Nghiên cứu phát triển kỹ thuật phát hiện chủng vi khuẩn scherichia coli O157 H7 và tạo kháng thể tái tổ hợp đặc hiệu

Header Page of 148 i Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu riêng dƣới hƣớng dẫn PGS TS PGS TS Các số liệu trình bày luận án trung thực Một số kết đƣợc công bố riêng đồng tác giả, phần lại chƣa đƣợc công bố công trình khác Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm số liệu luận án này! Hoàng Phú Hiệp Footer Page of 148 03 năm 2014 Header Page of 148 ii LỜI CẢM ƠN Trước hết xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành sâu sắc tới PGS TS Lê Quang Huấn, PGS TS Nguyễn Bích Nhi hướng dẫn, bảo tận tình từ bước tạo điều kiện thuận lợi để hoàn thành luận án Tôi xin chân thành cảm ơn giúp – thực đề tài luận án Tôi xin cảm ơn Bộ môn Di truyền SHHĐ, Khoa Sinh-KTNN, Trường Đại học Sư phạm, Đại học Thái Nguyên tạo điều kiện giúp đỡ suốt thời gian học tập, nghiên cứu Tôi xin cảm ơn gia đình bạn bè tạo điều kiện động viên suốt trình học tập hoàn thành luận án Tôi xin trân trọng cảm ơn!!! Thái Nguyên, ngày 05 tháng 03 năm 2014 Nghiên cứu sinh Hoàng Phú Hiệp Footer Page of 148 Header Page of 148 iii Trang MỞ ĐẦU 1 Đặt vấn đề Mục tiêu nghiên cứu Nội dung nghiên cứu Chƣơng TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 VI KHUẨN E COLI O157:H7 1.1.1 Đặc điểm chung chủng vi khuẩn E coli O157:H7 1.1.2 Độc tố Shiga-like toxin: Bản chất tác hại 1.1.3 Nguyên nhân diễn biến ngộ độc 11 1.1.4 Tình hình ngộ độc thực phẩm vi khuẩn Việt Nam 13 1.2 CÁC PHƢƠNG PHÁP PHÁT HIỆN VÀ XÁC ĐỊNH VI KHUẨN E COLI O157:H7 14 1.2.1 Phƣơng pháp PCR dựa DNA 14 1.2.2 Kỹ thuật LAMP 18 1.2.3 Sử dụng kháng thể tái tổ hợp phát E coli O157:H7 19 1.3 KHÁNG THỂ 23 1.3.1 Mảnh kháng thể 25 1.3.2 Kháng thể tái tổ hợp 26 1.3.3 Kỹ thuật phage display 27 1.3.4 Tình hình nghiên cứu sử dụng kháng thể Việt Nam 32 Chƣơng VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 35 2.1 Vật liệu nghiên cứu 35 2.1.1 Sinh phẩm 35 Footer Page of 148 Header Page of 148 iv 2.1.2 Hóa chất 35 2.1.3 Các cặp mồi đƣợc sử dụng 36 2.2 Thiết bị 36 2.3 Phƣơng pháp nghiên cứu 37 2.3.1 P ứu DNA 37 2.3.2 Kỹ thuật bộc lộ thực khuẩn thể (phage display) 43 ứu protein 45 2.3.3 2.3.4 Phƣơng pháp phân tích xử lý số liệu 51 Chƣơng KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 52 : 52 3.1 XÁC ĐỊNH VI KHUẨN E COLI O157:H7 BẰNG KỸ THUẬT GEN 52 3.1.1 Xác định chủng vi khuẩn E coli O157:H7 kỹ thuật phân tích gen mã hóa 16S rRNA 52 3.1.2 Sử dụng đoạn gen Stx1 Stx2 để xác định E coli O157:H7 58 3.1.3 Sử dụng kỹ thuật LAMP xác định vi khuẩn E coli O157:H7 63 3.2 NGHIÊN CỨU THU NHẬN KHÁNG THỂ ĐẶC HIỆU ĐỐI VỚI VI KHUẨN E COLI O157:H7 VÀ TÁCH DÒNG XÁC ĐỊNH TRÌNH TỰ GEN MÃ HÓA KHÁNG THỂ 69 3.2.1 Sàng lọc kháng thể từ thƣ viện Griffin.1 70 3.2.2 Chọn dòng phage kháng thể đặc hiệu với vi khuẩn E coli O157: H7 72 3.2.3 Nhân gen mã hóa kháng thể PCR 74 3.2.4 Giải trình tự gen mã hoá kháng thể 75 3.3 TẠO DÒNG VÀ BIỂU HIỆN PROTEIN KHÁNG THỂ TÁI TỔ HỢP 79 3.3.1 79 3.3.2 Thiết kế vector pET28a-TRX biểu gen mã hóa kháng thể 80 Footer Page of 148 Header Page of 148 v 3.3.3 82 3.3.4 ểu gen mã hóa kháng thể 83 3.4 TINH SẠCH VÀ XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH CỦA KHÁNG THỂ TÁI TỔ HỢP 85 3.4.1 85 3.4.2 pháp lai blot 88 3.4.3 Kiểm tra hoạt tính kháng thể tái tổ hợp ELISA 90 3.4.4 ạt nano 91 93 94 95 PHỤ LỤC 108 Footer Page of 148 iv Header Page of 148 vi THUẬT NGỮ VIẾT TẮT STT Ký hiệu Amp bp CDC 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 CDR Cfu ddNTP DNA dNTP E coli EDTA EHEC ELISA EtBr FDA HRP HC HUS IPTG Kana Kb kDa LAMP LB mAb OD PBS PCR PEG rRNA SDS SDS-PAGE STEC TAE TE TEMED v/p VH VL Footer Page of 148 Tên đầy đủ Ampicillin Base pair Centers for Disease Control and Prevention- Trung tâm Kiểm soát Phòng chống Dịch bệnh Mỹ Complementarity Determining Region- Vùng định tính bổ trợ Colony forming unit Dideoxynucleotide Deoxyribonucleic Acid Deoxynucleotide Escherichia coli Ethylene Diamine Tetra acetic Acid Enterohaemorrhagic E coli- E coli gây xuất huyết ruột Enzyme-linked immunosorbent assay Ethidium Bromide Food and Drug Administration Horseradish peroxidase Hemorrhagic Colitis- Viêm đại tràng xuất huyết Hemolytic Uremic Syndrome- Hội chứng dung huyết suy thận Isopropyl--D-Thiogalactopyranoside Kanamycin Kilo base pair Kilo Dalton Loop-mediated Isothermal Amplification Lauria Bertani Monoclonal antibody- kháng thể đơn dòng Optical Density Phosphate buffer saline Polymerase Chain Reaction Polyethylene Glycol Ribosomal RNA Sodium Dodecyl Sulphate SDS- Polyacrylamide gel electrophoresis Shiga-like toxin producing Escherichia coli Tris - Acetate – EDTA Tris – EDTA N, N, N’, N’- Tetramethyl ethylenediamine Vòng/phút Variable heavy - Vùng biến đổi chuỗi nặng Variable light - Vùng biến đổi chuỗi nhẹ Header Page of 148 Số hiệu bảng 1.1 v vii Tên bảng hông số hệ gen vi khuẩn E coli O157:H7 Trang 06 1.2 Đặc điểm mảnh kháng thể 26 2.1 Trình tự cặp mồi sử dụng nghiên cứu 36 2.2 Thành phần phản ứng PCR 39 2.3 Thành phần phản ứng xử lý DNA enzme giới hạn 40 2.4 Thành phần phản ứng nối ghép 40 2.5 Thành phần chu trình nhiệt phản ứng LAMP 42 2.6 Thành phần gel polyacrylamide 46 3.1 3.2 3.3 3.4 Footer Page of 148 Kết so sánh trình tự gen HQ658163 với trình tự gen 16S rRNA từ GenBank Kết so sánh trình tự gen Stx1 với trình tự gen Stx1 từ GenBank Kết so sánh trình tự gen Stx2 với trình tự gen Stx2 từ GenBank Kết phản ứng ELISA xác định độ nhạy kháng thể tái tổ hợp kháng thể chuẩn 56 61 62 90 vi Header Page of 148 viii Số hiệu hình 1.1 Hình ảnh vi khuẩn E coli O157:H7 kính hiển vi điện tử 03 1.2 Hình ảnh vi khuẩn E coli O157:H7 môi trƣờng có MUG 04 1.3 Bản đồ 05 1.4 Cấu trúc độc tố Shiga-like toxin 07 1.5 Nguyên lý gây chết tế bào Shiga-like toxin 08 1.6 Nguyên lý gây bệnh E coli O157:H7 12 1.7 Cấu trúc chung số loại kháng thể 24 1.8 Sơ đồ cấu tạo mảnh kháng thể đơn chuỗi 25 3.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm luận án 52 3.2 Hình ảnh điện di tách DNA tổng số 3.3 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR nhân gen mã hóa 16S rRNA 53 3.4 Hình ảnh điện di kiểm tra kết tách chiết DNA plasmid 54 3.5 Hình ảnh điện di kiểm tra DNA plasmid enzyme giới hạn BamHI 55 Tên hình Trang (genome) vi khuẩn E coli O157:H7 ẩn E coli O157:H7 53 Sơ đồ hình thể mối quan hệ E coli O157:H7 với chủng khác đƣợc xây dựng sở so sánh trình tự gen 16S RNA chủng 3.6 E coli O157:H7 nghiên