (Hình 1.6) Mặt khác, các khối
ngưng kết này chính là nguyên nhân gây ra HUS vì chúng làm nghẽn các mạch máu nhỏ, khiến máu khơng đi hết được tới các tế bào làm giảm chức năng của các cơ quan gây suy tạng đặc biệt là thận <«— Shiga-like toxin (verotoxin- VT)
Huyết khơi làm ảnh hưởng tới
thận, ruột gây ra xuât huyệt ruột
và HUS
a Ep Pee fo xm hap vio ma
lam các tê bào hong cau
von cục thành huyết khơi
Tiêu cầu
Hình 1.6 Nguyên lý gây bệnh của E coi O157:H7
Triệu chứng điển hình nhất khi bị nhiễm vi khuẩn E cofi O157:H7 là: tiêu
chảy, ĩi mửa, đau bụng quặn thắt, sốt nhẹ, mệt mỏi, đơi khi đi ngồi cĩ máu Tiếp theo là một số vấn đề sức khỏe gồm các triệu chứng sau: () Viêm đại tràng xuất huyết cĩ triệu chứng là đau bụng, đi ngồi cĩ thể đi ngồi ra máu Viêm đại tràng xuất huyết được coi là biểu thị đặc trưng cho việc nhiễm E coli O157:H7 hoặc là sự
phát triển của HUS 38-61% trường hợp nhiễm E coli O157:H7 đều cĩ triệu chứng
này Thời kỳ ủ bệnh thường từ 1-9 ngày trong các đợt dịch Đối với trẻ em hiện tượng tiêu chảy kéo dài lâu hơn (9,1+ 2 ngày) so với người trưởng thanh (6,6+ 1,1 ngày) và cuối cùng thường là triệu chứng đi ngồi ra máu [16], [20]; (1) Hội chứng dung huyết suy thận (HUS) được đặc trưng bởi các dấu hiệu như: thiếu máu do dung huyết, tiêu cầu vĩn cục và suy thận, hội chứng này xuất hiện chủ yếu xuất hiện ở trẻ dưới 10 tuổi và người cao tuổi Các triệu chứng đầu tiên của HUS là: người bệnh xanh xao, thiếu máu, bí tiểu, phù và suy thận cấp, các triệu chứng này bắt đầu từ
khoảng một tuần sau khi nhiễm vi khuẩn Một nửa bệnh nhân HUS phải lọc thận và tỉ lệ tử vong của số bệnh nhân này là 3-5% Một số biến chứng khác của HUS cĩ thể
Trang 22hợp tử vong do E coli O157:H7 thường xảy ra với người cao tuổi với nguyên nhân chủ yếu do tiêu chảy, HUS, xuất huyết, phát ban, sốt cao [20]
1.1.4 Tình hình ngộ độc thực phẩm do vi khuẩn ở Việt Nam
Theo thống kê của của Bộ Y tế, từ năm 2004-2009 đã cĩ 1.058 vụ ngộ độc thực phẩm, trung bình 176,3 vụ/năm, sỐ người bị ngộ độc thực phẩm là 5.302 người/năm, số người chết là 298 người (49,7 người/năm), tính trung bình tỷ lệ
người bị ngộ độc thực phẩm cấp tính là 7,l người/100 nghìn dân/năm Năm 2009 cĩ 152 vụ ngộ độc thực phẩm với 5.212 người mắc và 3l người tử vong So sánh với
năm 2008, số vụ ngộ độc/năm 2009 giảm 53 vụ (25,9%); số người mắc giảm 2.616
người (33,4%); số người đi viện giảm 1.888 người (31,3%); và số người bị tử vong giảm 26 trường hợp ( 42,6%) Về nguyên nhân ngộ độc thực phẩm, 29,6% số vụ do thực phẩm bị ơ nhiễm vi sinh vật, 5,2% số vụ do hĩa chất, 24,7% do thực phẩm cĩ sẵn độc tố tự nhiên, 40,5% số vụ khơng xác định được nguyên nhân [102]
Trong năm 2013, ở nước ta đã xảy ra nhiều vụ ngộ độc nghiêm trọng, trong đĩ nguyên nhân chủ yếu là do vi khuẩn E cọi gây ra (thống kê trong quý III năm 2013 trong 40 vụ ngộ độc thực phẩm thì 23 vụ do vi sinh vật gây ra) Trong 5 ngày (từ 23-28/5/2013) cĩ 163 người ở Bến Tre nhập viện do các triệu chứng ngộ độc như ĩi mửa, tiêu chảy kéo dài, sốt cao, đau bụng Các bệnh nhân được hỏi đều cho
biết đã ăn bánh mì mua tại tiệm Minh Tuyến Kết quả kiểm nghiệm của Viện
Pasteur TP HCM cho thấy các loại thực phẩm bên trong bánh mì của tiệm bánh mì này như thịt, đồ chua, pa-té, bo đều nhiễm các loại khuẩn E coli, Coliform va Shigella 6 mirc cao Ngay 4/10/2013 xảy ra vụ ngộ độc tại Cơng ty TNHH Một thành viên Wondo Vina (trụ sở tại xã Long Bình Điền, huyện Chợ Gạo tỉnh Tiền Giang) làm 1200 cơng nhân phải nhập viện Nguyên nhân được xác định là do thức
ăn nhiễm vi khuẩn Samonella Ngày 16/10/2013 gần 400 người bị ngộ độc khi sử
dụng bánh mỳ ở Quảng Trị, trong đĩ 382 người phải nhập viện Nguyên nhân cũng
được xác định do vi khuan Salmonella gây ra Tiếp theo ngày 17/10/2013, 113 cơng
nhân ở Bình Dương ngộ độc do ăn thịt bị, trong đĩ cĩ 47 cơng nhân cĩ triệu chứng điển hình ngộ độc thực phẩm Nguyên nhân gây ngộ độc thực phâm được xác định
Trang 23gia đình bà Lê Thị Thêm (Đơng Châu, Thạch Văn, Thạch Hà, Hà Tĩnh), cĩ hơn 58 người dân đa phần ở xã Thạch Văn bị ngộ độc thực phẩm, trong đĩ 43 người phải chuyển vào Trạm Y tế xã nằm lại để thăm khám, trong đĩ cĩ đến 15 người ở thể nặng phải chuyển tiếp lên Bệnh viện Đa khoa tỉnh Hà Tĩnh cấp cứu, chăm sĩc Ngay sau khi vụ ngộ độc xảy ra, Chi Cục Vệ sinh An tồn Thực phẩm tỉnh Hà Tĩnh
đã phối hợp với Trung tâm Y tế Dự phịng huyện Thạch Hà và Trạm Y tế xã Thạch
Văn tơ chức thực hiện điều tra để xác định nguyên nhân Kết quả điều tra cho thấy nguyên nhân ngộ độc là do nhiễm khuẩn
Hàng năm trên cả nước xảy ra nhiều vụ ngộ độc thực phẩm nghiêm trọng, tuy nhiên chưa cĩ vụ ngộ độc thực phẩm nào gây ra bởi E coli 0157:H7 Mac di
