NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG VI KHUẨN NỘI SINH ĐỂ PHÒNG TRỪ BỆNH ĐỐM LÁ, KHÔ CÀNH NGỌN KEO LAI (Acacia auriculiformis x Acacia mangium) DO NẤM Colletotrichum gloeosporioides (Penz.) Sacc.

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM       VŨ VĂN ĐỊNH VŨ VĂN ĐỊNH NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG VI KHUẨN NỘI SINH ĐỂ PHÒNG TRỪ NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG VI KHUẨN NỘI SINH ĐỂ PHÒNG TRỪ BỆNH BỆNH ĐỐM LÁ, KHÔ CÀNH NGỌN KEO LAI (Acacia auriculiformis x Acacia ĐỐM LÁ, KHÔ CÀNH NGỌN KEO LAI (Acacia auriculiformis x mangium) DO NẤM Colletotrichum gloeosporioides (Penz.) Sacc G ÂY HẠI TẠI Acacia mangium) DO NẤM COLLETOTRICHUM GLOEOSPORIOIDES LÂM TRƢỜNG TAM THẮNG, HUYỆN THANH SƠN TỈNH PHÚ THỌ (PENZ.) SACC G ÂY HẠI TẠI LÂM TRƢỜNG TAM THẮNG , HUYỆN THANH SƠN TỈNH PHÚ THỌ Chuyên ngành: Lâm học Mã số: 60 62 60 LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC LÂM NGHIỆP LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC LÂM NGHIỆP NGƢỜI HƢỚNG DẪN: PGS TS PHẠM QUANG THU Thái Nguyên, 2008 Thái Nguyên, 2008 MỤC LỤC 3.3 Nội dung nghiên cứu………………………………………………………15 Lời cảm ơn 3.3.1 Xác định nấm gây bệnh đốm lá, khô cành keo lai đánh giá ảnh Mục lục hưởng bệnh keo lai khu vực nghiên cứu 15 Danh mục bảng i 3.3.2 Phân lập chủng vi khuẩn nội sinh keo lai theo cấp bệnh 15 Danh mục hình ii 3.3.3 Thử hiệu lực khả kháng nấm bệnh chủng vi khuẩn phân lập Kí hiệu, chữ viết tắt iii 15 Đặt vấn đề Chƣơng TỔNG QUAN TÀI LIỆU NGHIÊN CỨU 1.1 Tình hình nghiên cứu giới .3 1.2 Tình hình nghiên cứu nước……………………………………… Chƣơng ĐIỀU KIỆN TỰ NHIÊN - KINH TẾ - XÃ HỘI KHU VỰC NGHIÊN CỨU……………………………………………………………… 10 2.1 Điều kiện tự nhiên khu vực nghiên cứu………………………………… 10 2.2 Địa hình, thổ nhưỡng 10 2.3 Khí hậu thuỷ văn 10 2.4 Điều kiện kinh tế - xã hội 11 2.4.1 Điều kiện kinh tế .11 2.4.2 Điều kiện xã hội 13 Chƣơng MỤC TIÊU - ĐỐI TƢỢNG - THỜI GIAN - ĐỊA ĐIỂM - NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .14 3.3.4 Đánh giá mối quan hệ vi khuẩn nội sinh với chủ cấp bị bệnh khác để tìm hiểu chế .15 3.3.5 Ứng dụng vi khuẩn nội sinh phòng chống bệnh đốm lá, khô cành keo lai .15 3.4 Phương pháp nghiên cứu 16 3.4.1 Xác định nấm gây bệnh đốm lá, khô cành keo lai đánh giá ảnh hưởng bệnh keo lai khu vực nghiên cứu 16 3.4.2 Phân lập chủng vi khuẩn nội sinh keo lai theo cấp bệnh…………………………………………………………………………….23 3.4.3 Thử hiệu lực khả kháng nấm bệnh chủng vi khuẩn phân lập .25 3.4.4 Đánh giá mối quan hệ vi khuẩn nội sinh với chủ cấp bị bệnh khác để tìm hiểu chế .26 3.3.5 Ứng dụng vi khuẩn nội sinh phòng chống bệnh đốm lá, khô cành keo lai .27 3.1 Mục tiêu nghiên cứu………………………………………………………14 