cứu (mã số HQ658163) chủng khác 57 Ngân hàng Gen Quốc tế 3.7 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR nhân gen Stx1 Stx2 58 3.8 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR nhân gen Stx1 với cặp mồi vector pJET 59 3.9 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR nhân gen Stx2 với cặp mồi vector pJET 60 3.10 Vị trí trình tự cặp mồi FIP/BIP 64 3.11 Hình ảnh điện di tách chiết DNA tổng số 64 3.12 Hình ảnh điện di sản phẩm phản ứng LAMP 65 3.13 Hình ảnh điện di sản phẩm LAMP xác định hàm lƣợng DNA 66 3.14 Sản phẩm LAMP nhuộm 68 SYBR Green I Khả gắn kết hỗn hợp phage thu đƣợc sau vòng sàng lọc 3.15 với dòng tế bào E coli O157:H7 71 Sơ đồ nguyên lý kỹ thuật ELISA dùng xác định lực phage 3.16 3.17 Footer Page of 148 với E coli O157:H7 Kết phản ứng ELISA đánh giá lực hỗn hợp phage vòng 72 73 Header Page of 148 ix sàng lọc Kết đánh giá lực dòng phage 20 với tế bào E coli O157:H7 3.18 74 tế bào E coli ATCC 25922 3.19 Kết điện di sản phẩm PCR dòng 20 với cặp mồi LABF/LABR 75 3.20 Cấu trúc 3D kháng thể tái tổ hợp 77 3.21 Hình ảnh điện di sản phẩ 80 3.22 Thiết kế vector pET28a-TRX biểu gen mã hóa kháng thể 81 -PAGE 3.23 82 3.24 kháng thể tái tổ hợp 83 3.25 Khảo sát nhiệt độ biểu kháng thể tái tổ hợp 84 Hình ảnh điệ 3.26 - kháng thể tái tổ 86 hợp Hình ảnh kết điện di SDS-PAGE trình tinh protein tái tổ 3.27 87 hợp phƣơng pháp Hybrid Hình ảnh điện di kết phản ứng Western blot kháng thể tái tổ hợ 3.28 88 -tag Hình ảnh kết phản ứng Dot blot kháng thể tái tổ hợp với kháng 3.29 3.30 Footer Page of 148 89 thể chuẩn mã số AB75244 (Hãng Abcam) Hình ảnh phức kháng thể- silica bắt tế bào E coli O157:H7 91 Header Page 10 of 148 MỞ ĐẦU Đặt vấn đề Ngộ độc thực phẩm xảy sử dụng thức ăn, nƣớc uống không đƣợc bảo quản cách dẫn đến sản phẩm bị hƣ thối nhiễm khuẩn hóa chất độc hại Các nghiên cứu gần xác định nguyên nhân nhiều trƣờng hợp ngộ độc thức ăn vi khuẩn E coli E coli thuộc nhóm vi khuẩn đƣờng ruột Enterobacteriaceae, có nhiều tự nhiên, ruột ngƣời gia súc Trong đƣờng ruột, chúng diện chủ yếu đại tràng nên đƣợc gọi vi khuẩn đại tràng E coli nhiễm vào đất, nƣớc… từ phân động vật Khi gặp điều kiện thuận lợi cho phát triển chúng gây bệnh Đa số chủng E coli chủng độc hại, nhiên có vài chủng độc nhƣ chủng E coli O157:H7 tìm thấy ruột phân loài gia súc, đặc biệt phân bò, chất thải bò sản phẩm nhƣ thịt bò, sữa bò chƣa khử trùng [49] Các bệnh có liên quan đến E coli tiêu chảy, viêm phổi, viêm đƣờng dẫn tiểu số bệnh khác Triệu chứng bị nhiễm trùng vi khuẩn thƣờng khác nhau, nhƣng nhìn chung, bệnh nhân hay có triệu chứng nhƣ: nôn, đau bụng, sốt, xuất huyết dƣới da, tăng huyết áp, tiêu chảy thƣờng có máu Đại đa số bệnh nhân phục hồi sau đến ngày Vì vi khuẩn E coli phổ biến, nên hàng năm khắp giới có ngƣời mắc bệnh vi khuẩn Các chuyên gia ƣớc tính Mỹ năm có khoảng 70 nghìn ngƣời mắc bệnh liên quan đến E coli O157:H7 [106] Ở Việt Nam, theo thống kê Cục Vệ sinh An toàn Thực phẩm, năm 2010 có 175 vụ ngộ độc với 5664 ngƣời mắc, có 3978 ngƣời phải nhập viện 51 ngƣời tử vong Năm 2011 có 148 vụ ngộ độc, có 4700 ngƣời mắc với 3663 ngƣời phải nhập viện 27 ngƣời tử vong Năm 2012 có 168 vụ ngộ độc, có 5541 ngƣời mắc với 4335 ngƣời nhập viện 34 