vậy, khơng thê loại trừ khả năng vi khuẩn này sẽ bùng phát thành dịch bệnh trên
diện rộng Trong nhiều nghiên cứu [7], [9] các nhà nghiên cứu đã phát hiện được vi khuẩn này nhiễm trong thịt lợn, thịt bị tại các cửa hàng tạp hĩa Do vậy, việc đưa ra
các phương pháp phát hiện,chân đốn nhanh và kháng thê đối với vi khuẩn E coli O157:H7 là cĩ tính thiết thực
1⁄2 CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN VÀ XÁC ĐỊNH VI KHUẨN E COLI O157:H7
1.2.1 Phương pháp PCR dựa trên DNA
Hiện nay, phương pháp truyền thống dựa trên các đặc điểm hình thái, huyết thanh vẫn đang là cơng cụ quan trọng trong phân loại vi khuẩn Các phương pháp về hình thái học, huyết thanh học thường được kết hợp với các phương pháp nhuộm (ví dụ như nhuộm Gram) thường được sử dụng trong nhận dạng Tuy nhiên, các phương pháp truyền thống này chưa đủ để phân loại những lồi gần nhau Trong một số trường hợp, phân loại truyền thống gặp trở ngại do một số đặc tính dùng cho nhĩm vi sinh vật này nhưng lại khơng cĩ ý nghĩa với nhĩm vi sinh vật khác Điều này dẫn đến nhiều trường hợp phải xác định lại tên phân loại của một số vi sinh vật
Mặt khác, đối với những lồi cĩ độ tương đồng cao về mặt hình thái thì phân loại
Trang 24Ngày nay, do những tiến bộ khoa học kĩ thuật trong sinh học phân tử, di
truyền học phân tử, phương pháp phân loại vi khuân đã được bổ sung nguồn đặc
điểm phân loại theo genotype Các kết quả nghiên cứu so sánh sinh hĩa đã chứng minh được rằng thành phần và trình tự nucleotide của DNA và rRNA, các loại gen điều khiến trao đổi chất, thành phần và cấu tạo các bào quan là những bằng chứng đáng tin cậy để xác định lồi Kết hợp với phương pháp phân loại theo đặc điểm hình thái (phenotype) thì phương pháp phân loại dựa vào những phân tích, so sánh trình tự gen dang được coi là cơng cụ để xác định vi khuẩn ở nhiều bậc định loại
lồi Đặc biệt phân tích trình tự của rRNA cịn là phương tiện để điều tra và định
danh những lồi vi khuẩn khơng thể nuơi cấy trong mơi trường nhân tạo [3] Hiện nay, đại đa số các nhà khoa học đồng ý với quan niệm 2 chủng được coi là 2 lồi
riêng biệt nếu chúng giống nhau đưới 70% khi tiến hành lai DNA Keswani và cộng
sự (2001) đã chứng minh rằng nếu sự tương đồng giữa hai trình tự gen 16S rRNA thấp hơn 98,6% thì xác suất để mức độ giống nhau trong phép lai DNA thấp hơn 70% sẽ là 99% Vì thế giá trị tương đồng 98,6% của trình tự gen 16S rRNA được coi là ngưỡng để phân biệt hai lồi khác nhau Tuy nhiên, cũng cĩ nhiều nhà khoa học lay giá trị này là 98% [43]
Trang 25nhưng lại khơng đủ để phân biệt một cách chỉ tiết giữa các chủng Ngược lại, gen ma héda cho 23S rRNA lai cĩ kích thước lớn, khoảng 3.000 nucleotide, gây khĩ khăn cho việc tách dịng, đọc và so sánh trình tự Do vậy, trong định danh vi khuẩn thường dựa vào trình tự của đoạn 16S rRNA Gen 16S rRNA cĩ kích thước khoảng 1540 nucleotide [73], cĩ nhiều ưu điểm: (i) phổ biến trong tất cả các sinh vật Prokaryotes; (ii) kích thước và tính bảo thủ về chức năng của gen là kết quả của tỷ
lệ đột biến thấp trong suốt quá trình tiến héa va (iii) vùng bảo thủ cĩ thể được sử
dụng để thiết kế mồi trên các đơn vị phân loại, cũng như chín vùng siêu biến (VI-
V9) cĩ thể được sử dụng hiệu quả dé phân biệt giữa các đơn vị phân loại Chính vì
thế nên gen 16S rRNA cĩ thể được coi là một marker cho nghiên cứu phân loại [54] Thêm vào đĩ, trén gen 16S rRNA cĩ chứa các vùng biến đổi (variable) và vùng bán bảo tồn (semi-conserved) cho phép xác định tính đặc trưng ở mức độ chủng, lồi [19] Do vậy, gen 16S rRNA đã được các nhà khoa học nghiên cứu kỹ lưỡng và đã thiết kế được rất nhiều cặp mỗi để nhân đoạn gen này bằng kỹ thuật PCR Đây là một thuận lợi cho các nghiên cứu phân loại dựa trên các gen mã hĩa 16S rRNA Ngồi ra, người ta cịn sử dụng vùng đệm giữa gen 16S rRNA và 23§ tRNA để nghiên cứu về tính đa dạng của prokaryotes [30] Cĩ nhiều kết quả nghiên
cứu sử dụng kỹ thuật PCR để phát hiện hoặc phân loại các lồi vi khuẩn Ví dụ gần
đây nhất, Mizrahi-Man (2013) cũng sử dụng trình tự ngắn gen 16S rRNA dé phan loại [54] Theo Hoo và cộng sự, trong 7 năm (2001- 2007) sử dụng trình tự 16S rRNA đã phát hiện được 215 lồi mới trong đĩ cĩ 29 lồi mới Tác giả cũng khẳng định nên sử dụng các phương pháp khác để bổ sung cho phương pháp sử dụng gen
16S rRNA [99]
Bên cạnh các gen rRNA, các gen độc tố cũng được sử dụng trong phân loại học phân tử Các gen này thường là những gen gây độc nằm trong các vi khuân gây
bệnh ở các lồi Ví dụ, đối với E coli O157:H7 các gen độc tố thường được sử dụng
