Nghiên cứu phát hiện vi khuẩn lao kháng đa thuốc bằng kỹ thuật sinh học phân tử

M Đ U B nhălaoăvƠăviăkhu nălaoăMycobacterium tuberculosisăđưăđ ợcăbi tărõăt ăm tă th ăkỷănay.ăHi nănayătỷăl ănhi mălaoăđ ợcă ́cătínhălƠă1/γădơnăs ăth ăgíi,ăkho ngă9ătri uăng iămắcălaoăm

Ng uy n Văn B c

NGHIÊN C U PHÁT HI N VI KHU N LAO KHÁNG ĐA

THU C B NG K THU T SINH H C PHÂN T

LU NăVĔNăTHẠCăSƾăKHOAăH C

Nguy n Văn B c

NGHIÊN C U PHÁT HI N VI KHU N LAO KHÁNG ĐA

THU C B NG K THU T SINH H C PHÂN T

Chuyên ngành: Sinh h c th cănghi m Mưăs : 60 42 30

LU NăVĔNăTHẠCăSƾăKHOAăH C

Lời cảm ơn!

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Nghiêm Ngọc Minh, Trưởng

p hòng Công nghệ sinh học Môi trường, Viện Công nghệ Sinh học – người thầy đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo, dìu dắt, giúp đỡ tôi trong thời gian thực tập và hoàn thành khóa luận này

Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Nguyễn Thái Sơn Học viện Quân y cùng tập thể cán bộ phòng Công nghệ sinh học Môi trường, Viện Công nghệ

S inh học đã nhiệt tình giúp đỡ, truyền đạt kinh nghiệm quý báu cho tôi trong suốt thời gian thực tập và hoàn thành khóa luận

Qua đây, tôi cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành tới các thầy cô giáo trong khoa Sinh học và các thầy cô giáo trong bộ môn Sinh lý Thực vật và Hóa sinh, trường Đại học KHTN đã hướng dẫn, truyền đạt kiến thức cho tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu

Cuối cùng, tôi xin dành cho những người thân trong gia đình và bạn bè lòng biết ơn sâu sắc, những người thân yêu đã luôn bên tôi, động viên và góp ý cho tôi trong suốt quá trình học tập và hoàn thành khóa luận

Hà Nội, tháng 12 năm 2010 Học viên

Nguyễn Văn Bắc

: Deoxyribonucleotide Triphosphate : Extensively drugăresitantă(Kh́ngăthu căm̉ăr ng) : Ethambutol

:ăBaălọiăthu căisoniazid,ărifampicin,ăstreptomycin : B nălọiăthu căisoniazid,ărifampicin,ăstreptomycin và ethambutol : Isoniazid

: Isopropyl-thio- -D-galactoside : Kilo base

: Luria - Bertani :ăMultidrugsăresistantă(Kh́ngăđaăthu c) : Paraminosalicylic acid

: Pyrazinamid : Polymerase Chain Reaction : Rifampicin

: Acid Ribonucleic : Rifampin resistance determiningăregionă(Vùngăquy tăđ nhăkh́ngărifampicin)

: Thermus aquaticus DNA polymerase

:ăT̉ăch́căYăt ăTh ăgíi :ăVolumeă(thểătích) : 5-bromo-4-chloro-3-indolyl- -D-galactopyranoside

M C L C

M Đ U 1

Ch ng 1 ậ T NG QUAN 3

1.1.ăB NHăLAO 3

1.2 TÌNH HÌNH LAO KHÁNGăTHU C 3

1.γ.ăVIăKHU NăLAO 5

1.3.1 C u t o 5

1.3.2 C ch gơy b nh 8

1.3.3 Đặc điểm h gen 9

1.4.ăC ăCH ăKHÁNGăTHU Că ăVIăKHU NăLAO 9

1.4.1 Kháng sinh trong điều tr lao 9

1.4.2 Nguyên nhơn gơy kháng thu c 10

1.4.3 Rifampicin vƠ c ch kháng 12

1.4.4 Isoniazid vƠ c ch kháng 15

1.5.ăCÁCăPH NGăPHÁPăCH NăĐOÁNăLAOăKHÁNGăTHU C 16

1.5.1 Đặc điểm lơm sƠng vƠ các xét nghi m c n lơm sƠng 16

1.5.2 Xác đ nh kiểu hình 18

1.5.3 Xác đ nh kiểu gen 18

1.5.4 K thu t real-time PCR và multiplex real-time PCR 19

Ch ng 2 ậ V T LI U VẨ PH NG PHÁP NGHIÊN C U 23

β.1.ăV TăLI UăNGHIÊNăC U 23

2.1.1 Đ i t ng nghiên c u 23

2.1.2 V t li u thi t b vƠ ḍng c̣ nghiên c u 23

2.1.3 Các cặp m i dùng trong nghiên c u 24

β.β.ăPH NGăPHÁPăNGHIÊNăC U 25

2.2.1 S đ nghiên c u 25

2.2.2 PCR nhơn đo n gen đích 26

2.2.3 T o dòng gen 27

2.2.4 Multiplex real-time PCR 28

Ch ng 3 ậ K T QU VẨ TH O LU N 30

γ.1.ăK TăQU ăTÁCHăDọNGăVẨăGI IăTRÌNHăT 30

3.1.1 K t qủ nhơn gen katG và rpoB t̀ DNA tách t̀ vi khu n lao 30

3.1.2 K t qủ tách dòng gen 31

3.1.3 K t qủ phơn tích trình t gen katG 34

3.1.4 K t qủ phơn tích trình t gen rpoB 36

γ.β.ăT Iă UăHịAăPH Nă NGăMULTIPLEXăREAL-TIMEăPCRăPHÁTăHI Nă NHANHăVIăKHU NăLAOăKHÁNGăTHU C 41

3.2.1 Thi t k các primer và probe cho ph̉n ng multiplex real-time PCR 41 3.2.2 K t qủ t i u thƠnh ph n vƠ chu trình ph̉n ng multiplex real-time PCR phát hi n đột bi n liên quan kháng thu c 44

K T LU N 60

KI N NGH 61

TẨI LI U THAM KH O 62

PH L C 69

M Đ U

B nhălaoăvƠăviăkhu nălaoă(Mycobacterium tuberculosis)ăđưăđ ợcăbi tărõăt ăm tă

th ăkỷănay.ăHi nănayătỷăl ănhi mălaoăđ ợcă ́cătínhălƠă1/γădơnăs ăth ăgíi,ăkho ngă9ătri uăng iămắcălaoăḿiăvƠăh năγătri uăng iăch tădoălaoăm iănĕm.ăB nhălaoăđangătr̉ănênă nghiêmă tr ngă h nă v́iă s ă xuấtă hi nă ćcăch ngă laoă kh́ngă đaă thu că (Multi-Drugs Resistant - MDR),ăt́călƠăthểălaoăv́iăviăkhu năkh́ngăítănhấtăhaiălọiăthu căch ngălaoăṃnhănhấtălƠăisoniazidă(INH)ăvƠărifampicină(RMP).ăTheoăs ăli uăth ngăkêăc aăch ngătr̀nhăch ngălaoăQu căgiaănĕmăβ007,ăth ăgíiăcóăkho ngă511.000ătr ngăhợpănhi mălaoăkh́ngă đaă thu c,ă trongă đóă cóă h nă 1γ0.000ă tr ngă hợpă tửă vong.ă Doă nh ngă khóă khĕnătrongăvi căđiềuătr ănh ngăb nhănhơnămangăćcăch ngălaoăkh́ngăthu căph̉ăr ngăvƠăđaăkh́ngămƠăvi căph́tăhi năśmăćcăch ngălaoăkh́ngăđaăthu căs ătr̉ănênărấtăquanătr ngătrongăđiềuătr ăb nhălao

Hi nănayănhiềuăn iăch năđónăviăkhu nălaoăkh́ngăthu căv năd aăvƠoăph ngăph́pănuôiăcấyăviăkhu năvƠălƠmăkh́ngăsinhăđ ălƠăch ăy u,ătuyănhiên,ăvi cắngăd ngăsinhă

h căphơnătửăcũngăđangăṭoăraănh ngăđ tăph́ătrongăph́tăhi năviăkhu nălaoăkh́ngăthu c.ă

C ăch ăkh́ngăthu cẳăviăkhu nălaoălƠădoătrongăqúătr̀nhăti năhóa,ăcóănhiềuăđ tăbi nă

xuấtăhi nătrongăm tăs ăgenăch́cănĕng,ătr ́căh tălƠẳăgenărpoB và katG.ăTh iăgianăch nă

đónăcóăthểărútăngắnăchỉăcònăvƠiăngƠy,ăv́iăđ ănḥyăvƠăđ ăđặcăhi uăcao,ăṭoăđiềuăki năchoăkiểmăsótăb nhălaoăd ădƠngăh n.ăĆcănghiênăćuăvềăsinhăh căphơnătửătrongăch năđónălaoăkh́ngăthu căđưăchỉăraărằngăm iălọiăkh́ngăthu călƠădoăxuấtăhi năćcăđ tăbi nătrênăgenăt ngắngăch uătŕchănhi m.ăChínhăv̀ăv yăvi căx́căđ nhăćcătr ngăhợpănhi mălaoăkh́ngăthu căth ngăđiăkèmăv́iănh ngăch năđónăph́tăhi năđ tăbi năgenăđ iăv́iăćcă

ch ngălaoăph́tăhi năđ ợc.ăĆcăch ngăvi khu nălaoăkh́ngăisoniazidălƠădoăcóăliênăquană

t́iăđ tăbi năṭiăcodon 315 trên gen katG,ăđ iăv́iăćcăch ngăkh́ng rifampicinădoăxuấtă

hi năcác đ tăbi nẳăm t vùng nóng g măβ7ăcodonănằmăg nătrungătơmăc aăgenărpoB

Xuấtăph́tăt ănh ngălỦădoătrên,ăchúngătôiăti n hƠnhăđềătƠi:ă“Nghiên cứu phát hiện vi khuẩn lao kháng đa thuốc bằng kỹ thuật sinh học phân tử”

V́iă m că tiêuă nghiênă ću: phát hiện nhanh các chủng vi khuẩn lao kháng thuốc thông qua xác định các vị trí đột biến liên quan kháng thuốc trên gen katG và

Đểăđ̣tăđ ợc m cătiêuăc aăđềătƠi,ăchúngătôiăti năhƠnh m tăs ăn iădungănghiênăćuănh ăsau:

1 X́căđ nhătr̀nhăt ăgenărpoB và katG

2 Phân tích đặcăđiểmăphơnătửăc aăćcăch ngăviăkhu nălaoăkh́ngăthu c phân

l păṭiăVi tăNam trênăc ăs̉ătr̀nhăt ănucleotideăc aăhaiăgenărpoB và katG

3 T iă uăhóaăthƠnhăph năvƠăchuătr̀nh b ăkit multiplex real-time PCR phát

hi nănhanhăviăkhu nălaoăkh́ngăthu c

Ch ng 1 ậ T NG QUAN

1.1.ăB NHăLAO

Lao (Tuberculosis) là m tăb nhătruyềnănhi măṃn tính,ălƠăt̀nhătṛngănhi măviă

khu nă Mycobacterium tuberculosis,ă th ngă gặpă nhấtă ̉ă ph̉iă nh ngă cũngă cóă thểă nhă

h ̉ngăđ năh ăth năkinhătrungă ngă(laoămƠngănưo),ăh ăḅchăhuy t,ăh ătu năhoƠnă(laoăkê),ăx ngăvƠăkh́p.ăB nhălaoăgắnăliềnăv́iăs ăph́tătriểnăc aăxưăh iăloƠiăng iăt ăhƠngăngƠnănĕmănay,ătrênăth ăgíiăch aăbaoăgi ăvƠăkhôngăm tăqu căgiaănƠo,ăm tăkhuăv cănƠo,ă

m tădơnăt cănƠoăkhôngăcóăng iămắcăvƠăch tăv̀ăb nhălao.ăTr căkhu nălaoăl năđ uătiênă

đ ợcăb́căsƿăRobertăKochăđưăph́tăhi năvƠo ngày 24/3/1882 Trongăth iăgianănƠyẳăMỹă

vƠăchơuăÂu,ăćă7ăng iăth̀ăcóă1ăng iăch tăv̀ălao,ădoăv y,ăph́tăhi năc aăRobertăKochălƠă

m tăb ́căngoặtăquanătr ngătrongăvi căkh ngăch ăvƠălọiătr ăcĕnăb nhănƠy.ăTr ́căđơy,ălaoăđ ợcăxemălƠăm tătrongănh ngăcĕnăb nhătruyềnănhi mănguyăhiểmănhấtătrênăth ăgíi,ă

l uăhƠnhăv́iătỷăl ămắcăb nhăkh́ăcao,ăđặcăbi tẳăćcăn ́căthu căchơuăPhiăvƠăkhuăv căchơuăÁ,ătrongăđóăcóăVi tăNam

Vi tăNamăđ́ngăth́ă12 trongăββăn ́căcóăs ăb nhănhơnălaoăcaoătrênătoƠnăc u.ăTrongă khuă v că Tơyă Th́iă B̀nhă D ng,ă Vi tă Namă đ́ngă th́ă baă sauă Trungă Qu că vƠăPhilippinesăvềăs ăb nhănhơnălao,ăcũngănh ăs ăb nhănhơnălaoăxuấtăhi năhằngănĕm.ăHi nănayănguyăc ănhi mălaoẳăn ́cătaăhằngănĕmăđ ợcă ́cătínhălƠă1,5%ădơnăs ă(̉ăćcătỉnhăphíaăNamălƠăβ%,ẳăćcătỉnhăphíaăBắcălƠă1%).ăTrênăth căt ăchỉăs ănguyăc ănhi mălaoăhƠngănĕmăcóăthểăcaoăh nă1,5%,ănh ăv y,ăćcăconăs ănêuătrênăcònăcóăthểăĺnăh n.ăĐiềuăđóăs ătĕngăthêmăs ăkhóăkhĕnăđ iăv́iăcôngăt́căphòngăch ngălaoăkhôngănh ngătrongăćcănĕmăt́iămƠăcóăthểătrongăth iăgianăkh́ădƠi,ăcóăthể đ năhƠngăch cănĕm,ăngayăc ăkhiẳăthiênăniênăkỷăḿiă[3, 35]

1.β.ăTÌNHăHÌNHăLAOăKHÁNGăTHU C

B nhălaoăngƠyăcƠngătr̉ănênăph́căṭpăvƠăcóă nhăh ̉ngănặngănềăkhiăxuấtăhi năthêmăviăkhu nălaoăkh́ngăthu căṭoănênăm tăḍngăb nhăkhóăphòngăch ng.ăĆcăch ngă

lao kháng thu căđ ợcăchiaălƠmăhaiăthể,ăđóălƠălaoăkh́ngăđaăthu că(Multi-drugs resistant

- MDR)ăvƠălaoăkh́ngăthu căph̉ăr ngă(Extensively drug resistant - XDR),ănh ngăch ngăviăkhu nălaoăkh́ngăthu cănƠyălƠăngu nălơyănhi măvƠălƠăm iăđeăd aăchoăścăkh eăc aă

c ngăđ ng.ăTheo ́cătínhăc aăT̉ăch́căYăt ăth ăgíiă(WHO),ătrênăth ăgíiăcóăkho ngă4βăṿnăng iămắcălaoăkh́ngăđaăthu c,ăchi măs ăl ợngăĺnănhấtălƠẳăkhuăv căTơyăTh́iăB̀nhăD ngăcóă15ăṿnătr ngăhợp,ăk ăđ nălƠăkhuăv căĐôngăNamăÁăvƠăsauăđóălƠăkhuă

v căChơuăPhiăvƠăĐôngăÂu.ăM tăs ăch ngălaoăv aăkh́ngăđaăthu căv aăkh́ngăthu căph̉ă

r ng,ăcóăthểăcoiălƠălọiăsiêuăkh́ngăthu c [17].ăT̀nhăh̀nhălaoăsiêuă kh́ngăthu căcũngă

ngƠyăcƠngătr̉ănênătr mătr ng,ădoăv yăt ăth́ngă11/β004ăđ nă11/β005,ăWHOăvƠăTrungătơmăKiểmăsótăB nhăHoaăKỳăđưăphơnătích 17.890ăm uăđ măgửiăt ă40ăqu căgiaătrênătoƠnă

th ăgíi,ăvƠăthấyărằngăcóăβ0%ătr ngăhợpălƠăkh́ngăđaăthu căvƠăβ%ătr ngăhợpălƠăkh́ngăthu căph̉ăr ng.ă ăVi tăNam,ătheoănghiênăćuăc aăCh ngătr̀nh Ch ngălaoăQu căgiaăthì có 32,5%ăćcătr ngăhợpăb nhălaoăḿiămangăviăkhu nălaoăkh́ngăthu că[1, 3]

Viăkhu nălaoăkh́ngăthu călƠăm tăth́chăth́căĺn,ăđeăd aăcôngăcu căphòngăch ngălaoătrênătoƠnăc u,ăv̀ăćcăthu căch ngălaoăcóăhi uăqu ăhi nănayăđangăb ăviăkhu nălaoăkh́ngăḷiănhấtălƠăkh́ngăđaăthu că[10].ăThu căch ngălaoăcóănhiềuălọi,ăt́căd ngăc aăm iăthu cătrênătr căkhu nălaoăkhôngăgi ngănhau.ăHi nănayăng iătaăchiaăthu căch ngălaoăthƠnhăhaiălọi:ă(1)ăćcăthu căch ngălaoăch ăy uă(cònăg iălƠăćcăthu căch ngălaoălọiă

m t,ăthu căch ngălaoăhƠngăđ u),ă(β)ăćcăthu căch ngălaoăth́ăy u (cònăg iălƠăćcăthu că

ch ngălaoălọiăhai,ăthu căch ngălaoăhƠngăth́ăhai).ăTrongăkhiăćcăthu căch ngălaoălọiă

m tălƠănh ngăthu căcóăhi uăqu ănhấtăvƠăcũngăítăđ cătínhănhất,ăth̀ăćcăthu căch ngălaoăhƠngăth́ăhaiălƠănh ngăthu căcóăt́căd ngăkémăh năḷiăcóăđ cătínhăcaoăvƠăgíăthƠnhărấtăđắt.ă ăNewăYork,ăchiăphíăđiềuătr ăb nhănhơnănḥyăv́iăthu căchỉămấtăβ.000ăUSDătrongăkhiăđóăđiềuătr ăb nhănhơnăkh́ngăthu căh tăβ50.000ăUSD.ăHi nănayăs ătửăvongăhƠngănĕmădoălaoătrênăth ăgíiăcònăĺnăh năs ătửăvongădoăHIV,ăs tărétăvƠăćcăb nhănhi tăđ́iă

c ngăḷi.ăT̉ăch́căYăt ăTh ăgíiăđưănh năđ nhăb nhălaoăhi nănayăđưăquayătr̉ăḷiăvƠătr̉ă

Thu căkh́ngăsinhăđ uătiênădùngăđểăđiềuătr ălaoălƠăstreptomycin,ănh ngăvƠiănĕmăsau khi kháng sinh nƠyăđ ợcăsửăd ngăth̀ăng iătaăđưănh năthấyăhi năt ợngăđềăkh́ngăḷiăstreptomycinăc aăviăkhu nălao.ăSauăđóăćcăkh́ngăsinhăch ngălaoăkh́căti păt căraăđ i:ăpara ậ aminosalysilic,ăisoniazid,ărifampicinănh ngăđềuăkhôngămangăḷiăhi uăqu ăsauă

m tăth iăgianăđiềuătr ănhấtăđ nhă[7].ăNghiênăćuăt̀măki măhóăd ợcăḿiăcóăhi uăqu ăđiềuătr ălao,ăđặcăbi tălƠălaoăkh́ngăthu căluônăluônăđ ợcăth căhi năvƠăcƠngăngƠyăcƠngăcóănhiềuăhợpăchấtăch ngălaoăḿiăđ ợcăđ aăvƠoăsửăd ng,ăvíăd ,ăg năđơyălƠălinezolidă[43].ăTuyănhiên,ătheoăc ăch ăvƠắpăl c,ăviăkhu năkhôngăng ngăbi năđ̉iăṭoănênănhiềuă

ch ngăḿiăh năcóăkh ănĕngăkh́ngăthu cănhanhăchóngăh nă [52].ăKh ănĕngăđiềuătr ăthƠnhăcôngăcóăthểăđ̣tă95-100%ăđ iăv́iănh ngăb nhănhơnămắcălaoăthôngăth ng,ătrongăkhiătỷăl ăthƠnhăcôngăv́iăb nhănhơnămắc laoăkh́ngăthu căchỉălƠăβ0ăậ γ0%,ăth măchíăcònăkhôngăđiềuătr ăđ ợcăkhiămắcălaoăkh́ngăđaăthu căvƠăkh́ngăthu căph̉ăr ngămặcădùăđưădùngăk tăhợpăđ nănĕmălọiăkh́ngăsinhăđiềuătr ălao.ăV̀ăv y,ăvi căph́tăhi năvƠăngĕnăchặnăs ălanătruyềnăćcăch ngălaoăkh́ngăđaăthu călƠăvấnăđềăquanătr ngănhấtătrongăđiềuă

tr ălaoăhi nănayă[7, 10, 35]

1.γ.ăVIăKHU NăLAO

1.3.1 C u t o

Tr căkhu nălaoăcóăḍngăh̀nhăque,ăthơnăm nhădẻ,ăkhôngăcóănhaăbƠo,ăkíchăth ́căβă

- γăµm,ădƠyă0,γăµm,ăkh́ngăc n,ăkh́ngăacid (hình 1.1).ăKhiăđ ợcănhu măbằngăph ngăpháp Ziehl - Neelsen,ătr căkhu nălaoăbắtămƠuăđ ăth m,ădoăkhôngăb ăc năvƠăacidălƠmămấtă mƠuă carbonfuchsin.ă ă môiă tr ngă nuôiă cấyă cóă đ ă acidă đ mă đặcă nhấtă đ nh,ă tr căkhu nălaoăv năph́tătriểnăđ ợc,ăv̀ăv y,ăchúngăđ ợcăg iălƠătr căkhu năkh́ngăc n,ăkh́ngătoan (acid fast bacilli - AFB),ă đơyă lƠă đặcă điểmă n̉iă b tă c aă viă khu nă thu că chiămycobacteria.ăĐặcăđiểmănƠyărấtăquanătr ngăđểăph́tăhi nătr căkhu nălaoăbằngăph ngăph́păh̀nhăth́iăh că(nhu mămƠu)ătrongăćcăm uăb nhăph m.ăM tăs ăgi ăthi tăchoărằngă