3.2 Địa điểm nghiên cứu………………………………………………………14 3.2.2 Thời gian nghiên cứu……………………………………………………14 3.2.3 Đối tượng nghiên cứu……………………………………………………14 Chương KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU .31 4.1 Xác định nấm gây bệnh khô cành keo lai đánh giá ảnh hưởng bệnh keo lai khu vực nghiên cứu .31 4.1.1 Triệu chứng bệnh đốm lá, khô cành keo lai 31 4.1.2 Kết phân lập nấm bệnh…………………………………………… 32 4.5.4 Ảnh hưởng vi khuẩn nội sinh đến keo lai giai đoạn rừng non (1 4.1.3 Kết thí nghiệm gây bệnh nhân tạo………………………………… 33 tuổi) .56 4.1.4 Giám định nguyên nhân gây bệnh 34 Chương KẾT LUẬN - TỒN TẠI VÀ KIẾN NGHỊ………………………60 4.1.5 Sự sinh trưởng hệ sợi nấm Colletotrichum gloeosporioides môi 5.1 Kết luận……………………………………………………………………60 trường dinh dưỡng PDA 36 5.2 Tồn kiến nghị……………………………………………………… 62 4.1.6 Đánh giá ảnh hưởng bệnh keo lai khu vực nghiên TÀI LIỆU THAM KHẢO .63 cứu .36 4.2 Phân lập chủng vi khuẩn nội sinh keo lai theo cấp hại………………………………………………………………………………38 4.3 Thử hiệu lực khả kháng nấm bệnh chủng vi khuẩn phân lập được…………………………………………………………………………….40 4.3.1 Xác định chế kháng bệnh thông qua chủng loại mật độ vi khuẩn nội sinh………………………………………………………………………… 40 4.3.2 Mật độ tế bào chủng vi khuẩn có hiệu lực cao………………….42 4.3.3 Một số đặc điểm sinh học chủng vi khuẩn có hiệu lực cao………………………………………………………………………… 42 4.4 Đánh giá mối quan hệ vi khuẩn nội sinh với chủ cấp bị bệnh khác để tìm hiểu chế ………………………………………………47 4.5 Ứng dụng vi khuẩn nội sinh phòng chống bệnh đốm lá, khô cành keo lai………………………………………………………………………… 48 4.5.1 Nhân sinh khối sản xuất chế phẩm ………………………………… .48 4.5.2 Hiệu lực kháng nấm bệnh khuẩn nội sinh phòng thí nghiệm………………………………………………………………………….49 4.5.3 Thử nghiệm hiệu lực vi khuẩn nội sinh giai đoạn vườn ươm…………………………………………………………………………… 52 DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH Bảng Tên bảng Trang 4.01 Kết gây bệnh nhân tạo keo lai 33 4.02 Sinh trưởng hệ sợi nấm môi trường PDA 36 4.03 4.04 4.05 4.06 4.07 4.08 4.09 Ảnh hưởng bệnh keo lai Lâm trường Tam Thắng huyện Thanh Sơn, tỉnh Phú Thọ Số lượng chủng khuẩn mức độ bị bệnh Khả kháng nấm Colletotrichum gloeosporioides chủng khuẩn nội sinh Kết gây bệnh nhân tạo chủng khuẩn nội sinh đối kháng nấm bệnh Ảnh hưởng khuẩn nội sinh đến tỷ lệ bị bệnh mức độ bị bệnh keo lai giai đoạn vườn ươm Ảnh hưởng khuẩn nội sinh đến sinh trưởng keo lai giai đoạn vườn ươm Ảnh hưởng vi khuẩn nội sinh đến keo lai tuổi 37 38 41 49 Hình Tên hình Trang 3.01 Cây bị bệnh cấp 20 3.02 Cây bị bệnh cấp 21 3.03 Cây bị bệnh cấp 21 3.04 Cây bị bệnh cấp 21 3.05 Cây bị bệnh cấp 21 4.01 Thân cành keo lai bị bệnh 31 4.02 Rừng trồng keo lai bị bệnh đốm lá, khô cành 32 