Trang 26phẩm cũng là một hướng được nhiều nhà khoa học quan tâm Năm 2010, Sanchez
sử dụng các kỹ thuật PCR, kiểu huyết thanh, kiểu phage và kỹ thuật PFGE (pulsed-
field gel electrophoresis) trên cdc gen Stx/, Stx2, ehxA, eae va saa để xác định sự
phát tán và các đặc điểm của vi khuan E coli O157:H7 va vi khuẩn tao Shiga toxin
khơng phải là O157 [14], [82] Cũng trong năm 2010, Sahilah và cộng sự đã sử
dụng kỹ thuật PCR và kỹ thuật RAPD để xác định vi khuẩn E coli O157:H7 trong
20 mẫu thịt bị từ các cửa hàng bán lẻ thịt bị thuộc Selangor, Malaysia Kết quả cho
thấy, cĩ 14 mẫu dương tính với Šx/ và Šx2, 5 mẫu dương tính với S/x! và 1 mau
âm tính với cả Šx/ và $x2 Tác giả cho rằng, 20 mẫu phân lập là 20 loai E coli
O157:H7 khác nhau, điều đĩ cĩ thé cho thấy mức độ biến đổi di truyền địa lý ở mức
độ cao [79]
Dựa trên các nghiên cứu, đã cĩ nhiều Cơng ty nghiên cứu sử dụng các kỹ thuật sinh học phân tử hiện đại (PCR, Real-time PCR, ELISA ) để tạo các kit nhằm phát hiện nhanh chủng vi khuẩn E coli O157:H7 trong cdc mẫu bệnh phẩm cũng như trong các mẫu thí nghiệm Ưu điểm của các phương pháp này là nhanh, độ đặc hiệu tương đối cao Tuy nhiên, giá thành của chúng cịn cao, thời gian xác
định lâu Kỹ thuật PCR được sử dụng nhiều nhất để tao kit Ví dụ nhu kit phat hiện E coli O157:H7 của Hãng Norgen Bộ kit này được thiết kế để tối ưu hĩa quá trình
tách chiết DNA của vi khuẩn từ sữa, các mẫu thực phẩm đã được làm giầu và tối ưu
quá trình khuếch đại và xác định DNA vi khuẩn Nguyên tắc của bộ kit là phản ứng
PCR dựa trên gen đích là hai gen Shiga toxin | va 2 cĩ kích thước 348 bp và 587 bp Ngồi ra, bộ kit cịn chứa đối chứng âm để xác định phản ứng PCR diễn ra bình thường và đối chứng dương để xác định kết quả quá trình tách chiết Quy trình phát
hiện gồm 4 bước: (1) Chuẩn bị mẫu; (2) Tách chiết DNA; (3) Phản ứng PCR và (4)
Điện di trên gel agarose và đánh giá kết quả Thời gian cho cả quá trình tách chiết
DNA và khuếch đại hết 200 phút Ưu điểm của bộ kit này là cĩ thể phát hiện được vi khuẩn E coli O157:H7 trong cả sữa và các mẫu thực phẩm được làm giàu; giới
Trang 27cĩ một số nhược điểm như thành phần bộ kit cịn nhiều, điều kiện lưu gIữ cịn phức tạp (một số thành phần cần bảo quản ở -20°C, một số ở nhiệt độ phịng), so với một số kit khác độ chính xác của kit này chưa cao
Bên cạnh đĩ cịn các kit phát hiện chủng vi khuẩn E coli O157:H7 dựa trên kỹ thuật PCR và các phiên ban PCR nhu: MicroSEQ E coli 0157:H7 Detection Kit cua Hang Invitrogen, TaqMan® E coli O157:H7 Detection Kit cia Hang Applied Biosystems
1.2.2 Kỹ thuật LAMP
Ky thuat LAMP (Loop-mediated isothermal amplifcation) được nghiên cứu và phát triển bởi Cơng ty Eiken Chemical Co Ltd Đây một phương pháp nhân bản gen, cĩ thể tổng hợp một đoạn DNA lớn mà khơng cần các chu trình biến nhiệt [67] Đặc
điểm phương pháp là sử dụng 4 mỗi khác nhau được thiết kế đặc biệt để nhận ra 6
vùng riêng biệt trên gen đích và phản ứng diễn ra ở một nhiệt độ duy nhất Quá trình khuếch đại và phát hiện gen đích chỉ diễn ra trong một bước duy nhất Thành phần phản ứng gồm cĩ mẫu, mơi, enzyme DNA polymerase, hỗn hợp phản ứng được ủ ở 65°C Phương pháp này cĩ hiệu quả khuyếch đại cao khoảng 10710” lần trong 15-60 phút So với các phương pháp như PCR, Realtime PCR LAMP cĩ nhiều ưu điểm
hơn như: chính xác, đơn giản, giá thành thấp và đặc biệt là thời gian thực hiện ngắn
và cĩ thể phát hiện kết quả bằng mắt thường Do vậy, LAMP thường được sử dụng để tạo các bộ kit chân đốn nhanh được phổ biến rộng rãi trên thế gidi
Phương pháp LAMP rất đơn giản, dé thực hiện LAMP là phương pháp tổng hợp thay thế DNA từ sợi đơi và tự lặp lại nhờ Bst DNA polymerase và 4 mỗi được
thiết kế đặc biệt: hai mỗi trong (FIP và BIP) và hai mỗi ngồi (F3 và B3) [57] Hơn
nữa Nagamine và cộng sự (2002) đưa ra phương pháp mới bằng cách đặt mỗi vịng xuơi và ngược (LF và LB) làm phản ứng LAMP duoc tiễn hành nhanh hơn [61]
LAMP là phản ứng nhân bản DNA hết sức đặc hiệu, chỉ xảy ra khi cĩ điều kiện cần và đủ cho phản ứng, đĩ là chỉ khi cả 4 chuỗi mỗi, bao gồm các mồi đơn F3, B3, các
Trang 28tủa của phản ứng tạo muối pyrophosphate (MgP;O;) hoặc phát quang khi nhuộm
bằng thuốc nhuộm [31], [56]
Phát hién E coli 0157:H7
Từ khi kỹ thuật LAMP được phát triển đến nay, trên thế giới cĩ nhiều nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật LAMP để phát hiện E coii O157:H7 và một số vi khuẩn gây độc khác đặc biệt là họ EHEC Hầu hết các nghiên cứu này dựa trên các gen gây độc như Stx1, Stx2, rfb, eae [34], [52], [96] Day là những nhân tố quan trọng gây nên các bệnh ở người như xuất huyết ruột, HUS Một vài nghiên cứu, phát triển kỹ thuật