ḿcăkh́ngăacidălƠădoăđ ădƠiăc aăćcăchu iămycolicăacid.ăM tuberculosis cóăkh ănĕngă

thểăhi nătấtăc ăćcăc ăch ăc năthi tăđểăt̉ngăhợpăćcăvitamin,ăaminoăacidăvƠăćcăenzymeăcofactorăthi tăy uăc aăt ăbƠo.ăMycobacteriaăcóăcấuătrúcăg năgi ngăv́iăviăkhu năGramă

d ngănh ngăchúng khôngăđ ợcăx păvƠoălọiăviăkhu năGramăd ngădoăćcăphơnătửăgắnăv́iă thƠnhă t ă bƠoă lƠă lipidă ch́ă khôngă ph iă proteină hayă polysaccharide.ă Doă đó,ă chúngăkhôngăgi ăḷiătinhăthểămƠuătímăxuấtăhi nătrongănhu măGramă[2, 5, 37, 38]

Tr căkhu nălaoărấtăhi uăkhí,ăph́tătriểnăt tănhấtẳăγ7oCăvƠăd ́iắpăsuấtăc aăO2 là 100ămmHg.ăĐỉnhăph̉iăvƠăvùngăph̉iăd ́iăx ngăđònăth ngăhayămắcălaoănhấtăv̀ăcóắpăsuấtăO2 t ă1β0ăậ 1γ0ămmHgă(khiăđ́ng)ăr iăđ năthơnăx ngăvƠăđ uăx ngăv̀ắpăsuấtăO2

̉ăđơyălƠă100ămmHg.ăĹch,ăgan,ăḍădƠy,ăth căqu năítămắcălaoăh năv̀ắpăsuấtăO2thấp

Tr căkhu nălaoăsinhăs nărấtăch m,ăćăβ0ăgi ăḿiăcóăm tăl năphơnăchiaăt ăbƠo,ă

trongăđiềuăki năphòngăthíănghi măth̀ăćă1βăđ năβ4ăgi ăM tuberculosis phơnăchiaăm tă

l nă trênă môiă tr ngă nuôiă cấyă giƠuă dinhă d ỡngă Loewensteină [46].ă T că đ ă ph́tă triểnă

ch măcóăthểălƠădoătínhăth măthấuăc aăthƠnhăt ăbƠoăḥnăch ătrongăvi căhấpăth ăchấtădinhă

d ỡngăvƠăliênăquanăđ năt căđ ăt̉ngăhợpăribosomeă(H̀nhă1.2)

Tr căkhu nălaoăcóăcấuăṭoărấtăph́căṭp,ăhoƠnăh oămƠăítăviăsinhăv tănƠoăcóăđ ợc.ă

D ́iăkínhăhiểnăviăđi nătửătr căkhu nălaoăcóăcấuăṭoăchínhănh ăsau (hình 1.3):

- ĹpătrongăcùngăcóăcấuătrúcămƠng,ăcóăthƠnhăph năch ăy uălƠăćcăphospholipidă

g măβănhóm:ănhómă aăn ́căh ́ngăvƠoăbênătrong,ănhómăkỵăn ́căquayăraăngoƠi.ăCấuătrúc nàyăṭoănênămƠngăsinhăh căcóăt́căd ngăgiúpătr căkhu năđiềuăhòaăs ăth măthấuăc aă

v ăngoƠiătr căkhu n,ămƠngăcònăch́aăćcăproteinăch́cănĕngăkh́cănh ăćcăproteinătruyềnătínăhi uăđ năb ăḿyătraoăđ̉iăchấtăvƠădiătruyềnătrongănguyênăsinhăchất,ăćcăenzymeăliênăquanăđ năqúătr̀nhătraoăđ̉iăchấtăvƠăsinhănĕngăl ợng,ăćcăchấtămangălƠmătrungăgianăchoăqúătr̀nhăv năchuyểnăćcăchấtădinhăd ỡngăvƠăćcăion.ăĆcăenzymeăxuyênămƠngăvƠăt̉ngăhợpămƠng,ăṭoăthƠnhăv́chăngĕnătrongăphơnăchiaăt ăbƠo,ăt păhợpăvƠăti tăm tăs ăenzymeăngọiăbƠo, sao chép DNA [2, 4, 37, 38]

- Ĺpăti pătheoălƠăpeptidoglucanăliênăk tăv́iăđ ngăarabinoseăvƠăćcăphơnătửămycolicăacidăṭoănênăm tăb ăkhungăđ nhăh̀nhăchoăviăkhu năđ măb oăchoăviăkhu năcóă

đ ăćngănhấtăđ nh.ăThƠnhăt ăbƠoăc aămycobacteria lƠăcấuătrúcăph́căṭpănhấtăđ ợcăbi tă

̉ăprokaryote,ăcóăm tăs ăthƠnhăph năhóaăh căvƠăliênăk tăchéoăbấtăth ng,ăḿcăđ ăliênă

k tăgi aăpeptidoglucanẳăthƠnhăt ăbƠoăM tuberculosis là 70 - 80%ătrongăkhiẳăviăkhu nă

E coli là 20 - 30% [38]

- ĹpăngoƠiăđ ợcăṭoănênăb̉iăs ăliênăk tăgi aăćcămycolicăacidăvƠăćcăchấtăph́căṭp,ăđơyălƠăĺpăṭoănênăđ cătínhăc aăviăkhu nălaoăvƠăcóăcấuătrúcăph́căṭpălƠmătĕngăkh ănĕngăch ngăthấmăn ́căc aăthƠnhăt ăbƠoăviăkhu năgiúpătr căkhu năt năṭiălơuăv́iămôiătr ngăbênăngoƠi,ăch ngăkh ănĕngăb ăh yădi tăb̉i đ̣iăth căbƠoăvƠăćcăt ăbƠoămi năd chă[38]

- Ĺpăv ăngoƠiăcùngăcóăvaiătròărấtăquanătr ng,ăcóăcấuătrúcăpeptidoglyolipid.ăNóăđ măb oăchoăs ăt năṭiăc aătr căkhu n,ălƠmăchoătr căkhu năbềnăv ngăv́iăhi nă

t ợngăth căbƠo,ăgiúpăb oăv ăkh iắpăsuấtăth măthấuănênă khiăvƠoăc ăthểătr căkhu năkhóăbiătiêuădi t

Hình 1.3 C u t o thƠnh t bƠo c a M tuberculosis

(http://www3.niaid.nih.gov/topics/tuberculosis/Research/basicResearch/biology cell.htm)

1.3.2 C ch gơy b nh

Viă khu nă laoă cóă thểă xơmă nh pă vƠoă c ă thểă quaă nhiềuă conă đ ngă kh́că nhau:ă

th ngălƠăđ ngăhôăhấp,ăhoặcăcóăthểăquaăđ ngătiêuăhóa,ăda,ăk tăṃcămắt.ăSauăkhiăgơyăt̉năth ngătiênăph́t,ăviăkhu nălaoăcóăthểătheoăđ ngăḅchăhuy tăhoặcăđ ngăḿuăđểă

đ năgơyăt̉năth ngăth́ăph́tẳăćcăc ăquanăkh́c:ăPh̉i,ăth n,ămƠngănưo,ăx ng,ăḥchă

nh ngăth ngăb ăh năc ălƠăđỉnhăph̉i,ăn iăcóắpăsuấtăoxyălƠă1β0ămmHgăv̀ăđơyălƠăđiềuă

ki năhọtăđ ngăt tăchoăviăkhu nălao.ăĐ căl căc aăviăkhu nălaoăcóăliênăquanăđ nă“Cord

factor”ă(trehaloseă- 6,6’- dimycolate)ălƠăchấtăgơyắcăch ăhọtăđ ngăc aăt ăbƠoăḅchăc u,ă

gơyănênănh ngăuăḥtăṃn tính [7]

Khiăviăkhu nălaoăxơmănh păvƠoăc ăthể,ătrongăc ăthểăxuấtăhi năđ́pắngămi năd chăquaătrungăgianăt ăbƠo.ăLúcănƠy,ăđ̣iăth căbƠo,ăćcăt ăbƠoălymphoăT,ălymphoăBăvƠăćcănguyênăbƠoăsợiăk tăt păḷiăṭoăćcăuăḥt,ăv́iăćcăt ăbƠoălymphoăvơyăquanhăđ̣iăth căbƠo.ă

Ch́cănĕngăc aăćcăuăḥtăkhôngăchỉăngĕnăc năs ălanăt aăc aăt ăbƠo M tuberculosis mà

cònăṭoămôiătr ngăṭiăch ăchoăćcăt ăbƠoăc aăh ămi năd chătraoăđ̉iăthôngătină[23] Bên

th căbƠoăkhi năchúngădi tăkhu năt tăh n.ăT ăbƠoălymphoăTăcũngătiêuădi tătr căti păćcă

t ăbƠoăb ănhi m.ăNh ngăđiềuăquanătr ngălƠăviăkhu năkhôngăb ăuăḥtălọiătr ăhoƠnătoƠnămƠătr̉ănênăbấtăhọtăṭoăḍngănhi măkhu nă“tiềmă n”ă(latentătuberculosis)ă[18]

1.3.3 Đặc điểm h gen

ToƠnăb ăh ăgenăc aăviăkhu nălaoăM tuberculosis ch ngăHγ7Rvăđ ợcăgi iătr̀nhă

t ,ă phơnă tích vƠă côngă b ă nĕmă 1998ă g m 4.411.5β9ă bp,ă v́iă đặcă tínhă lƠă ch́aă nhiềuăguanineăvƠăcystosineă(Gă+ăCăkho ngă65ă%).ăTrênă90%ătr̀nhăt ăđ ợcăd ăđónălƠăcóămưăhóaă choă proteină vƠă chỉă cóă 6ă genă gi ă (pseudogeneă - gen không mang thông tin di truyềnămưăhóaăchoăprotein)ă[28, 38, 44].ăD ăli uăh ăgenăc aăm tăs ăviăkhu năthu căchiă

Mycobacterium ,ătr ́căh tălƠăc aăviăkhu nălaoă(M tuberculosis)ăvƠăviăkhu n phong (M leprae) có t măquanătr ngăđặcăbi tătrongănghiênăćuăđặcăđiểmăsinhăh căphơnătửă

h ătrợăd chăt ăh c,ădiătruyềnăh căvƠănghiênăćuăkh́ngăthu c,ăs ăli uăđưăđ ợcăl uăgi ăṭiăm tăs ătrungătơmăvƠăcóăthểăsửăd ngăm tăs ăch ngătr̀nhăđểătruyăc păkh́măph́ăvƠăsửăd ngă[11, 53]