ngƣời tử vong Nhƣ vậy, ba năm liên tiếp có 491 vụ ngộ độc với 112 ngƣời tử vong Trong năm 2013 nƣớc ta xảy nhiều vụ ngộ độc nghiêm trọng tháng cuối năm Số liệu thống kê quý III năm 2013 cho thấy, 40 vụ ngộ độc thực phẩm 23 vụ vi sinh vật gây Chủng vi khuẩn E coli O157:H7 đƣợc xác định lần Việt Nam Footer Page 10 of 148 Header Page 114 of 148 88 105 Smith G.P., Schultz D.A and Ladbury J.E (1993), "A ribonuclease Speptide antagonist discovered with a bacteriophage display library", Gene, 128(1), pp 37-42 89 Sorderlind E., Vergeles M and Borrebaeck C A (1995), "Domain libraries: synthetic diversity for the novo design of antibody V- regions.", Gene, 160(2), pp 269- 272 90 Steinhauer C., Wingren C., Hager A C and Borrebaeck C A (2002), "Single framework recombinant antibody fragments designed for protein chip applications", Biotechniques, Suppl, pp 38-45 91 Sulochana K N and Ge R (2007), "Developing antiangiogenic peptide drugs for angiogenesis-related diseases", Curr Pharm Des., 13(20), pp 2074-2086 92 Tan Duc Nguyen, Thin Thanh Vo and Hung Vu-Khac (2011), "Virulence factors in Escherichia coli isolated from calves with diarrhea in Vietnam", J Vet Sci., 12(2), pp 159- 164 93 Tjandra J J., Ramadi L and McKenzie I F (1990), "Development of human anti-murine antibody (HAMA) response in patients", Immunol Cell Biol., 68 ( Pt 6), pp 367-376 94 Tordsson J M., Ohlsson L G., Abrahmsén L B., Karlström P J., Lando P A and Brodin T N (2000), "Phage-selected primate antibodies fused to superantigens for immunotherapy of malignant melanoma", Cancer Immunol Immunother, 48(12), pp 691-702 95 Tornetta M., Fisher D., O'Neil K., Geng D., Schantz A., Brigham-Burke M., Lombardo D., Fink D., Knight D., Sweet R and Tsui P (2007), "Isolation of human anti-idiotypic antibodies by phage display for clinical immune response assays", J Immunol Methods, 328(1-2), pp 34-44 96 Wang F., Jiang L and Ge B (2011), "Loop-mediated Isothermal Amplification Assays for Detecting Shiga Toxin-producing Escherichia coli in Ground Beef and Human Stools", J Clin Microbiol., 50(1), pp 91- 97 Footer Page 114 of 148 Header Page 115 of 148 97 106 Weisburg W G., Barns S M., Pelletier D A and Lane D J (1991), "16S ribosomal DNA amplification for phylogenetic study", J Bacteriol., 173(2), pp 697-703 98 Winter G., Griffiths A D., Hawkins R E and Hoogenboom H R (1994), "Making antibodies by phage display technology", Annu Rev Immunol., 12, pp 433- 455 99 Woo P C., Lau S K., Teng J L., Tse H and Yuen K Y (2008), "Then and now: use of 16S rDNA gene sequencing for bacterial identification and discovery of novel bacteria in clinical microbiology laboratories", Clin Microbiol Infect., 14(10), pp 908-934 100 Zhang W., Bielaszewska M., Kuczius T and Karch H (2002), "Identification, characterization, and distribution of a Shiga toxin gen variant (stx(1c) in Escherichia coli strains isolated from humans", J Clin Microbiol., 40(4), pp 1441-1446 TÀI LIỆU INTERNET 101 abbott (2006), Annual report, http://www.abbott.com/static/content/microsite/annual_report/2006/humira.h tml, ngày 20/9/2010 102 Bộ Y tế (2011), Chiến lƣợc quốc gia an toàn thực phẩm giai đoạn 201120120 tầm nhìn 2030 (Dự thảo 9), http://www.chinhphu.vn/portal/page/portal/chinhphu/congdan/DuThaoVanB an?