LAMP phát hiện E coli O157 trong thịt bị, thận bị, phân bị và những sản phẩm khác từ bị [70] Từ những nghiên cứu này, Cơng ty Eiken đã chế tạo thành cơng các
kit xác định nhanh E coli O157 Kit cho phép phát hiện độc tố trong thực phâm và
mơi trường, tuy nhiên giá thành của kit cịn đắt (500 USD cho 48 phản ứng)
1.2.3 Sử dụng kháng thể tái tổ hợp trong phát hiện E coli O157:H7
Từ đầu thế kỷ 19 các nhà khoa học đã ứng dụng tính đặc hiệu của phản ứng
kháng nguyên-kháng thể để nhận diện và xác định kiểu huyết thanh của các tác nhân gây bệnh Khi kháng thể đặc hiệu xuất hiện trong mẫu, chúng sẽ liên kết trực
tiếp với kháng nguyên tạo thành phức hợp miễn dịch kháng nguyên-kháng thể, phức hợp này được phát hiện bằng một kháng thể khác đã được đánh dấu enzyme hoặc huỳnh quang Kháng nguyên cĩ thể là tồn bộ vi khuân hoặc một phần của tế bào vi khuẩn Phát hiện sự cĩ mặt của kháng thể vẫn được sử dụng trong các nghiên cứu để chứng minh rằng con vật đĩ cĩ tiếp xúc với mầm bệnh hay khơng; hoặc sàng lọc
một nhĩm cá thê để xác định tỷ lệ nhiễm bệnh trong quần thể Mặc dù phát hiện
kháng thể cĩ tầm quan trọng trong xác nhận sự cĩ mặt của kháng thể nhưng nĩ khơng nhất thiết là chỉ thị trong miễn dịch dự phịng và cũng khơng phải là một chỉ thị cho biết cĩ mầm bệnh đĩ trong thời điểm hiện tại hay khơng [4]
Ky thuat ELISA
Trang 29thể thứ hai cĩ gắn với enzyme như horseradish peroxidase hay alkaline phosphatase Khi bổ sung một cơ chất đặc hiệu của enzyme vào giếng, enzyme sẽ xúc tác phản ứng thủy phân cơ chất đề tạo ra các phản ứng cĩ màu hay phát sáng Bằng cách theo dõi sự chuyển màu, cĩ thể phát hiện sự hiện diện và định lượng được kháng nguyên Kháng nguyên (antigen) là những chất cĩ khả năng huy động hệ miễn dịch tiết ra kháng thể đặc hiệu với chúng gây ra phản ứng miễn dịch đặc hiệu Kháng nguyên cĩ thể cĩ bản chất là protein lạ, acid nucleic, một số lipid và polysaccharide E coli cĩ 3 câu trúc kháng nguyên với tên gọi là O, K và H
Khang thé (antibody) 1a protein y- globulin được sinh ra béi té bao lympho
tham gia phản ứng miễn dịch đặc hiệu với kháng nguyên dia giéng ELISA (microplate) là một phiến nhựa phẳng với nhiều "giếng" được sử dụng như những ống nghiệm nhỏ Microplate đã trở thành một cơng cụ tiêu chuẩn trong nghiên cứu phân tích và phịng thí nghiệm thử nghiệm chân đốn lâm sàng ELISA được dùng
phổ biến trong các khảo nghiệm miễn dịch, là xét nghiệm chẩn đốn y tế hiện đại
trên người và động vật
ELISA cịn được dùng để phát hiện kháng nguyên hoặc kháng thể trong mẫu thơng qua phản ứng đặc hiệu kháng nguyên-kháng thể Bằng phương pháp đo gián tiếp cường độ phản ứng của enzyme của phức hợp miễn dịch người ta cĩ thể lượng hĩa được kháng nguyên và kháng thé cần phát hiện Nguyên lý chung là các kháng nguyên hoặc kháng thê được gắn trên một giá thể rắn, chính các nhân tố này sẽ bẫy bắt kháng thể hoặc kháng nguyên đặc hiệu Sau khi rửa để loại bỏ các vật liệu khơng bám lên thành các giếng của phiến nhựa, kháng thể thứ hai được đánh dấu bằng enzyme được bổ sung thêm vào giếng phản ứng Phân tử kháng thể này sẽ gắn
với một epitope khác trên phân tử kháng thể thứ nhất Sau khi rửa lần thứ 2 để loại
bỏ lượng kháng thể dư thừa, cơ chất được thêm vào và phản ứng enzyme xảy ra ELISA được sử dụng rộng rãi dưới dạng các bộ hĩa chất (kit) để phát hiện và định lượng vi sinh trong thực phẩm trong thời gian vài giờ sau khi tăng sinh Kỹ thuật này cĩ độ nhạy phát hiện khoảng 10 cfu/ml (một số báo cáo cho rằng giới hạn này
Trang 30Cĩ nhiều cơng ty sử dụng phương pháp ELISA để tạo kit phát hiện vi khuẩn E coli O157:H7 như: E coli O157 Antigen Detection (trong thực phẩm) của Cơng ty Diagnostic Automation, # coi O157 antigen ELISA Kit của Cơng ty Abnova Những kít này thường sử dụng phương pháp Sandwich ELISA Day là một dang ELISA được sử dụng phổ biến do nĩ cho phản ứng mạnh và độ nhạy cao Được gọi là “sandwich” là do kết quả được đánh giá thơng qua sự kết hợp của hai loại kháng thể là kháng thể bắt (capture antibodies) và kháng thể phát hiện (detection
antibodies) Cac khang thé bắt là kháng thê đặc hiệu với vi khuẩn E coli O157:H7
được gắn ở các giếng Sau khi bổ sung mẫu và enzyme nối vào giếng ELISA, một phản ứng sẽ xảy ra Nếu cĩ kháng nguyên E coli O157:H7 trong mẫu phân tích, sẽ
xảy ra phản ứng kết hợp giữa kháng nguyên và kháng thể bắt cặp dẫn tới quá trình