1.4.ăC ăCH ăKHÁNGăTHU C ăVIăKHU NăLAO

1.4.1 Kháng sinh trong điều tr lao

Thu căch ngălaoăcóănhiềuălọi,ăvƠăt́căd ngăc aăchúngălênătr căkhu nălaoăcũngăkhôngăgi ngănhau.ăHi nănayăng iătaăchiaăthu căch ngălaoălƠmăhaiălọi:ă(1)ăĆcăthu că

ch ngălaoăch ăy u:ăg mănĕmăthu căch ăy uăđóălƠ:ăisoniazidă(INH),ărifampicină(RMP),ăethambutol (EMB), pyrazinamid (PZA), streptomycină(SM).ăĐơyălƠănh ngăthu căkh́ngălaoăhi uăqu ăvƠăcũngăítăđ cătínhănhất.ă(β)ăĆcăthu căch ngălaoăth́ăy u:ălƠănh ngăthu că

ch ngălaoăcóăt́căd ngăkémăh năvƠăcóăđ cătínhăcao,ăkhôngăđ ợcădùngătrongăph́căđ ăđiềuătr ălaoănh ngăḷiăđ ợcădùngătrongăćcătr ngăhợpăđiềuătr ăthấtăḅiădoăviăkhu nălaoăkh́ngă ḷiă ćcă lọiă thu că ch ngă laoă lọiă m t.ă Ćcă thu că nƠyă g mă có:ă ethionamide,ăprothionamide, paraminosalysilic acid (PAS), cycloserine, kanamycin, capreomycin, thiacetazone, ofloxacin, các quinoloneầ

Ćcă thu că isoniazid,ă cycloserine,ă kanamycină cóă t́că d ngă ́că ch ă t̉ngă v́chă t ăbƠo.ăĆcăthu căstreptomycin,ăkanamycin,ă capreomycinăcóăt́căd ngắcăch ăt̉ngăhợpăprotein.ăĆcăthu cărifampicinăvƠăethambutolăcóăt́căd ngắcăch ăs ăt̉ngăhợpănucleicăacid.ăThu căparaminosalicylicăacidăcóăt́căd ngăch ngăchuyểnăhóaă[7, 35, 37, 38]

1.4.2 Nguyên nhơn gơy kháng thu c

Viăkhu nălaoăkh́ngăthu călƠăkhiăchúngăkhôngăch uăs ăt́căđ ngăc aăćcălọiăkh́ngăsinhă dùngă điềuă tr ă chúng.ă Th ngă nóiă t́iă viă khu nă laoă kh́ngă thu că lƠă nóiă t́iă nh ngă

tr ngă hợpă viă khu nă laoă kh́ngă v́iă m tă trongă nh ngă thu că ch ngă laoă dòngă th́ă nhất:ăisoniazid,ărifampicin,ăpyrazinamide,ăethambutolăhoặcăstreptomycină[7, 35]

Tínhăkh́ngăthu căbaoăg măch ăy uăγănguyênănhơnăchính:

- Thu căhoặcăćcăgenăđíchăb ălƠmăbi năđ̉iătrongăćcăch ng kh́ngăthu cădoăđó ćcăthu căkhôngăcònăt́căd ngăn aătrongăvi cătiêuădi tăviăkhu n

- S năph măc aăgen,ămƠăhọtătínhăc aănóăb ắcăch ăb̉iăthu căđ ợcăviăkhu nă

s năxuấtăth aăra,ădoăđóăl ợngăthu cămƠăb nhănhơnău ngăvƠoăkhôngăđ ăđểắcă

ch ăhoƠnătoƠnăviăkhu nălao

- Nh ngăthayăđ̉iăx y raẳăḿcăđ ăphơnătửăvƠăc ăch ăxơmănh păc aăthu căvƠoăbênătrongăt ăbƠoăviăkhu nălƠmăchoăn ngăđ ăthu căbênătrongăt ăbƠoăkhôngăđ̣tăt́iăn ngăđ ăt iăthiểuăcóăkh ănĕngăgi tăch tăviăkhu năgơyăb nh

Hi năt ợngăkh́ngăthu căc aăviăkhu nălaoăcóăthể x yăraătr ́căkhiăxơmănh pă(tiênăph́t)ăhoặcăsauăkhiănh păvƠoăc ăthểăng iăb nhă(th́ăph́t).ăViăkhu nălaoăkh́ngăthu cătiênăph́tălƠăhi năt ợngălơyănhi măb̉iăm tăch ngăđưăkh́ngăthu cămƠăviăkhu nănƠyăđưăcóăs ăđềăkh́ngăt ănhiên.ăV̀ăv y,ăb nhănhơnămắcălaoădoăs ălơyănhi mănƠy,ăngayăt ăđ uăviăkhu nălaoăxơmănh păvƠoăc ăthểăđưăcóăs ăđềăkh́ngăv́iăthu căđangăsửăd ng.ăCònăhi năt ợngăkh́ngăthu căth́ăph́tăx yăraăđ iăv́iăćcăch ngăviăkhu nălaoẳăb nhănhơnănƠoăđóădùngă

thu căch ngălaoăkhôngăđúngăquyăđ nh,ăkhôngăđúngăliềuăl ợng,ăth iăgianăsửăd ngăthu c

doăđóăđưăch năl căviăkhu nălaoăkhangăthu că[1, 38]

Ćcăch ngăviălaoăkh́ngăthu căđ ợcăchiaălƠmăhaiălọi:ă(1)ăĆcăch ngălaoăkh́ngăđaăthu că(MDRăậ TB):ăLƠătr ngăhợpăkhiăćcăch ngăviăkhu nălaoăkh́ngăđ ngăth iăhaiăthu că ch ngă laoă ṃnhă nhấtă hi nă nayă lƠă isoniazidă vƠă rifampicin.ă (β)ă Ćcă ch ngă laoăkh́ngăthu căph̉ăr ngă(XDRăậ TB):ăLƠătr ngăhợpăkhiăviăkhu nălaoăđưẳăt̀nhătṛngăkh́ngă đaă thu că vƠă cóă thêmă tínhă kh́ngă m tă trongă baă lọiă thu că ch ngă laoă lƠăcapreomycin, kanamycin, amikacin [49]

NgƠyănayăkhiănghiênăćuăvềăsinhăh căphơnătử,ăng iătaăđưăx́căđ nhăđ ợcăc ăch ăkh́ngăḷiănhiềuălọiăkh́ngăsinhăcóăliênăquanăđ năćcăgenăt ngắng.ăTrong hình 1.4 mô

t ăćcăc ăch ăphơnătửăc aăhi năt ợngăkh́ngăđaăthu cẳăviăkhu nălao.ăTrongăđó, kháng isoniazid đ ợcă choă lƠă liênă quană đ nă ćcă gen:ă KatG, inhA, aphC và kasA Kháng

streptomycin cóăthểălƠădoăđ tăbi nẳăgenărpsL Kháng pyrazinamid cóăthểăliênăquanăđ nă

gen pncA Kh́ngăquinoloneăcóăthểăliênăquanăt́iăgenăgyrA Kháng rifampicin đ ợcăx́că

đ nhălƠăliênăquanăđ năđ tăbi nẳăvùngăg nălõiăc aăgenărpoB,ăgenămưăhóaătiểuăph nă ăc aă

RNA polymerase [7, 25] Trong lu năvĕn này, chúng tôi t pătrungănghiênăćuăc ăch ăkh́ngăđaăthu c,ăt́călƠătr ng hợpăviăkhu nălaoăkh́ngăđ ngăth iăhaiăthu căch ngălaoăṃnhănhấtăhi nănayălƠăisoniazid và rifampicin,ăđiềuăđóăđ ngănghƿaăv́iăvi cănghiênăćuăcác đ tăbi nătrên gen rpoB v́iăkatG

Hình 1.4 C ch kháng đa thu c c a vi khu n lao

(http://www3.niaid.nih.gov/topics/tuberculosis)

1.4.3 Rifampicin vƠ c ch kháng

Rifampicin tênă khoaă h că lƠă γă ậ[[(4 ậ methyl ậ 1 ậ pipeainyl) imino] methyl] (hình 1.5A) Rifampicină lƠă d nă xuấtă b́nă t̉ngă hợpă t ă rifampicină B,ă m tă kh́ngă sinhă

đ ợcă chi tă xuấtă t ă nấmă Streptomyces mediterranei, là thu că cóă họtă tínhă di tă khu nă

ṃnh,ăti tăkhu n,ăthu cădi tăviăkhu nălaoătrongăvƠăngoƠiăt ăbƠo.ăRifampicinăkhôngăcóă

hi nă t ợngă kh́ngă thu că chéoă v́iă ćcă lọiă thu că ch aă laoă kh́c.ă N ngă đ ă ́că ch ă t iă

thiểuă(minimum inhibitory concentration - MIC)ăđ iăv́iăviăkhu n là 5 - 200 ng/ml (in

vitro).ăĐơyălƠăthu cắcăch ăRNAăpolymeraseăṃnhănhấtă[29, 48]

Hình 1.5 Công th c c u t o c a rifampicin (A) vƠ isoniazid (B) [48]

C ăch ăt́căđ ngăc aărifampicinăliênă quanăđ năkh ănĕngắcăch ăhọtăđ ngă

c aăRNAăpolymerase.ăEnzymeănƠyălƠăm tăph́căhợpăoligomerăg măb nătiểuăđ nă

v ăkh́cănhauă(α,ă ,ă ’,ăω),ăvƠăđ ợcămưăhóaăt ngắngăb̉iăćcăgenărpoA,ărpoB,ărpoC, rpoD [7, 20]

Khi rifampicin gắnăv́iătiểuăđ năv ă ăc aăRNAăpolymeraseă(rpoB),ălƠmắcăch ăćcăhọtăđ ngăsaoăchépăṭoăraăćcămRNAăc aăviăkhu nălaoăvƠădoăđóălƠmăng ngătr ăćcăhọtăđ ngăs ngăc aăviăkhu nălao.ăĐơyălƠăc ăch ăc ăch ăt́căd ngăc aăRMPăđ iăv́iăviăkhu nălao (hình 1.6)

Hình 1.6 C u trúc tinh thể liên k t gi a rifampicin và RNA polymerase [20]

Gen rpoB cóăkíchăth ́căγ519ăbp,ămưăhóaăchoătiểuăph nă ăc aăRNAăpolymeraseă(Tuberculosis,ăβ007).ăNh ngăđ tăbi năkh́ngăkh́ngăsinhărifampicinăth ngăx yăraătrênă

đọnăgenărpoB,ănhấtălƠăđọnănằmăg nătrungătơmăc aăgenădƠiă81ăbp đ ợcăgíiăḥnăt ăb ă

baă507ăđ nă5γγ,ăng iătaăg iăđơyălƠăvùngă“nóng”ăậ “hot-spotăregion”ă(hình 1.7).ăĐ tă

bi nẳăb ăbaăth́ă5β6,ă516,ă5γ1,ăchoăk tăqu ăđềăkh́ngăv́iărifampicinăcao;ăđ tăbi nẳăb ă

ba 510, 515 vƠă51βăth̀ăchoăkh ănĕngăkh́ngărifampicinẳăḿcăđ ăthấpăh nă[47].ăĐọn nucleotide c aăvùngănóngăg m:ă