4.03 Thể nấm gây bệnh 32 4.04 Sự sinh trưởng sợi nấm môi trường PDA 33 4.05 Thí nghiệm gây bệnh nhân tạo 34 4.06 Bào tử vô tính nấm gây bệnh 35 4.07 Tỷ lệ chủng khuẩn phân lập vị trí khác 49 chủ 4.08(a,b) Khuẩn bào tử B01 đối kháng với nấm Colletotrichum 42 gloeosporioides 50 4.09(a,b) Khuẩn bào tử B02 đối kháng với nấm Colletotrichum 43 gloeosporioides 54 57 4.10(a,b) Khuẩn bào tử B03 đối kháng với nấm Colletotrichum gloeosporioides 4.11(a,b) Khuẩn bào tử P01 đối kháng với nấm Colletotrichum 44 45 gloeosporioides 4.12(a,b) Khuẩn bào tử X01 đối kháng với nấm Colletotrichum gloeosporioides 45 4.13(a,b) Khuẩn bào tử X02 đối kháng với nấm Colletotrichum KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT 46 gloeosporioides 4.14 Khuẩn bào tử X1.1 đối kháng với nấm Colletotrichum gloeosporioides 4.15 Mức độ bị kháng bệnh chủng khuẩn 4.16 Khả kháng nấm chủng khuẩn B01, B02, 51 4.18 4.19 4.20 4.21 Khả kháng nấm chủng khuẩn P01 X1.1 Khả ứcc chế nấm chủng khuẩn X01 X02 Ảnh hưởng khuẩn nội sinh đến tỷ lệ bị bệnh mức độ bị bệnh keo lai giai đoạn vườn ươm Ảnh hưởng khuẩn nội sinh đến đường kính gốc keo lai giai đoạn vườn ươm Ảnh hưởng khuẩn nội sinh đến keo lai giai đoạn 4.23 Ảnh hưởng khuẩn nội sinh đến tỷ lệ bị bệnh mức độ bị bệnh keo lai giai đoạn rừng tuổi 52 52 54 D1.3 Đường kính ngang ngực Đường kính cổ rễ CT1 Công thức CT2 Công thức CT3 Công thức CT4 Công thức CT5 Công thức ĐC Công thức đối chứng M Trọng lượng B Bark P Phloem X Xylem 54 56 58 Ảnh hưởng thể tích dịch khuẩn B03 tiêm vào keo lai giai đoạn rừng non tuổi bị bệnh keo lai giai đoạn rừng tuổi độ Chiều cao vút Dg vườn ươm 4.22 HVN 51 (a,b,c,d) B03 4.17(a,b) Chữ đầy đủ Kí hiệu, chữ viết tắt 47 58 LỜI CẢM ƠN ĐẶT VẤN ĐỀ Được đồng ý trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên, khoa Sau Trong dự án trồng triệu hecta rừng, có triệu hecta rừng phòng hộ, Đại học, thầy giáo hướng dẫn Phạm Quang Thu tác giả tiến hành thực đề triệu hecta rừng sản xuất (trong có gần triệu hecta rừng nguyên liệu) Loài tài: “Nghiên cứu ứng dụng vi khuẩn nội sinh để phòng trừ bệnh đốm lá, khô dùng để trồng rừng nguyên liệu loài có giá trị kinh tế, sinh trưởng cành keo lai (Acacia auriculiformis x Acacia mangium) nấm nhanh, xuất cao, chu kỳ kinh doanh ngắn mau cho thu hoạch sản phẩm Colletotrichum gloeosporioides (Penz.) Sacc gây hại lâm trƣờng Tam Những loài cần có khả thích ứng cao với hoàn cảnh trồng Thắng, huyện Thanh Sơn, Phú Thọ” đất trống đồi núi trọc, dễ gây trồng, sản phẩm phong phú đa dạng, thích Để hoàn thành luận văn tốt nghiệp này, tác giả nhận hướng dẫn tận tình thầy giáo Phạm Quang Thu giúp đỡ quan, ban ngành góp ý chân tình bạn bè đồng nghiệp Nhân dịp này, tác giả xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS TS Phạm Quang Thu thầy giáo trực tiếp hướng dẫn khoa học toàn thể cán bộ, công nhân viên Viện nghiên cứu khoa học Lâm Nghiệp Việt Nam, thầy, cô giáo khoa Sau đại học, khoa Lâm nghiệp trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên, Ban giám hiệu trường Trung cấp Kinh tế - Kỹ thuật tỉnh Lào Cai nơi công tác hợp với quy trình công nghệ chế biến thị trường tiêu thụ Mặt khác cần phải đề cập đến khía cạnh vừa phải đáp ứng mặt kinh tế đảm bảo tác dụng phòng hộ, cải tạo cảnh quan môi trường có khả chống chịu loài sâu bệnh hại [1] Các loài keo sinh trưởng nhanh, chu kỳ kinh doanh ngắn dùng làm gỗ củi, làm giấy, làm đồ xây dựng, đồ gỗ đồ mỹ nghệ Điều chứng tỏ gỗ keo dùng rộng rãi người dân chấp nhận gỗ số loài Đinh, Lim, Lát … ngày đắt [3] Ngoài keo loài có khả tổng hợp nitơ tự cao (Dart, C.S, 1991), có khả thích ứng với điều kiện khí hậu đất đai nước ta từ vùng cát ven biển Tác giả xin chân thành cảm ơn cán phòng nghiên cứu bảo vệ rừng Viện Khoa học Lâm Nghiệp Việt Nam, bạn sinh viên trường Đại học Lâm tương đối khô hạn đến vùng núi thấp 400m, loài cải tạo đất, tăng độ phì, độ xốp tính chất lý, hóa khác đất Nghiệp, Xuân Mai, Hà Nội cán bộ, công nhân viên lâm trường Tam Do nhu cầu sử dụng vào mục đích khác gỗ keo làm bột Thắng (huyện Thanh Sơn - Phú Thọ), bạn bè đồng nghiệp người giấy, dăm xuất khẩu, gỗ xây dựng, gỗ củi chế biến đồ mộc xuất mà thân gia đình giúp đỡ tạo điều kiện tốt cho tác giả hoàn thành nhiều năm nay, số loài keo Acacia gây trồng rộng rãi khắp luận văn nước quy mô rừng trồng tập trung trồng phân tán Theo thống kê đến tháng 12 năm 2005, diện tích rừng trồng nước ta 2.333.000 ha, Thái Nguyên, ngày 10 tháng10 năm 2008 diện tích rừng trồng loài keo chiếm tỷ lệ lớn [2] Trước gia tăng nhanh mặt diện tích, rừng trồng keo xuất nhiều bệnh gây khó khăn không nhỏ cho số địa phương nước Tại Vũ Văn Định Bầu Bàng, Bình Dương số dòng keo lai bị mắc bệnh phấn hồng (pink disease) với tỷ lệ mức độ bị bệnh cao, gây nhiều thiệt hại cho sản xuất Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Tại Đạ Tẻh, tỉnh Lâm Đồng, Keo tai tượng trồng loài với tổng diện tích Chương 400 có 118,5 bị bệnh với tỷ lệ từ đến 59 % có số TỔNG QUAN TÀI LIỆU NGHIÊN CỨU diện tích bị hại nặng Tại Kon Tum, năm 2001 có khoảng 1000 rừng keo lai tuổi bị nhiễm bệnh loét thân, thối vỏ dẫn đến khô ngọn, với tỷ lệ bị bệnh khác địa phương Tỷ lệ bị bệnh nặng Ngọc Tụ, Ngọc Hồi, Kon Tum lên đến 90% bị chết Trong đó, nấm Colletotrichum gloeosporioides (Penz.) Sacc loài nấm gây bệnh phổ biến vùng trồng keo lai nước, với triệu chứng đốm lá, khô cành ảnh hưởng lớn đến sinh trưởng suất rừng trồng [18], [21] Áp