thay đổi màu sắc bởi giữa kháng thể phát hiện và cơ chất Kết quả là các giếng xuất hiện màu sắc khác nhau (thường là màu vàng khi đương tính và màu xanh khi âm tính) Kết quả này cĩ thể được đọc trực tiếp bằng mắt thường hoặc sử dụng thiết bị đo ELISA chuyên dụng So với kỹ thuật PCR, phương pháp ELISA phức tạp hơn, đắt tiền hơn tuy nhiên, phương pháp này cĩ độ chính xác cao hơn và cĩ thé phát hiện được nhiều bệnh và tác nhân gây bệnh trong cùng một lần phân tích
Que nhúng (quick-stick) là phương pháp phát hiện nhanh nhất hiện nay trong lĩnh vực chân đốn Dụng cụ này thường cĩ hình que hoặc hình bút Trên dụng cụ cĩ một ơ nhỏ chứa mẫu và một cửa số để hiện kết quả Sau khi một giọt mẫu được nhỏ vào cửa số nhận mẫu, kết quả sẽ hiện ở cửa số đọc kết quả sau ít phút Kiểu thí nghiệm như thế này cĩ thé thực hiện rất nhanh và đơn giản, các kết quả nhận được
trong thời gian từ 10 đến 15 phút Tuy nhiên, thí nghiệm cần một lượng lớn tế bào
(từ 10’ dén 10° cfu) và độ đặc hiệu thấp về nguyên lý: tại vùng nhận cĩ chứa kháng thể cộng hợp hạt vàng, khi mẫu được nhỏ vào cửa số nhận mẫu, các kháng thể hoặc kháng nguyên cĩ mặt trong mẫu sẽ liên kết với các kháng thể cộng hợp tạo thành phức kháng nguyên-kháng thể Phức cộng hợp hạt vàng sẽ di chuyên đến cửa
số hiện kết qua để liên kết với kháng thể đã được cố định tại đĩ Tại cửa số hiện kết
Trang 31thể tĩm bắt, kết quả tạo thành một băng mầu cĩ thể quan sát bằng mắt thường Ngược lại nếu trong mẫu khơng chứa kháng nguyên hoặc kháng thể quan tâm thì
phức chất sẽ liên kết với kháng thể đặc hiệu loại tạo thành băng màu Vì vậy, thử
nghiệm bao giờ cũng xuất hiện băng màu tại cửa số đối chứng cho dù mẫu được
kiểm định là âm tính hay dương tính Nếu cửa số hiện kết quả xuất hiện hai băng màu thì mẫu được kiểm định là dương tính [4]
Trong phát hiện vi khuẩn E coii O157:H7 cĩ Rapid Qualitative E coli O157:H7 Test Kit của Cơng ty Cell Biolabs Kit kiểm tra nhanh này được thiết kế để phát hiện kháng nguyên vi khuẩn O157: H7 trong mẫu thực phẩm bị ơ nhiễm Kit test nhanh này nhanh chĩng kiểm tra chất lượng thơng qua việc sử dụng các
kháng thể E coli O157:H7 cụ thể Phản ứng giữa mẫu dương tính và hạt mầu chứa
kháng thể liên hợp sẽ tạo thành một phức và di chuyển đọc theo que thử Một kháng thể cố định sẽ tạo thành một đường màu ở vùng kiểm tra để đảm bảo rằng cách kiểm tra được thực hiện một cách chính xác kết quả kiểm tra xuất hiện ở vùng trung tâm của đải kiểm tra Kết quả test là âm tính nếu chỉ cĩ duy nhất một dải mầu xuất hiện ở vùng điều khiển, nếu cĩ xuất hiện mầu ở vùng kiểm tra (dù là mờ nhạt nhất), kết quả test sẽ được coi là dương tính Độ đậm nhạt của của đường mầu ở vùng kiểm tra so với vùng điều khiển là khơng quan trọng
Phát hiện E coli bằng phức hợp kháng thể và hạt nano phát quang
Trong số các loại vi khuẩn gây ngộ độc thực phẩm, E£ coli O157:H7 được xem là rất nguy hiểm với liều gây độc thấp (10-100 tế bào) Người ta đã sử dụng nhiều phương pháp khác nhau để phát hiện chúng như: đếm tế bào dưới kính hiển vi, đếm khuẩn lạc trên đĩa thạch, miễn dịch học bằng enzyme, đầu đị enzyme, ELISA, kit chan doan bằng PCR Phương pháp phát hiện E coi O157:H7 trong
thực phẩm là sử dụng kỹ thuật làm giầu, xác định khuẩn lạc nghỉ ngờ cĩ E coli
Trang 32như hạt vàng, hạt silica chứa tâm màu hay chấm lượng tử QD chứa các nhĩm chức
năng sinh học trên bề mặt như một chất đánh dấu huỳnh quang để phát hiện nhanh
và chính xác số lượng vi khuẩn gây bệnh thực phẩm bằng kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang Khâu cốt lõi của kỹ thuật sử dụng hạt nano silica chứa tâm màu là việc chế tạo ra được phức hợp giữa kháng thể đặc hiệu vi khuẩn đích với hạt silica phát quang bền vững
Phức hợp hạt nano-kháng thé đặc hiệu cĩ thé được tạo ra bởi nhiều cơ chế gắn kết khác nhau Mỗi kiểu gắn kết cĩ những ưu điểm và hạn chế riêng Nhưng nhìn chung, càng nhiều cầu nối trung gian giữa kháng thê và hạt nano chứa tâm màu phát quang càng làm cho phức hợp bền vững hơn và kháng thể khơng mất hoạt tính lâu hơn Sau khi tạo được phức hợp kháng thể đặc hiệu với hạt nano, kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang được sử dụng đề phát hiện và xác định số lượng vi khuẩn đích Cĩ nhiều cách phát hiện vi khuẩn đích như: quan sát và đếm trực tiếp các tế bào vi khuẩn phát quang dưới kính hiển vi huỳnh quang; xác định số lượng vi khuẩn đích bằng đường chuẩn giữa cường độ phát quang của vi khuẩn gắn hạt nano và số lượng vi khuẩn trong dung dịch chuẩn Cường độ phát huỳnh quang là hàm số f của số lượng tế bào vi khuẩn đích trong mẫu
13 KHANG THE
Khang thé là một sản phẩm đặc hiệu được hệ miễn dịch tổng hợp giúp cơ thể tan cơng các tác nhân gây bệnh Các kháng thê là các immunoglobulin (cĩ bản chất glycoprotein), do các tế bào lympho B, các tương bào (biệt hĩa tir lympho B) tong