_piref135_27935_135_27927_27927.mode=detail&_piref135_27935_13 5_27927_27927.id=532, ngày 23/12/2013 103 Feng P., Weagant S.D and Jinneman K (2011), BAM: Diarrheagenic Escherichia coli, http://www.fda.gov/Food/FoodScienceResearch/LaboratoryMethods/ucm070 080.htm, ngày 09/09/2012 104 Gwartney A (2011), Escherichia coli showing flagella, http://www.microbeworld.org/component/jlibrary/?view=article&id=6731, ngày 05/11/2010 Footer Page 115 of 148 Header Page 116 of 148 105 107 Henahan S (2011), Bad Burger Bacteria Genome, http://www.accessexcellence.org/WN/SUA14/ecoli2001.php, ngày 05/11/2010 106 Schneider K.R., Schneider R.G., Hubbard M.A and Chang A (2013), Preventing Foodborne Illness: E coli O157:H7, http://edis.ifas.ufl.edu/fs097, ngày 05/11/2013 Footer Page 116 of 148 Header Page 117 of 148 108 PHỤ LỤC Phụ lục 16S rRNA-F: Footer Page 117 of 148 Header Page 118 of 148 109 Phụ lục 2: 16S rRNA-R: Footer Page 118 of 148 Header Page 119 of 148 Footer Page 119 of 148 110 Header Page 120 of 148 111 Phụ lục 3: So sánh trình tự chủng E coli O157:H7 mã số HQ658163 với chủng chủng E coli O157:H7 mã số AB035923 >>EM_PRO:AB035923; AB035923 Escherichia coli O157:H7 yrd (6560 nt) initn: 7419 init1: 7419 opt: 7419 Z-score: 4641.5 bits: 873.6 E(): banded Smith-Waterman score: 7419; 99.4% identity (99.4% similar) in 1500 nt overlap (1-1500:998-2497) 10 Sequen 20 30 AGAGTTTGATCCTGGCTCAGATTGAACGCT ::::::::::: :::::::::::::::::: EM_PRO AATTCTTTGAGCATCAAACTTTTAAATTGAAGAGTTTGATCATGGCTCAGATTGAACGCT 970 980 40 990 50 1000 60 1010 70 1020 80 90 Sequen GGCGGCAGGCCTAACACATGCAAGTCGAACGGTAACAGGAAGAAGCTTGCTTCTTTGCTG :::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::: EM_PRO GGCGGCAGGCCTAACACATGCAAGTCGAACGGTAACAGGAAGAAGCTTGCTTCTTTGCTG 1030 1040 100 1050 110 1060 120 1070 130 1080 140 150 Sequen ACGAGTGGCGGACGGGTGAGTAATGTCTGGGAAACTGCCTGATGGAGAGGGATAACTACT :::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::: EM_PRO ACGAGTGGCGGACGGGTGAGTAATGTCTGGGAAACTGCCTGATGGAGAGGGATAACTACT 1090 1100 160 1110 170 1120 180 1130 190 1140 200 210 Sequen GGAAACGGTAGCTAATACCGCATAACGTCGCAAGACCAAAGAGGGGGACCTTCGGGCCTC :::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::: EM_PRO GGAAACGGTAGCTAATACCGCATAACGTCGCAAGACCAAAGAGGGGGACCTTCGGGCCTC 1150 1160 220 1170 230 1180 240 1190 250 1200 260 270 Sequen TTGCCATCGGATGTGCCCAGATGGGATTAGCTAGTAGGTGGGGTAACGGCTCACCTAGGC :::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::: EM_PRO TTGCCATCGGATGTGCCCAGATGGGATTAGCTAGTAGGTGGGGTAACGGCTCACCTAGGC 1210 1220 280 1230 290 1240 300 1250 310 1260 320 330 Sequen GACGATCCCTAGCTGGTCTGAGAGGATGACCAGCCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAG :::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::: EM_PRO GACGATCCCTAGCTGGTCTGAGAGGATGACCAGCCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAG 1270 1280 340 Footer Page 120 of 148 1290 350 1300 360 1310 370 1320 380 390 Header Page 121 of 148 112 Sequen ACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCCA :::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::: EM_PRO ACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCCA 1330 1340 400 1350 