507-GGC ACC AGC CAG CTG AGC CAA TTC ATG GAC CAG AAC AAC CCG CTG TCG GGC TTG ACC CAC AAG CGC CGA CTG TCG CGC CTG-533

M iănucleotideătrênăđọnănƠyăcóăthểăb ăthayăth ,ăhónăđ̉iăv ătrí,ămấtăđi,ăthêmăvƠoăđểăṭoăraăćcăđ tăbi năđ ợcăthểăhi nătrên hình 1.7 nh ăsau:ă[41]

Hình 1.7 Trình t nucleotide vƠ các v trí có kh̉ năng x̉y ra đột bi n trên đo n ắnóngẰ

c a gen rpoB [41]

- Khiăx yăraăđ tăbi năg năvùngălõiăc aăgenărpoB s ălƠmăthayăđ̉iăcấuătrúcătiểuă

ph nă ăc aăRNAăpolymeraseămƠănóămưăhóaănênălƠmăchoăkh ănĕngăk tăhợpăc aăRMPăv́iătiểuăph nănƠyăgi măđi.ăK tăqu ălƠăt́căd ngăc aărifampicin đ iăv́iăviăkhu nălaoăgi mă

hoặcămấtăđi.ăNh ăv yăđ tăbi nătrênăvùngăgenănƠyăc aărpoB đưălƠmăchoăviăkhu nălaoătr̉

nênăkh́ngăthu căv́iărifampicin

- 90 - 95ă%ăćcăch ngăM tuberculosis kháng rifampicin đ ợcăx́căđ nhălƠădoăćcă

đ tăbi nătrênăvùngăgenănóng 81ăbpănƠyăc aărpoB.ăNh ăv yăcònă5ă- 10ă%ăćcăch ngăviă khu nălaoăkhôngăcóăđ tăbi nătrênăvùngănƠyăc aăgen rpoB.ăĐiềuănƠyăchoăthấyăc năph iăx́că

đ nhăthêmănh ngăđ tăbi năkh́cătrênăgenănƠyăhoặcănh ngăgenăkh́căcóăliênăquanăđểăx́căđ nhăchínhăx́căvƠătoƠnăb ăc ăch ăkh́ngărifampicin c aăviăkhu nălao [19, 37]

1.4.4 Isoniazid vƠ c ch kháng

Isoniazidăcóătênăkhoaăh călƠăisonicotinylhydrazine (INH) (hình 1.5B), là thu că

ch ngă laoă đặcă hi uă cao,ă cóă t́că d ngă ch ngă ḷiă M tuberculosis vƠă ćcă lọiă

Mycobacterium khôngăđiểnăh̀nhăkh́cănh ăM bovis, M kansasii.ăIsoniazidădi tăkhu nă

ph ăthu căvƠoăn ngăđ ăthu cẳăv ătríăt̉năth ngăvƠăḿcăđ ănḥyăc măc aăviăkhu n.ăC ă

ch ăt́căd ngăc aăisoniazidăcóăliênăquanăt́iăs ăh̀nhăthƠnhăph́căh NADHă vƠă nh ă đưă tr̀nhă bƠyă ̉ă trênă chúngă ́că ch ă s ă t̉ngă hợpă acidă mycolică c nă choăthƠnhăt ăbƠoăviăkhu nălao

ăacylăisonicotinic-Gen katG cóă kíchă th ́că βββγă bp mã hóa catalase ậ peroxidase Enzyme này họtăhóaăINHăbằngăćchăk tăhợpăacylăisonicotinicăv́iăNADHăđểăṭoăthƠnhăph́căh ăacylăisonicotinic-NADH.ăPh́căh ănƠyăliênăk tăchặtăch ăv́iăketoenoylreductaseă(mưăhóaăb̉iă

gen InhA),ătheoăđóălƠmăngĕnăc năs ăh̀nhăthƠnhăc ăchấtăenoyl-AcpMăvƠăhọtăđ ngăt̉ngăhợpăacidăbéo.ăQúătr̀nhănƠyălƠmắcăch ăs ăt̉ngăhợpăacidămycolicăc năchoăthƠnhăt ăbƠoăviăkhu nălao.ă

Hình 1.8 C ch kháng INH vi khu n lao

(http://www.rcsb.org/pdb/explore/images.do?structureId=2CCA)

C ă ch ă phơnă tửă c aă tínhă kh́ngă INHă ch ă y uă cóă liênă quană t́iă đ tă bi nă thêmăđọn/mấtăđọnăhoặcăćcăđ tăbi nănh mănghƿa/vôănghƿa,ă trongăđóăch ăy uădi năraăṭiăcodon 315 (Ser  Thr)ăc aăgenăkatG mã hóa catalase peroxidase [26] N uăcóăs ăbi nă ḍngăhayăđ tăbi nẳăbaseăth́ăβăṭiăcodonăγ15ăc aăgenăkatG (AGCăbi năđ̉iăthƠnhăACCă

hayăACA)ăs ăd năđ nălƠmăgi măhoặcămấtăhoƠnătoƠnăhọtătínhăc aăcatalaseăperoxidase,ă

doăđóăM tuberculosis s ătr̉ăthƠnhăkh́ngăthu căINH (hình 1.8) [14].ăDoăđóăph́tăhi năs ă thayă đ̉iă diă truyềnă nƠyă trongă genă katG cóă thểă cungă cấpă m tă ph ngă ph́p sƠngă l că nhanhăvƠăchínhăx́căchoăvi căph́tăhi năćcăch ngăM tuberculosis kháng isoniazid

1.5.1 Đặc điểm lơm sƠng và các xét nghi m c n lơm sƠng

Nh̀năchungăćcădấuăhi uălơmăsƠngăc aăb nhălaoăcóăviăkhu năkh́ngăthu căkhôngăkh́cănhiềuăv́iăb nhălaoămƠăviăkhu nănḥyăc măv́iăthu c

Tr ngăhợpănhi măviăkhu nălaoăkh́ngăthu cătiênăph́tăcóăthểăcóătri uăch́ngăcấpătính h n,ăs tăcaoăh n

Đ iăv́iăkh́ngăthu cămắcăph iăph năĺnăgặpẳănh ngăb nhănhơnălaoăṃn tính,

đ ợcăđiềuătr ăítănhấtăβăl n.ăNh ngăb nhănhơnănƠyăcũngăchi mătỷăl ăch ăy uătrongăs ă

b nhănhơnălaoăkh́ngăđaăthu c.ăH uăh tăb nhălaoăkh́ngăđaăthu căb nhăti nătriển,ăhay gặpădòăph ăqu năậ mƠngăph̉iămƠăđiềuătr ăgặpănhiềuăkhóăkhĕn [7]

*) Xét nghiệm lâm sàng

- Phản ứng Tuberculin:ăth ngăth̀ăph nắngădaẳănh ngăb nhănhơnăkh́ngăthu cătiênă

ph́tăcóăḿcăđ ăṃnhăh năsoăv́iănh ngăb nhănhơnăcóăviăkhu nănḥyăc măv́iăthu c.ă

Đ iăv́i kh́ngăthu cămắcăph i,ăđặcăbi tălƠăkh́ngăđaăthu cẳăb nhănhơnăđ ngănhi măHIVă(+)ăth̀ătỷăl ăph nắngănƠyăơmătínhăkh́ăcao

- H̀nhă nhăXăQuang:ăkhiăch păph̉iăthẳng,ăk tăqu ăchoăthấyăh̀nhă nhăvềăb nhălaoăph̉iă gi aă tr ngă hợpă laoă kh́ngă thu că tiênă ph́tă v́iă tr ngă hợpă nḥyă c mă v́iăthu căkhôngăcóăs ăkh́căbi t.ăNh ngănh ngătr ngăhợpăkh́ngăthu cămắcăph iăth̀ăgặpănhiềuălƠăthểăx ăhang,ădi nătíchăph̉iăt̉năth ngănhiềuăh năvƠăcóănhiềuăhang,ăkíchăth ́căc aăhangăĺnăh n

- Xét nghiệm vi khuẩn:

+ăVềăh̀nhăthể:ăćcăviăkhu n b̀nhăth ngăcóăcấuăṭoăthƠnhăt ăbƠoăγăĺpănh ngẳăviăkhu năkh́ngăthu căthƠnhăt ăbƠoăcóăcấuăṭpă4ăĺpă(viăkhu năcóăthêm m tăĺpăpeptidoglycolipidẳăngoƠiăcùng).ăViăkhu năkh́ngăv́iărifampicinăcóăthƠnhăt ăbƠoă cũngă dƠyă h nă hẳnă soă v́iă viă khu nă nḥyă v́iă thu c.ă Khu nă ḷcă c aă viăkhu năkh́ngăthu căcóăthểăkhôngăđiểnăh̀nhăkhiănuôiăcấy,ăm căcằnăc iă[7] +ăVềăs ăl ợngăviăkhu năkhiăsoiăkínhăvƠănuôiăcấy:ănh ngăb nhănhơnăkh́ngăthu căth́ăph́tăcóăs ăl ợngăviăkhu năkhiăsoiăkínhăcaoăh nănhiềuăsoăv́iăb nhănhơnăthôngăth ng.ăKhôngăcóăs ăkh́cănhauănhiềuăgi aăb nhănhơnăkh́ngăthu cătiênăph́tăvƠăb nhănhơnăthôngăth ng.ăKhiănuôiăcấyătrênămôiătr ngăđặcăs ăkhu năḷcă m că ̉ă b nhă nhơnă kh́ngă thu că mắcă ph iă lƠă caoă h nă vƠă th iă giană m că

nhanhăh năsoăv́iăkh́ngăthu cătiênăph́tăvƠẳănh ngăb nhănhơnănƠyăs ăkhu năḷcăḷiăcaoăh nẳăb nhănhơnăthôngăth ngă[7]

+ăVềăđặcăđiểmăkh́ngăsinhăđ :ăkh́ngăthu cătiênăph́tăth ngăkh́ngăhayăkh́ngăv́iăn ngăđ ăthấp,ăkh́ngăthu cămắcăph iăth ngăkh́ngăv́iăn ngăđ ăcaoăh n.ăKh́ngăthu cătiênăph́tăhayăgặpăv́iăm tăthu c,ăkh́ngăthu căth́ăph́tăth ngătỷă

l ăkh́ngăcùngălúcăv́iănhiềuăthu căcaoăh nă[7]

Nh ăv yăkhôngăthểăd aăvƠoălơmăsƠngăhayăth iăgianăđiềuătr ăhi uăqu ăđểăch năđónăb nhănhơnălaoăkh́ngăthu căđ ợc.ăĆcăxétănghi măc nălơmăsƠngăkh́căchỉăcóăgíătr ăgợiăỦ.ăCh năđónăb nhălaoăkh́ngăthu căhi nănayăv năph iălấyăk tăqu ăkh́ngăsinhăđ ălƠmătiêuăchu n