hợp và tiết ra giúp hệ miễn dịch nhận biết và vơ hiệu hố các tác nhân lạ, chẳng hạn
các vi khuẩn hoặc virus
Kháng thể cĩ cấu trúc hình chữ Y, cĩ hai bộ “cành” gắn vào một “thân” Các
đầu chữ Y được gọi là vùng biến đổi, ở phía đầu các cành chứa các vùng gắn kết
kháng nguyên và thân là một vùng hằng định Các vùng hằng định chứa “lẫy khởi
động” chức năng phản ứng lại kích thích bằng việc gắn kết các phức hệ của tế bào
Trang 33cầu disulfide Kiểu của chuỗi nặng quyết dinh phu dang cua Ig (IgA, IgD, IgG, IgM
và IgE) Mỗi chuỗi cĩ vùng biến đổi và vùng hằng định (vùng khơng biến đổi) Vùng
biến đổi nằm ở đầu amino của chuỗi polypeptide Các vùng siêu biến đổi hoặc vùng quyết định tinh bé trợ được xác định trong vùng biến đơi của cả chuỗi nặng và chuỗi nhẹ Đây là những vùng nhận diện và liên kết đặc hiệu với vùng epitope của kháng nguyên (hay cịn goi 1a paratope) [5] ABD Linker ABD d" (Kỳ Fv ScFv BD "em oe Fab Minibody
Hình 1.7 Cấu trúc chung của một số loại kháng thể [94]
Nghiên cứu dựa trên phản ứng cắt của enzyme đối với immunoglobulin cho
thấy rằng phân tử cĩ thể chia thành hai phần mà vẫn cĩ thể liên kết với kháng
nguyên (được biết như là các mảnh Fab và một phần Fc) mà khơng cần trung tâm hoạt động kết hợp với kháng nguyên [71] Dạng 2 cánh vẫn được hình thành bởi mảnh Fab trong khi gốc là phần Fc Chuỗi nặng và chuỗi nhẹ của Fab cĩ thể kết hợp thành một Fv, vùng chịu trách nhiệm kết hợp với kháng nguyên Mảnh Fab chứa
chuỗi nhẹ hồn chỉnh và một nửa đầu N (Fd) của chuỗi nặng (Hình 1.7) Trong
vùng biến đổi của chuỗi nang (Vy) và chuỗi nhẹ (Vị) cĩ ba vùng siêu biến sẽ được xếp gần nhau trong quá trình cuộn xoắn protein, đây chính là vị trí kết hợp với protein Những vùng siêu biến đổi này được biết như là những vùng quyết định tính
bổ trợ (CDR1, CDR2 và CDR3) Về cơ bản, mỗi gen vùng Vị; được tạo nên từ trình tự dịng gốc Vy, D, Jy va mỗi Vị, được tạo bởi trình tự V hoặc A Về JK hoặc A- SỰ kết hợp khác nhau cĩ thể tạo thành lượng lớn các mảnh bao gồm 300 Vy, 12 D va 4 Jy,
Trang 34thay đổi amino acid và làm đa dạng thêm Do vậy, hệ thống miễn dịch được trang bi nhiều bản copy kháng thể dé đối phĩ với số lượng lớn kháng nguyên trong cuộc đời
1.3.1 Manh khang thé
Các phân tử kháng thể chứa các domain protein riêng biệt mà cĩ thể phân tách bằng protease hoặc được tạo ra nhờ kỹ thuật tái tổ hợp Hai mảnh kháng thể được thiết kế gắn với kháng nguyên- Fab và Fv được tách dịng và bộc lộ trên
phage Mảnh kháng thể lớn hơn- Fab gồm các phần Vụ-Cụ và Vị -C, liên kết với
nhau bằng cầu disulfide, cịn mảnh kháng thể nhỏ hơn-Fv chỉ bao gồm vùng Vụ và Vụ Dạng tái tổ hợp của Fv là mảnh biến đổi đơn chuỗi (scFv) được nối với nhau bằng một đoạn peptide, thường gồm 15 amino acid cĩ trình tự (Gly4Ser)3 va được biểu hiện như một chuỗi polypeptide don Doan peptide néi nay thong giàu Glycine dé tao tính linh hoạt, cũng như giàu Serine va Threonine can cho kha nang hịa tan và cĩ thể kết nối vùng đầu N của Vụ với vùng đầu C của VỊ, hay ngược lại (Hình 1.8) A Single chain Fv-fragment "¬e.ằœ << %w>—COOH Ỡ/ (Hinge) 1 | scFv (30 kDa) [ Vi | oysen Va |
Hình 1.8 Sơ đồ cấu tạo của mảnh kháng thể đơn chuỗi
Protein này giữ lại được tính đặc hiệu của globulin miễn dịch gốc mặc dù đã loại bỏ đi vùng hằng định và đưa thêm vào một đoạn peptide nối Đoạn nối cho phép vùng biến đổi của chuỗi nặng (Vụ) kết hợp với vùng biến đổi của chuỗi nhẹ
(V¡) tạo thành phân tử đơn chuỗi Phân tử tái tổ hợp tạo ra vẫn bảo tồn hoạt tính
nhận biết và liên kết đặc hiệu với kháng nguyên đích [94] Đặc điểm của các mảnh kháng thê khác nhau được tĩm tắt trong bảng l.2
Trang 35
Mảnh Kích thước Số ols wae
khang thé (kDa) paratope were
Vùng Vụ và Vị, nối với nhau bằng một đoạn nối
Sel kêu | | Ginket) dai 13 amino acid
Fv 25 1 Giữa Vụ và Vụ khơng cĩ đoạn nối
¬ Một protein dung hợp ở trạng thái nhị phân
Minibody 80 ? gồm 2 mảnh scFv-CHa
Fab 50 1 Gồm hai chuỗi: Vụ-Cu1 và Vị -CI,
F(ab’)2 100 2 Gồm 2 phân tử Fab ^ z A x : R: V _ IgG 150 2 Phân tử kháng KH mẹ goin 2 chuơi nặng (Vụ Ch1-Ch2-Ch3) và 2 chuỗi nhẹ (Vị -C),)
Khơng giống các mAb thường được tạo ra trong nuơi cấy tế bào động vật cĩ vú, scFv thường được tạo ra trong quá trình nuơi tế bào vi khuân như E coli
1.3.2 Kháng thể tái tổ hợp
Kháng thê tái tổ hợp là thuốc thử cần thiết cho nghiên cứu, chân đốn và điều trị [42] Nhu cầu sử dụng kháng thể trong nghiên cứu khoa học, trong chân đốn và
điều trị bệnh ngày càng lớn, đặc biệt là các kháng thể đặc hiệu cĩ nguồn gốc từ
người, nhưng nguồn kháng thể người thường khĩ kiếm được Vì vậy, phương pháp chung để thu nhận được các kháng thê là từ động vật gây miễn dịch và sau đĩ nhân