410 1360 420 1370 430 1380 440 450 Sequen TGCCGCGTGTATGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGTACTTTCAGCGGGGAGGAAGGGAG :::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::: EM_PRO TGCCGCGTGTATGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGTACTTTCAGCGGGGAGGAAGGGAG 1390 1400 460 1410 470 1420 480 1430 490 1440 500 510 Sequen TAAAGTTAATACCTTTGCTCATTGACGTTACCCGCAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTG :::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::: EM_PRO TAAAGTTAATACCTTTGCTCATTGACGTTACCCGCAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTG 1450 1460 520 1470 530 1480 540 1490 550 1500 560 570 Sequen CCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCG :::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::: EM_PRO CCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCG 1510 1520 580 1530 590 1540 600 1550 610 1560 620 630 Sequen CACGCAGGCGGTTTGTTAAGTCAGATGTGAAATCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATC :::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::: EM_PRO CACGCAGGCGGTTTGTTAAGTCAGATGTGAAATCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATC 1570 1580 640 1590 650 1600 660 1610 670 1620 680 690 Sequen TGATACTGGCAAGCTTGAGTCTCGTAGAGGGGGGTAGAATTCCAGGTGTAGCGGTGAAAT :::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::: EM_PRO TGATACTGGCAAGCTTGAGTCTCGTAGAGGGGGGTAGAATTCCAGGTGTAGCGGTGAAAT 1630 1640 700 1650 710 1660 720 1670 730 1680 740 750 Sequen GCGTAGAGATCTGGAAGAATACCGGTGGCGAAGGCGGCCCCCTGGACGAAGACTGACGCT ::::::::::::::: :::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::: EM_PRO GCGTAGAGATCTGGAGGAATACCGGTGGCGAAGGCGGCCCCCTGGACGAAGACTGACGCT 1690 1700 760 1710 770 1720 780 1730 790 1740 800 810 Sequen CAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAAC :::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::: EM_PRO CAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAAC 1750 1760 820 Footer Page 121 of 148 1770 830 1780 840 1790 850 1800 860 870 Header Page 122 of 148 113 Sequen GATGTCGACTTGGAGGTTGTGCCCTTGAGGCGTGGCTTCCGGAGCTAACGCGTTAAGTCG :::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::: EM_PRO GATGTCGACTTGGAGGTTGTGCCCTTGAGGCGTGGCTTCCGGAGCTAACGCGTTAAGTCG 1810 1820 880 1830 890 1840 900 1850 910 1860 920 930 Sequen ACCGCCTGAGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACA :::::::: ::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::: EM_PRO ACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACA 1870 1880 940 1890 950 1900 960 1910 970 1920 980 990 Sequen AGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTGGTCTTGACAT :::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::: EM_PRO AGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTGGTCTTGACAT 1930 1940 1000 1950 1010 1960 1020 1970 1030 1980 1040 1050 Sequen CCACAGAACTTTCCAGAGATGGATTGGTGCCTTCGGGAACTGTGAGACAGGTGCTGCATG :::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::: EM_PRO CCACAGAACTTTCCAGAGATGGATTGGTGCCTTCGGGAACTGTGAGACAGGTGCTGCATG 1990 2000 1060 2010 1070 2020 1080 2030 1090 2040 1100 1110 Sequen GCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAAATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTA :::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::: EM_PRO GCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAAATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTA 2050 2060 1120 2070 1130 2080 1140 2090 1150 2100 1160 1170 Sequen TCCTTTGTTGCCAGCGGTCCGGCCGGGAACTCAAAGGAGACTGCCAGTGATAAACTGGAG :::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::: EM_PRO TCCTTTGTTGCCAGCGGTCCGGCCGGGAACTCAAAGGAGACTGCCAGTGATAAACTGGAG 2110 2120 1180 2130 1190 2140 1200 2150 1210 2160 1220 1230 Sequen GAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCGTCATGGCCCTTACGACCAGGGCTACACACGTGCTAC ::::::::::::::::::::::: :::::::::::::::::::::::::::::::::::: EM_PRO GAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGACCAGGGCTACACACGTGCTAC 2170 2180 1240 2190 1250 2200 1260 2210 1270 2220 1280 1290 Sequen AATGGCGCATACAAAGAGAAGCGACCTCGCGAGAGCAAGCGGACCTCATAAAGTGGGTGG ::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::: :: : EM_PRO AATGGCGCATACAAAGAGAAGCGACCTCGCGAGAGCAAGCGGACCTCATAAAGTGCGTCG 2230 2240 1300 2250 1310 2260 1320 2270 1330 2280 1340 1350 Sequen TAGTCCGGATTGGAGTCTGCAACTCGGCTCCATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGTGGA Footer Page 122 of 148 Header Page 123 of 148 114 :::::::::::::::::::::::::: ::::::::::::::::::::::::::::::::: EM_PRO TAGTCCGGATTGGAGTCTGCAACTCGACTCCATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGTGGA 2290 2300 1360 2310 1370 2320 1380 2330 1390 2340 1400 1410 Sequen TCAGAATGCCACGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGG :::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::: EM_PRO TCAGAATGCCACGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGG 2350 2360 1420 2370 1430 2380 1440 2390 1450 2400 1460 1470 Sequen AGTGGGTTGCAAAGGAAGTAGGTAGCTTAACCTTCGGGAGGGCGCTTACCACTTTGTGAT ::::::::::::: :::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::: EM_PRO AGTGGGTTGCAAAAGAAGTAGGTAGCTTAACCTTCGGGAGGGCGCTTACCACTTTGTGAT 2410 2420 1480 2430 1490 2440 1500 Sequen TCATGACTGGGGGGAAGTCGTAACAAGGTA :::::::::::: ::::::::::::::::: EM_PRO TCATGACTGGGGTGAAGTCGTAACAAGGTA Footer Page 123 of 148 2450 2460 Header Page 124 of 148 115 Phụ lục 4: Stx1: Footer Page 124 of 148 Header Page 125 of 148 116 Phụ lục 5: Stx2 Footer Page 125 of 148 Header Page 126 of 148 117 Phụ lục 6: gen mã hóa đoạn kháng thể: Footer Page 126 of 148 Header Page 127 of 148 118 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN ESCHERICHIA COLI - 2014 Footer Page 127 of 148 Header Page 128 of 148 119 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN ESCHERICHIA COLI : 62 42 01 21 : PGS - 2014 Footer Page 128 of 148 ... coli O157: H7 chƣa đƣợc nghiên cứu Chính vậy, lựa chọn đề tài: Nghiên cứu phát triển kỹ thuật phát chủng vi khuẩn Escherichia coli O157: H7 tạo kháng thể tái tổ hợp đặc hiệu Mục tiêu nghiên cứu Nghiên. .. nghiên cứu Nghiên cứu kỹ thuật phát chủng vi khuẩn E coli O157: H7 tạo kháng thể tái tổ hợp đặc hiệu với E coli O157: H7 Nội dung nghiên cứu (i) Xác định chủng E coli O157: H7 kỹ thuật di truyền:... (3) Kỹ thuật LAMP (ii) Tạo dòng gen mã hóa cho kháng thể đặc hiệu chủng vi khuẩn E coli O157: H7 kỹ thuật phage display; (iii) Thu nhận kháng thể tái tổ hợp đặc hiệu vi khuẩn E coli O157: H7; (iv)