1.5.2 Xác đ nh kiểu hình

G măćcăph ngăph́păsau:ăPh ngăph́păx́căđ nhăt ngăquan,ăph ngăph́păx́căđ nhătỷăl ăkh́ng,ăph ngăph́păđoămƠu,ăph ngăph́păkhửănitrateăvƠănhiềuăph ng pháp khác [13].ăĆcăph ngăph́pănƠyăđềuăx́căđ nhăkh ănĕngăph́tătriểnăc aăviăkhu nălaoătrongămôiătr ngănuôiăcấyăcóăkh́ngăsinh,ăt ăđóăđ aăraăk tălu năvềăkh ănĕngăkh́ngăthu căc aăch ngăviăkhu nălaoăđangănghiênăćuă[12].ăNh ợc điểmăc aăćcăph ngăph́pănày là viă khu nă laoă m că ch m,ă trênă môiă tr ngă Lowenstein-Jensenă th ngă mấtă 4-6

tu n.ăSửăd ngăh ăth ngămôiătr ngăl ngăđ ợcăc iăti nănh MGIT,ăBATECăcũngămấtăβă

tu n ĐiềuănƠyălƠmăchoăcôngăt́căđiềuătr ăvƠăkiểmăsótăt̀nhăh̀nhăb nhălaoăcũngănh ăb nhălaoăkh́ngăthu c cònăkhóăkhĕn

1.5.3 Xác đ nh kiểu gen

Hi nănayăcóănhiềuăph ngăph́păx́căđ nhăkiểuăgenăđ ợcắngăd ngăđểăch năđónăviăkhu nălaoăkh́ngăthu că[1, 4],ăgi iătr̀nhăt ăgenă[6], laiătrênăphaărắnă[γ6], Real ậ time PCR [14]

Ćcăph ngăph́păch năđónăx́căđ nhăkiểuăgenăd aătrênăc ăs̉ăph́tăhi năđ tăbi nă

̉ăćcăgenăcóăliênăquanăt́iătínhăkh́ngăthu căt ngắngă[51],ăsửăd ng ćcăkỹăthu tăcao,ă

đòiăh iăthi tăb ăhi năđ̣i,ăt năkémăvƠăc nănhơnăl căcóătr̀nhăđ ăchuyênăsơuănh ngăth iăgianăch năđónăbằngăph ngăph́pănƠyănhanhăh n,ăcóăđ ănḥyăvƠăđ ăđặcăhi uăcao

Đểăx́căđ nhăđ tăbi nătrênăgenăcóăliênăquanăt́iăkh́ngăthu că(genărpoB và katG)

hi nănayăgi iătr̀nhăt ăgenăv nălƠăph ngăph́păx́căđ nhăc ăb n,ăchínhăx́cănhấtăvƠăth iăgianăchoăk tăqu ăt ăγă- 5ăngƠy.ăSauăkhiăgi iătr̀nhăt ăđọnăgenăv aăđ ợcăt́chădòngăt ă

ch ngălaoănghiênăćuătaăs ăsoăśnhătr tăt ăsắpăx păćcănucleotideẳăm uăthíănghi măv́iă

tr tăt ănucleotideăchu năđểăbi tăđ ợcăćcăv ătríăsaiăl chă[22, 16]

Vi că x́că đ nhă các đ tă bi nă có liên quan kh́ngă thu că rifampicin và isoniazid bằngăkỹăthu tăgi iătr̀nhăt ăchoăbi tăchínhăx́căv ătríăđ tăbi năcũăvƠăḿiă trênăgenăc nănghiênăću,ămangăḷiăhiểuăbi tăsơuăsắcăvềăs ăđaăḍngăc aăcấuătrúcăqu năthểăviăkhu nălaoă

̉ăb nhănhơnălaoăkh́ngăthu c,ăđ́nhăgíăđ ợcătỷăl ăđ tăbi năliênăquanăkh́ngăthu cătrênăćcăch ngălaoăphơnăl păt ăćcăvùngăđ aălỦăkh́cănhau.ăQuaăđó lƠmătiềnăđềăxơyăd ngăm tă

s ă b ă kit real-timeă PCR,ă nhằmă ph́tă hi nă nhanhă viă khu nă laoă kh́ngă rifampicin và

isoniazidăṭiăVi tăNam

1.5.4 K thu t real-time PCR và multiplex real-time PCR

Real-time PCRălƠăkỹăthu tăPCRămƠăk tăqu ăkhu chăđ̣iăDNAăđíchăhiểnăth ăđ ợcăngayăsauăm iăchuăkỳănhi tăc aăph nắng,ădoăđặcăđiểmănƠyănênăv́iăreal-timeăPCRăng iălƠmăthíănghi măkhôngăc năthi tăph iălƠmăti păćcăb ́căthíănghi măđểăđ căvƠăphơnătíchă

k tăqu ăđểăx́căđ nhăcóăs năph măkhu chăđ̣iăđíchăhayăkhôngăv̀ăk tăqu ăcu iăcùngăc aă

ph nắngăkhu chăđ̣iăcũngăđ ợcăhiểnăth ăngayăsauăkhiăhoƠnătấtăph nắngăkhu chăđ̣i.ă

Nh ă v y,ă nênă cóă thể nói real-timeă PCRă lƠă kỹă thu tă nhơnă b nă DNAă đíchă trongă ngănghi măthƠnhăhƠngătỷăb năsaoăd aăvƠoăćcăchuăkỳănhi tăvƠăk tăqu ăkhu chăđ̣iătrongăngăph nắngăđ ợcăhiểnăth ăcùngălúcăv́iăph nắngăkhu chăđ̣iăx yăraăđểăng iălƠmăthíănghi măcóăthểăthấyăđ ợc

Chìa khóaăc aăkỹăthu tăreal-timeăPCRăchínhălƠăhóaăchấtăvƠăthu căthửăcóătrongă

ph nắng,ătrongăđó chấtăhuỳnhăquangăđ ợcăthêmăvƠoăh năhợp ph nắng là y uăt ăđ uă

tiênămƠăng iălƠmăreal-timeăPCRăc năquanătơm.ăChấtăhuỳnhăquangănƠyăph iălƠmăth ănƠoăđểă ngăph nắngăcóăthểăph́tăđ ợcăhuỳnhăquangăkhiăb ăchi uăb̉iăngu năśngăkíchăthíchă m tă khiă trongă ngă ph nă ́ngă nƠyă cóă s ă hi nă di nă c aă s nă ph mă khu chă đ̣iă t ăDNAăđích,ăvƠăs ăkhôngăthểăph́tăđ ợcăhuỳnhăquangăn uăkhôngăcóăs năph măkhu chăđ̣iătrongă ng.ăChoăđ nănay,ănhiềuăchấtăhuỳnhăquangănh ăv yăđưăđ ợcăt̀măraăvƠăsửăd ngă

r ngărưi.ăTrongăpḥmăviăkhóaălu nănƠy,ăchúngătôiăchỉăxinătr̀nhăbƠyăchấtăhuỳnhăquangă

th ngăđ ợcăsửăd ngănhấtăđóălƠăTaqman probe [8]

Probeăhayăcònăg iălƠă“đọnădò”ălƠănh ngăđọnăoligonucletidesăsợiăđ năcóătr̀nhă

t ăcóăthểăbắtăcặpăb̉ăsungăv́iăm tătr̀nhăt ăđặcăhi uătrênăDNAăđíchă(trongăPCR,ăđóălƠă

s năph măkhu chăđ̣iăđặcăhi uăt ăDNAăđích).ăĐọnădòănƠyăv́iăđ uă5’ăcóăgắnăchấtăph́tăhuỳnhăquangă(g iălƠăreporter)ăcònăđ uăγ’ăcóăgắnăchấtăd pătắtăhuỳnhăquangăt ngắngă(g iălƠăquencher)ăđểăd pătắtăđ ợcắnhăśngăhuỳnhăquangăđ ợcăph́tăraăt ăreporter.ăC ă

ch ăc aăs ăph́tătínăhi uăhuỳnhăquangăkhiăcóăs năph măkhu chăđ̣iălƠănh ăhọtătínhă5’-γ’ă

exonucleaseăc aăenzymeăTaq polymerase cóăkh ănĕngăcắtăb ăćcăprobeăkhiăćcăprobeă

bắtăcặpălênăsợiăkhuônăvƠăc năđ uăγ’ăc aăm iăkhiăenzymeăkéoădƠiăm iăđểăt̉ngăhợpăsợiăb̉ăsung (hình 1.9)

Hình 1.9 Nguyên lý ho t động c a real-time PCR s ḍng Taqman probe

(http://www.asuragen.com/Services/services/gene_expression/ab_taqman.aspx)

Trên hình 1.9 minh h aănguyênălỦăhọtăđ ngăc aăTaqmanăprobeătrongăreal-time PCR Khiăbắtăđ uăcóăs ăxuấtăhi năs năph măkhu chăđ̣iăđặcăhi uăth̀ăTaqmanăprobeăs ă

bắtăcặpă vƠoăsợiăkhuônăc aăs năph mănƠyă ̉ă giaiăđọnănhi tăđ ă bắtăcặpăvƠăs ăb ă Taq

polymerase cắtă b ă đểă kéoă dƠiă m iă t̉ngă hợpă nênă sợiă b̉ă sung,ă doă v yă reporteră c aăTaqmană probeă s ă b ă cắtă r iă xaă quencheră vƠă ph́tă đ ợcă huỳnhă quangă khiă nh nă đ ợcăngu năśngăkíchăthích.ăCƠngănhiềuăs năph măkhu chăđ̣iăxuấtăhi năth̀ăs ăl ợngăreporteră

t ădoăs ăcƠngănhiều,ăđ năm tălúcănƠoăđóăc ngăđ ăhuỳnhăquangăph́tăraăt ăreporterăđ ăṃnhăth̀ăḿyăs ăghiănh năđ ợcătínăhi uăhuỳnhăquangăph́tăraăt ă ngăph nắngăkhiănh nă

đ ợcă ngu nă śngă kíchă thích Ng ợcă ḷi,ă khiă khôngă cóă s ă xuấtă hi nă c aă s nă ph măkhu chăđ̣iăđặcăhi uăt ăDNAăđíchăth̀ăTaqmanăprobeăv năcònănguyênăvẹnădoăv yămƠăhuỳnhăquangăph́tăraăt ăreporterăs ăb ăquencherăc aăprobeăhấpăph ă(d pătắtătínăhi u)ădoă

đóă ngăthửă nghi mă s ăkhôngăph́tăđ ợcătínă hi uăhuỳnhăquangă khiănh nă đ ợcăngu năsáng kích thích [8]

Multiplex real-time PCR là m tă ḍngă thayă đ̉iă c aă ph nă ́ngă real-time PCR thôngăth ng,ẳăđóătrongăcùngăm tălúcăhai hayănhiềuăgenăđíchăđ ợcăkhuy chăđ̣iăbằngăćchăsửăd ngăđ ngăth iăćcăcặpăm iăvà các probe khác nhau

Kỹă thu tă multiplex real-time PCR choă phépă ti tă ki mă th iă gian,ă côngă ścă vƠăđóngăvaiătròărấtăquanătr ngătrongăch năđónăphơnătửăbaoăg măphơnătíchăđ tăbi năgen,ătínhăđaăh̀nhăDNAăvƠăphơnătíchăđ nhăl ợng, ph nắngămultiplexăreal-time PCRărấtăh uă