tính hĩa dé hạn chế tối đa phản ứng miễn dịch khi sử dụng Phương pháp này đã
được sử dụng trong hơn một thế kỷ nay Kháng thể huyết thanh đầu tiên được tạo ra ở ngựa và kháng trực tiếp lại bệnh bạch cầu
Trang 36này, các nhà khoa học đã sử dụng kỹ thuật gen dé: tạo kháng thê đơn dịng dạng ghép và sản xuất kháng thể cĩ bản chất của người hồn tồn
Kháng thể đơn dịng dạng ghép (Chimeric Monoclonal Antibody) là kháng thể mang vùng biến đổi cĩ nguồn gốc của chuột và vùng hằng định cĩ nguồn gốc của người Kháng thể đơn dịng dạng ghép làm tăng hiệu quả điều trị và giảm hiện tượng HAMA Trên thực tế đã cĩ 5 kháng thể đơn dịng dạng ghép được bán trên
thị trường ở nhiều nước đề điều trị bệnh miễn dịch và ung thư Các kháng thể hồn
tồn cĩ bản chất của người mới được nghiên cứu trong những năm gần đây và đang trong giai đoạn thử nghiệm
Kháng thể đơn dịng được “nhân” hĩa (Humanized monoclonal antibody) 1a kháng thể mang vùng CDR cĩ nguồn gốc từ chuột, phần cịn lại của vùng biến đổi và vùng hằng định cĩ nguồn gốc từ người Những trình tự protein của chuột đã được sửa đổi để tăng sự tương đồng với kháng thể được sản xuất tự nhiên trong người Quá trình nhân hĩa thơng thường được áp dụng để phát triển kháng thể của chính con người (như kháng thể chống ung thư) Quá trình nhân bản là rất cần thiết cho sự phát triển một kháng thể cụ thể khơng liên quan đến hệ thống miễn dịch của người (chẳng hạn như chuột)
Kháng thể đơn dịng khi là kháng thể cĩ vùng biến đổi từ khi và vùng hằng
định từ người
Kháng thê đơn dịng gà: Do sự cách xa nhau trong hệ thống phân loại, nên gà được chọn đề tạo kháng thể đơn dịng kháng lại các protein kháng nguyên cĩ nguồn gốc từ động vật cĩ vú Vì phản ứng miễn dịch đối với các kháng nguyên này nên ở gà xảy ra mạnh hơn ở động vật cĩ vú như chuột, thỏ
1.3.3 Kỹ thuật phage display
Khái niệm cơng nghệ phage display
Trang 37Do hạn chế của quá trình cuộn xoắn protein trong E coli, chi cĩ mảnh kháng thể đơn như scFv, Fab, đAb được sử dụng thường xuyên để tạo kháng thể phage display Để biểu hiện kháng thể trình tự DNA mã hĩa cho các protein quan tâm được gắn vào vị trí xác định trên hệ gen của thực khuẩn thể hình sợi và do đĩ protein mà nĩ mã hĩa được biểu hiện và "biểu lộ" trên bề mặt dưới dạng sản phẩm gắn kết với một trong các loại protein vỏ của thực khuẩn thể Do đĩ, thư viện thực khuẩn thể chứa tới vài tỷ các biến thể được sử dụng thay cho việc sử dụng cơng nghệ gen để tạo ra từng phân tử protein hoặc peptide, sau đĩ biểu hiện, tinh sạch, phân tích từng biến thể khác nhau Hai khám phá quan trọng giúp cho việc phát triển kỹ thuật phage display là: DNA ngoại lai gắn vào gen III (g3) của thực khuẩn thể hình sợi được biểu hiện như một protein dung hợp (fusion protein) và được bộc
lộ trên bề mặt thực khuẩn thể và Sự biểu hiện thành cơng các đoạn kháng thê chức
năng trong khoang gian màng (periplasmic space) của vi khuẩn E col Điều đặc biệt của phage display là sự liên kết kiêu hình của protein hoặc peptide với kiểu gen của nĩ được đĩng gĩi trong cùng một thực khuẩn thể Sau khi sàng lọc và chọn
được các kiểu hình (các phân tử kháng thể tái tổ hợp được bộc lộ trên bề mặt hạt
phage) cĩ ái lực cao đối với kháng nguyên đích, từ đĩ cĩ thể thu nhận được gen mã hĩa cho nĩ
Thư viện kháng thể phage scFv Grifin 1
Trang 38các protein vỏ, phần lớn dùng pIH, với các vị trí giới hạn dé cĩ thể tiếp nhận các trình tự DNA lạ Protein vỏ dung hợp được tổ hợp lại thành các hạt phage, hạt phage được giải phĩng từ các tế bào vi khuẩn và protein hoặc peptide dung hợp được bộc lộ trên bề mặt phage Các epitope quan tâm là đích để các protein lạ biểu hiện trên phage hướng tới và các hạt phage nào sẽ liên kết với epitope sẽ được phân lập, xâm nhiễm lại vào vi khuẩn sinh sơi nảy nở mở rộng quần thể phage chọn lọc
Thư viện Griffin.I là một trong các thư viện bán tổng hợp lớn nhất chứa các mảnh scEv của người do tiến sĩ Heather Griffiths, Trung tâm Cơng nghệ Protein (Centrer for Protein Engineering, Medical Research CouncilCentrerCambridge, UK) cùng các cộng sự tạo ra và lay tén 14 Griffin.1.Thu vién này được xây dựng từ sự tơ hợp các gen V của dịng mầm và các trình tự oligonucleotide tổng hợp mã hĩa cho các CDR ngẫu nhiên Các thư viện bán tổng hợp được xây dựng nhân tạo bằng cách lắp ghép in vitro các trình tự gen V của địng mầm với các CDR tổng hợp ngẫu nhiên, ở đĩ chủ yếu là vùng CDR3 của chuỗi nặng được thay đổi và nối với vùng J để mở rộng thư viện [38] Việc ngẫu nhiên hĩa tất cả các vùng CDR đã được cơng bố [89], thư viện này được cấu tạo bằng cách tách dịng lại vùng biến đổi của chuỗi nặng và chuỗi nhẹ tổng hợp từ thư viện thực khuẩn thể FdDOG-2lox trên vector pHEN2 (phage M13) [98] D6 da dang của thư viện là 1,2.10° dong scFv khac nhau Ung dung của kỹ thuật phage display
Khơng chỉ cĩ các kháng thể được sử dụng trong kỹ thuật phage display, các
đoạn peptide cũng được sử dụng như nguồn cung cấp nguyên liệu cho nghiên cứu
Trang 39Trong lĩnh vực miễn dịch học và y tế, các phân tử peptide và các mảnh protein được
biểu lộ trén phage M13 da tao phản ứng miễn dịch thứ cấp đối với các protein vỏ của
ký sinh trùng và virus [10], [25] Hơn nữa, các thư viện peptide phage display đã trở
thành cơng cụ thiết thực cho việc phát hiện các loại thuốc [65], [91]
Đối với thư viện kháng thể phage display, một trong những ứng dụng mạnh
nhất là phân lập được kháng thẻ tái tổ hợp bằng sàng lọc với kháng nguyên Nhiều
ứng dụng của phage display đã được sử dụng như những nghiên cứu cơ bản trong kỹ thuật kháng thể và sinh học phân tử hay trong cơng nghệ sinh học và lĩnh vực y tế, đặc biệt là trong cơng nghiệp dược phẩm đề nhận diện các thụ thể lạ, xác định sớm các bệnh thơng qua các protein đặc hiệu, tạo các thuốc hướng đích trong điều trị bệnh, tạo kháng thể tái tổ hợp với các protein đích
Kháng thể tái tổ hợp phage display cĩ nhiều ưu điểm hơn so với kháng thể
đơn dịng được tạo ra bởi kỹ thuật hybridoma [22] Trong khi sản xuất kháng thể bằng kỹ thuật hybridoma tốn thời gian thì gen kháng thể cĩ thể được tạo dịng nhanh từ tế bào Iympho B sử dụng cơng nghệ DNA tái tổ hợp Một thư viện kháng thé phage display biéu hiện ở vi khuẩn cĩ thể được sản xuất nhanh và kinh tế Phage display đặc biệt hữu ích trong trường hợp kháng thể đơn dịng khơng thể thu được trong kỹ thuật hybridoma cơ điển, như kháng thể kháng kháng nguyên khơng miễn dịch hoặc kháng nguyên độc tố, ví dụ độc tố Aflatoxin [55] Phage display cịn cĩ tác dụng trong tao dịng và giúp cho kháng thể đơn dịng hybridoma ổn định về mặt di truyền Gen kháng thé phage display c6 thé dé dàng giải trình tự, gây đột biến và sau đĩ biểu hiện để phát hiện những kháng thê bắt cặp cao với kháng nguyên
ScFv cịn được dùng trong phân tích ái lực đặc hiệu với protein đích [41] Microarray scFv được áp dụng đề xác định chi thi sinh học liên quan đến các bệnh
cu thé [18] Chi thi sinh học cĩ thể sử dụng để nhận diện và chẩn đốn bệnh, cịn
Trang 40liên quan đến nguyên nhân gây bệnh cĩ thể được kiểm tra bằng thu vién scFv ScFv đã phân lập chống lại các mục tiêu đích liên quan tới bệnh trong điều trị và chữa bệnh đĩ ScFv cĩ ái lực cao và độ đặc hiệu với protein đích được sử dụng để ức chế chức năng protein đĩ bằng cách phá vỡ cấu trúc bề mặt protein, mối liên quan giữa protein-protein, DNA-protein lam protein mat hoạt tính hoặc tế bào chết
ScFv cũng cĩ vai trị như là cơng cụ chân đốn để xác định các loại thuốc tiềm năng Microarray protein cĩ thể xác định tương tác protein-protein, cac chat nền của enzyme, các phân tử nhỏ hoạt tính sinh học trong các bệnh cụ thể [90] Microarray protein dugc san xuat véi scFv rat hữu ích vi cĩ thé phát hiện số lượng nhỏ protein đích trong hỗn hợp mà khơng thê phát hiện bằng các phương pháp khác được Việc phát hiện sớm các phân tử sinh học cụ thể liên quan đến điều trị một bệnh và sự lây lan của bệnh rất cĩ ý nghĩa trong điều trị Ví dụ, nhiễm nắm ở người suy giảm hệ miễn dịch cĩ thể gây tử vong, tuy nhiên nếu phát hiện sớm cĩ thê điều trị thành cơng [90] Kết quả của phân tích protein cĩ thể nhận biết bằng màu, huỳnh quang, hoặc hĩa chất phát quang Xét nghiệm đo màu sử dụng scFv chứa các scFv cụ thể dính với protein được đánh đấu Ví dụ như phương pháp phát hiện trực tiếp virus dại [59] Tế bào được thử nghiệm cho nhiễm virus bệnh dại cĩ thể được cố định và ủ với một scFv đặc hiệu bệnh dại dung hợp với alkaline phosphatase Phức scFv- alkaline phosphatase thừa được rửa sạch và một chất nền giống alkaline phosphatase như p-nitrophenol phosphate được thêm vào Nếu virus dại cĩ trong các tế bào, nĩ liên kết với phức seEv- alkaline phosphatase Các alkaline phosphatase cắt p-nitrophenol phosphate thành p-nitrophenol và kiểm tra ở bước sĩng 405nm ScFv kết hợp với huỳnh quang cũng được sử dụng tương tự [74] Các hĩa chất phát quang cũng được dùng trong protein array, tuy nhiên, chưa cĩ nghiên cứu nào được báo cáo Cĩ nhiều phương pháp chân đốn bệnh dựa trên các kỹ thuật này Với ưu điểm là rẻ tiền, nhanh và cĩ độ nhạy cao đây là một phương pháp hữu ích trong việc phát hiện sớm bệnh
ScEv kháng lại các protein khác nhau cũng được phân lập và sử dụng trong
điều trị bệnh Khả năng xuyên qua mơ và kết hợp với kháng nguyên đích tốt hơn