íchăchoăvi căph́t hi nătr căti păćcăđ tăbi năc aăM tuberculosis t ăćcăm uălơm sàng

hi năṭi)ăđ ợcăthuăth păt ăćcăvùngămiềnăkh́cănhauănh ăB nhăvi năPḥmăNg căTḥchă(TPăH ăChíăMinh),ăB nhăvi năTrungă ngăHu ăvƠăb nhăvi năLaoăvƠăB nhăph̉iăTrung ng.ă Ćcă ch ngă lao đ ợcă phơnă l pă t ă ćcă lọiă b nhă ph mă c aă b nhă nhơnă laoă nh :ă

đ m,ăd chămƠngăph̉i,ăd chărửaăph ăqu n,ăd chămƠngăb ng ăNgoƠiăra,ătrongănghiênăćuăcóăsửăd ngăch ngăchu năqu căt ăHγ7RvălƠmăđ iăch́ng

DNAăt̉ngăs ăc a ćcăch ngălaoănghiên ćuăđ ợcăt́chăchi tăṭiăH căvi năQuơnăy.ăN ngăđ ăDNAăđ ợcăđoătrênăḿyăNanoDrop®ăđểătínhăvƠăṭoăćcăn ngăđ ăDNAăc aăćcă m uă nh ă nhauă đểă khiă đ aă vƠoă h nă hợpă ph nă ́ngă PCRă cùngă m tă thểă tíchă DNAăkhuôn,ăvƠăđ̣tăkho ngă100ăng/thểătíchăβ5µlăph nắng

K tă qu ă đoă n ngă đ ă DNAă t̉ngă s ă c aă t ngă m uă nghiênă ćuă đ ợcă tr̀nhă bƠyătrongăph năph ăl că2

2.1.2 V t li u thi t b vƠ ḍng c̣ nghiên c u

Fermentasă(Mỹ) Fermentasă(Mỹ) Fermentasă(Mỹ) Fermentasă(Mỹ)

Vi năCNSH Fermentasă(Mỹ) Fermentasă(Mỹ)

*) Các máy và thiết bị chính

B̉ng 2.2 Các máy vƠ thi t b chính

ThommasăScientifică(Mỹ) Dolphină(Mỹ)

Nuaireă(Mỹ) Analitikaă(Đ́c) AppliedăBioSciencesă(Mỹ)

2.1.3 Các cặp m i dùng trong nghiên c u

D aă trênă tr̀nhă t ă genă rpoB và katG c aă ch ngă ḍiă Hγ7Rvă (Accesion:ă

NC_00096β)ăđưăđ ợcăcôngăb ătrênăngơnăhƠngăgi ăli uăgenăqu căt ăNCBI.ăTrênăc ăs̉ă

B̉ng 2.3 Trình t các cặp m i dùng trong nghiên c u

Gen

KT (bp)

katG katG-F 5’- GAG CCC GAT GAG GTC TAT TG - γ’

684 katG-R 5’- GTC TCG GTG GAT CAG CTT GT - γ’

rpoB rpoB-F 5’- ACC GAC GAC ATC GAC CAC TT - γ’

528 rpoB-R 5’- GGC GGT CAG GTA CAC GAT CT - γ’

Trongăđó,ăcặpăm iăkatG-F và katG-RănhơnăđọnăgenăkatG cóăch́aăcodonăγ15ă liênăquanăkh́ngăthu căisoniazid,ăcặpăm iărpoB-F và rpoB-RănhơnăđọnăgenărpoB có

ch́aăđọnănóng 81ăbpăliênăquanăt́iăkh́ngăthu cărifampicin

BamHI

BamHI

BamHI

BamHI

2.2.2 PCR nhơn đo n gen đích

Ph nắngăPCRănhơnăđọnăgen katG và rpoB đặcăhi uăđ ợcăth căhi n:

B̉ng 2.4 ThƠnh ph n cho một ph̉n ng PCR

1 Dungăd chăđ mă(PCRăBufferă10X)ăăăăăăăăăăăăăăăăăăăăăăăăăăă1X 2,5

Theoăchuăkỳănhi tănh ăsau

B̉ng 2.5 Chu kỳ nhi t cho ph̉n ng PCR

B ́căăăăăăăăăăăPh nắngăăăăăăăăăăăăăăăăăăăăNhi tăđ ă(oC)ăăăăăăTh iăgianăăăăăăăăăăăăChu kì 1ăăăăăăăăăăăăăăăBi nătínhăăăăăăăăăăăăăăăăăăăăăăăăăăăăă95ăăăăăăăăăăăăăăăăăăă5ăphútăăăăăăăăăăăăăăăăăăăăăăăă1 βăăăăăăăăăăăăăăăBi nătínhăăăăăăăăăăăăăăăăă 94 1 phút

γăăăăăăăăăăăăăăăGắnăm iăăăăăăăăăăăăăăăăăăăăăăăăăăăăăă56ăăăăăăăăăăăăăăăăăăă45ăgiơyăăăăăăăăăăăăăăăăăăăăăγβ 4ăăăăăăăăăăăăăăăKéoădƠiăchu iăăăăăăăăăăăăăăăăăăăăăă7βăăăăăăăăăăăăăăăăăăă1ăphútăăăăăăăăăăăă

5ăăăăăăăăăăăăăăăHoƠnătấtăkéoădƠiăăăăăăăăăăăăăăăăăă7βăăăăăăăăăăăăăăăăăăă10ăphútăăăăăăăăăăăăăăăăăăăăăă1 6ăăăăăăăăăăăăăăăK tăthúcăph nắngăăăăăăăăăăăăăăă4ăăăăăăăăăăăăăăăăăăăăăăă∞

S năph măPCRăđ ợcăkiểmătraăbằngăcḥyăđi nădiătrênăgelăagaroseă0,8%.ăĐểăph că

v ăchoăgi iătr̀nhăt ăgen,ăđọnăgenăkatG và rpoB đ ợcătinhăṣchăvƠădòngăhóaăvƠoăvectoră

t́chădòngăpBTăđểăṭoăvectorăt́iăt̉ăhợp.ă

2.2.3 T o dòng gen

B̉ng 2.6 ThƠnh ph n hỗn h p ph̉n ng n i ghép

*) Biến nạp và nuôi ćy tế bào ć vector tái t̉ ḥp

S năph măn iăghépăđ ợcăbi năṇpăvƠoăt bào kh ăbi năE coli DH5α (đưăđ că

xửălỦăbằngăCaCl2 theoăph ngăph́păchu n)ăbằng s cănhi t 42oC trong 90 giơy.ăS nă

ph măbi năṇpăđ ợcăb̉ăsungăβ00ăµlăLBăl ng,ălắcăβ00ăvòng/phútătrongă1ăgi ẳăγ7oC vƠătr iătrênăđƿaătḥchăcóăb̉ăsungăampicillină100ămg/l,ăIPTGă 100 mg/l và X-gal 200 mg/l.ăĐƿaătḥchăđ ợcă ăquaăđêmẳăγ7oC.ăCh năm tăkhu năḷcătrắngătrênăm iăđƿaăti pă

t că đ ợcă ch nă nuôiă quaă đêmă trongă môiă tr ngă LBă l ngă cóă b̉ă sungă kh́ngă sinhăampicillin 100 mg/l

*) Tách chiết Plasmid và kiểm tra

Khu nănuôiăquaăđêmăs ăđ ợcăthuăḷiăbằngălyătơmăvƠăt́chăplasmid theo protocol

c aăb ăkit AccuPrep Plasmid mini Extraction (Bioneer ậ HƠnăQu c).ăPlasmidăt́iăt̉ăhợp

đ ợcăkiểmătraăcóăđọnăgenănghiênăćuăqua ph nắngăcắtăbằngăenzymeăḥnăch BamHI.ă

K tăqu ăsauăkhiăth căhi năph nắngăcắtăs ăthuăđ ợcăhaiăph n:ăṭoă1ăbandătrênă nhăđi nă

diăcóăkíchăth ́că684ăbpă(đ iăv́iăgenăkatG)ăhoặcăkíchăth ́că5β8ăbpă(đ iăv́iăgenărpoB)ă

vƠăm tăbandălƠăph năcònăḷiăc aăplasmidăkho ngăβ,7ăkb

B̉ng 2.7 ThƠnh ph n hỗn h p ph̉n ng c t plasmid tái t h p b ng enzyme

Sauăph nắngăcắt,ăs năph măđ ợcăđi nădiăkiểmătraătrênăgelăagaroseă1%.ăNh ngă

m uănƠoăcóăṿchăt ngắngăv́iăkíchăth ́căc aăđọnăgenăc nănghiênăćuăth̀ăcóăthểăsửă

đ ợcăcôngăb kỦăhi uăl năl ợtălƠăRv1908c và Rv0667

XửălỦ,ăphơnătíchăćcătr̀nhăt ăđọnăgenăkatG 684bp và rpoB 5β8bpăc aăćcăch ngă

viăkhu nălaoănḥyăvƠăkh́ngăbằngăch ngătr̀nhăphơnătíchăchu iăBioEdit.ăSoăśnhăđ iăchi uăv́iăćcăd ăli uăngơnăhƠngăgenăđểăcóăk tăqu ăćcăv ătríăđ tăbi năc aăt ngăch ngănghiênăću.ă

2.2.4 Multiplex real-time PCR

Sau khi tách dòng vƠă gi iă tr̀nhă t ă đọnă genă katG và rpoB c aă ćcă ch ngă viă

khu nălaoănghiênăćuăđ ợcăphơnăl păṭiăćcăvùngămiềnăkh́cănhauăṭiăVi tăNam,ăquaă

phơnătíchăćcăđ tăbi n, ćcăprobeăs ăđ ợcăthi tăk ănhằmăph́tăhi năćcăđ tăbi năcóăliênăquan kháng INH và RIF ̉ăviăkhu n lao bằngăph nắngămultiplexăreal-time PCR Do trongăph nắngămultiplexăreal-timeăPCRăsửăd ngăβăprobeăkh́cănhauătrongăcùngăm tă

ph nắngănênăvi căl aăch năβăprobeănƠyăph iăgắnăβăreporteră(chấtăph́tăhuỳnhăquang)ăkh́cănhauăđểăcóăthểăphơnăbi tẳăćcăb ́căsóng khác nhau

Probe dùng choăph nắngăreal-time PCRăsửăd ngăchoănghiênăćuănƠy đ ợcăthi tă

k ă theoă côngă ngh TaqMan MGB (Minor Groove Binding) probe (TaqManR

Chemistry)ăc aăhưngăAppliedăBiosystems ḍngăTaqMan nƠyăcóă uăđiểmăđóălƠăcóăthểă

th căhi năph nắngăreal-timeăPCRẳănhi tăđ ăcao,ăt ăđóălƠm tĕngăđ ăđặcăhi uăc aăćcăprobe.ăH năn aăćcălọiăprobeăthu căḍngănƠyăđ ợcăd ădƠngăphơnăbi tăd aătrênănhi tă

đ ănóngăch y.ăChínhă v̀ăv yăćcălọiăprobeă nƠyă th ngăđ ợcădùngăđểăth că hi năćcă

ph nă ́ngă multiplexă real-time PCR v́iă đ ă đặcă hi uă vƠă đ ă nḥyă cao TaqMan hay

ph ngăph́pănucleaseăđ uă5’ălƠăm tătrongănh ngăthíăd ăvềăćcălọiăprobe th yăphơn,ătínă

hi uăhuỳnhăquangăph́tăraădoăs ăth yăphơnăćcăđọnăprobe đ ợcădùngăđểăph́tăhi năćcăđọnă s nă ph mă PCR.ă Ćcă đọnă probeă đ ợcă gắnă v́iă m tă reporteră ̉ă đ uă 5’ă vƠă m tăquencheră(chấtăd pătắtătínăhi uăhuỳnhăquang)ẳăđ uăγ’.ăTrongănghiênăćuăchúngătôiăsửă

d ngăβăprobeăcóăgắnăβăreporterăkh́cănhau,ăreporterăgắnăFAMăchoăphépăph́tătínăhi uăhuỳnhă quangă khiă đoă ̉ă b ́că sóngă 5γ0ă nmă vƠă reporteră còn ḷiă đ ợcă gắnă VICă ph́tăhuỳnhăquangẳăb ́căsóngă560ănm Ćcăquencherăđ ợcăgắnẳăđ uăγ’ăc aăm iăprobeălƠ các BHQăph́tănhi t,ăćcăBHQăph́tănhi tăhi nănayăđ ợcă aăchu ngăsửăd ngăv̀ăkh ănĕngăhấpăth ăhuỳnhăquangărấtăṃnh,ăćcăBHQăđ ợcăxemănh ăćcăl ăđenă(blackăhole quencher ậ BHQ)ăhútălấy tấtăc ăćcăhuỳnhăquangăt ăreporterăkhôngăchoăbấtăć huỳnhăquangă nƠoă ph́tă raă đ ợcă t ă reporter,ă đ ngă th iă rấtă d ă dƠngă đểă thi tă k các Taqman probe dùng cho multiplex real-timeăPCRămƠăkhôngăloăđ năph̉ăhuỳnhăquangăc aăćcăreporter cóăb ătrùngăv́iăph̉ăhuỳnhăquangăc aăquencherăv̀ăquencherăkhôngăhềăph́tăhuỳnhăquang

Ch ng 3 ậ K T QU VẨ TH O LU N

3.1 K TăQU ăTÁCHăDọNGăVẨăGI IăTRÌNHăT

3.1.1 K t qủ nhơn gen katG và rpoB t̀ DNA tách t̀ vi khu n lao

Hai gen katG và rpoB đ ợcăkhu chăđ̣iăt t̉ngăs ă93 ch ngăviăkhu nălao,ătrongăđóăg măcóăm tăch ngăchu năqu căt ăHγ7Rv,ămiềnăBắcăcóă9 ch ngăđ năkh́ng và 13

ch ngăđaăkh́ng;ăămiềnăNamăcóă10ăch ngănḥy,ă11 ch ngăkh́ngăđ n,ă14 ch ngăkh́ngăđaăvà 12 ch ngăsiêuăkh́ng;ămiềnăTrungăcóă11 ch ngăkh́ngăđ n và 12 ch ngăđaăkh́ng Đặcătínhăkh́ngăthu căc aăt ngăch ngăthu căćcămiềnăkh́cănhauăđ ợcătr̀nhăbƠyătrênă

b ngăγ.1ăvƠăph năph ăl că2

B̉ng 3.1: Đặc tính kháng thu c c a ch ng vi khu n lao nghiên c u

Chú thích : S: Streptomycin, H: Isoniazid, E: Ethambutol, R: Rifampicin, Ofx:

Ofloxacin, Th: Thioacetazone, Eto: Ethionamide, Cs: Cycloserine, Km: Kanamycin, PAS: P-aminosalicylic acid

K tăqu ănhơnăhaiă gen katG và rpoB bằngăkỹăthu tăPCRăđ ợcătr̀nhăbƠyătrongă

hình 3.1A và 3.1B.ăăK tăqu ẳăh̀nhăγ.1AălƠăk tăqu ăđ̣iădi năs năph măPCRănhơnăgenă

katG, còn hình 3.1B là k tăqu ăđ̣iădi năc aăs năph măPCRănhơnăgenărpoB

M: Marker 1 kb

1-6 : Th t tên các m u nghiên c u t ng ng

7 : Đ i ch ng ơm

K tăqu ăđi nădiăkiểmătraăsauăkhiăPCRănhơnăgenăkatG và rpoB choăthấyăc ă93

ch ngăviăkhu nălaoăđềuăchoăk tăqu ăd ngătínhăv́iăđọnăgenărpoB 528 bp và katG 684

bp Ćcăbĕngăs năph măđềuăđặcăhi u,ărõănétăkhôngăcóăṿchăph ăkèmătheo và có kích

th ́că đúngă theoă tínhă tónă lỦă thuy t.ă Tuyă nhiên,ă đểă khẳng đ nhă chínhă x́că đọnă genănghiênăćuăvƠăphơnătíchăćcăđ tăbi năcóăliênăquanăkh́ngăthu cătrênăćcăđọnăgenănƠy,ăchúngătôiăđưăti năhƠnhăt́chădòngăvƠăgi iătr̀nhăt ăgen

3.1 2 K t qủ tách dòng gen

B ́căđ uătiênăc aăqúătr̀nhăt́chădòngălƠăth căhi năph nắngăghépăn iăgenăđíchăvƠoăvectorăt́chădòngăpBT,ăPh nắngăn iăđ ợcăxúcăt́căb̉iăT4 DNA ligase Sauăkhiăđọnăgen đíchăđưăđ ợcăgắnăvƠoăvectorăpBT,ăđểălƠmăgiaătĕngăs ăl ợngăb năsaoăc aăvectorăt́iă

t̉ăhợp nƠyăm tăćchănhanhăchóng,ăchúngătôiăti năhƠnhăbi năṇpăplasmidăt́iăt̉ăhợpăvƠoă

trongă t ă bƠoă kh ă bi nă E.coli DH5 vƠă nuôiă cấyă trênă môiă tr ngă LBă l ng, lắc 200

vòng/phút ̉ăγ70Cătrongă1ăgi ăđểălƠmăph căh iăt ăbƠoăE.coliămangăplasmidăt́iăt̉ăhợpă

đó.ăS năph măbi năṇpăsauăđóăđ ợcăcấyătr iătrênămôiătr ngăLBăđặcăcóăb̉ăsungăkh́ngăsinhăch năl căampicillină50ăµg/ml,ăX-galăβ0ămg/mlăvƠăIPTGă100ămMăvƠăđ ợcănuôiătƿnhă

̉ăγ70Cătrongă18h.ăK tăqu ăbi năṇpđ ợcătr̀nhăbƠyẳăh̀nhăγ.β

Hình 3.2 Ch n dòng khu n mang plasmid tái t h p trên môi tr ng LB có b sung

ampicillin 50 µg/ml, X-gal 20 mg/ml vƠ IPTG 100 mM

Sau 18 gi ănuôiăcấy,ătrênămôiătr ngăLBătḥchăcóăch́aăkh́ngăsinhăampicillin,ăX-galăvƠăIPTG,ăxuấtăhi năhaiălọiăkhu năḷc:ăkhu năḷcămƠuăxanhăvƠăkhu năḷcămƠuătrắng.ăTấtăc ăćcăkhu năḷcănƠyălƠănh ngăkhu năḷcăđưăđ ợcăbi năṇpăplasmidăch́aăgenă kh́ngă kh́ngă sinhă ampicillin,ă tuyă nhiênă chỉă cóă nh ngă khu nă ḷcă mƠuă trắngă lƠămangăplasmidăt́iăt̉ăhợp.ăDoăđó,ăchúngătôiăl aăch năćcăkhu năḷcătrắngănƠyăđemănuôiăcấyăquaăđêmẳăγ70C,ălắcăβ00ăvòng/phút trongămôiătr ngăLBăl ngăcóăb̉ăsungăkh́ngăsinhăphùăhợp S năph mănuôiăcấyăđ ợcălyătơmăđểăthuăkhu năph căv ăchoăqúătr̀nhătách plasmid

*) Tách plasmid

Quyătr̀nhăt́chăchi tăDNAăplasmidăđ ợcăth căhi nătheoăđúngăh ́ngăd năc aăb ăkit AccuPrep Plasmid mini Extraction (Bioneer ậ HƠnăQu c).ăĐểăkiểmătraăs năph măt́chăplasmid,ăchúngătôiăđi nădiăkiểmătraătrênăgelăagaroseă1% K tăqu ăđ ợcătr̀nhăbƠyătrong hình 3.3A và 3.3B

*) Kiểm tra plasmid tái t̉ ḥp bằng enzyme cắt giới hạn

Quyătr̀nhăcắtăplasmidăbằngăenzymeă BamHIăđ ợcătr̀nhăbƠyă nh ăđưă miêuă t ẳă

ph năph ngăph́p (B ngăβ.7).ăSauăđóăs năph măđ ợcăkiểmătraăbằngăph ngăph́păđi nă

di trên gel agarose 1% K tăqu ăđ ợcăchỉăraătrong hình 3.4A và 3.4B

1 2 3 4 5 6 7 M 1 2 3 4 5 6

3

2,5

3 2,5

M: Marker 1 kb

1-6: Th t tên các m u nghiên c u t ng ng

7: Đ i ch ng ơm

T ăh̀nhă nhăminhăh aăγ.4AăvƠăγ.4B, chúng ta cóăthểăthấy s năph măcắtăđềuăcho

nh ngăđọnăgenăcóăkíchăth ́căđúngăv́iăkíchăth ́căc aăđọnăgenăc nănghiênăću.ăT ă

k tăqu ănƠyăchúngătôiăk tălu nărằngăplasmidăđưămangăđọnăgenăchèn.ăDoăđóăs năph măt́chăplasmidăti păt căđ ợcăgửiăđ cătr̀nhăt

3.1.3 K t qủ phơn tích trình t gen katG

Quaăphơnă tíchătr̀nhăt ăgenă katG c aă93 ch ngălao, trongăđóăcóă8βăch ngălaoă

kh́ngăthu c,ă10ăch ngănḥyăkh́ngăsinhăvƠă1ăch ngăchu năqu căt ăHγ7Rv Trong 82

ch ngă laoă kh́ngă thu că nƠyă cóă 64ă ch ngă kh́ngă Isoniazidă (69,6%);ă 46 ch ng kháng rifampicin (50%), 68 ch ngăkh́ngăstreptomycină(74%) chúngătôiăthuăđ ợcăk tăqu ănh ăsau (B ngă3.2)

B̉ng 3.2: T l đột bi n làm thay đ i amino acid t i codon 315 c a gen katG trong các

ch ng kháng thu c phơn l p t i các miền khác nhau t i Vi t Nam

Hình 3.4A Đi n di s̉n ph m c t plasmid

tái t h p gen katG b ng enzyme BamHI

Hình 3.4B Đi n di s̉n ph m c t plasmid

tái t h p gen rpoB b ng enzyme BamHI