dụng biện pháp hóa học để phòng trừ bệnh cho rừng trồng không khả thi diện tích rừng trồng lớn gây ảnh hưởng đến môi trường sinh thái Nghiên cứu giảm thiểu ảnh hưởng bệnh biện pháp chọn giống sinh học nhà khoa học quan tâm Vi khuẩn nội sinh vi khuẩn tiền nhân, sống mô thực vật mà không gây bệnh cho chủ (Willson 1995) Một số vi sinh vật nội sinh có hoạt tính sinh học tạo chất kháng sinh đối kháng với sinh vật gây bệnh cho chủ nghiên cứu (Phạm Quang Thu Trần Thanh Trăng năm 2002) [20] Để góp phần quản lý dịch bệnh hại keo Acacia có hiệu quả, khuôn khổ luận văn tốt nghiệp tiến hành nghiên cứu, điều tra chủng loại mật độ vi khuẩn nội sinh có hoạt tính đối kháng với nấm gây bệnh chủ cấp bệnh hại khác từ làm sáng tỏ vai trò vi khuẩn nội sinh việc bảo vệ chủ từ xâm nhiễm sinh vật gây bệnh ứng dụng chúng phòng trừ bệnh đốm lá, khô cành keo lai nấm Colletotrichum gloeosporioides (Penz.) Sacc gây hại Trên sở 1.1 Tình hình nghiên cứu giới Bệnh rừng bắt đầu nghiên cứu 150 năm nay, môn khoa học có nhiều cống hiến cho công tác nghiên cứu, phục vụ cho đời sống sản xuất thực tiễn Những năm thập kỷ 50 kỷ XX, nhiều nhà bệnh tập trung vào việc xác định loài, mô tả nguyên nhân gây bệnh điều kiện phát sinh, phát triển bệnh Đặc biệt nước nhiệt đới, Roger L (1953) [36] nghiên cứu loại bệnh hại rừng mô tả sách bệnh rừng nước nhiệt đới (Phytopathologie des pays chauds) Trong có số bệnh hại thông, keo, bạch đàn … John Boyce (1961) [30] xuất sách Bệnh rừng (Forest pathology) mô tả số bệnh hại rừng Cuốn sách xuất nhiều nước như: Anh, Mỹ, Canada 1.1.1 Nghiên cứu bệnh hại keo Roger L (1954) [36] nghiên cứu số bệnh hại keo Cây keo khô héo làm rụng tàn lụi từ xuống (chết ngược) loài nấm hại Glomerella cingulata (giai đoạn vô tính Collectotrichum gloeosporioides) nguyên nhân chủ yếu thiệt hại với loài Keo tai tượng Acacia mangium vườn giống Papua New Guinea (FAO, 1981) Tại Malaysia, theo nghiên cứu Lee (1993) [33] loài nấm gây hại tiến hành thực đề tài: “Nghiên cứu ứng dụng vi khuẩn nội sinh để phòng trừ bệnh đốm lá, với loài keo khác khô cành keo lai (Acacia auriculiformis x Acacia mangium) nấm Nhiều nhà nghiên cứu Ấn Độ, Malaysia, Philipin, Trung Quốc Colletotrichum gloeosporioides (Penz.) Sacc gây hại Lâm trƣờng Tam công bố nhiều loại nấm bệnh hại keo Roger L (1953) [36] Tại hội nghị lần thứ Thắng, huyện Thanh Sơn, Phú Thọ” III nhóm tư vấn nghiên cứu phát triển loài Acacia, họp Đài Loan Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn cuối tháng năm 1964 nhiều đại biểu kể tổ chức Quốc tế CIFOR đề cập đến vấn đề sâu bệnh hại loài keo Acacia Các nghiên cứu loại bệnh keo Acacia tập hợp Chanway (1996) [31] tiến hành phân lập định danh loài vi khuẩn sống mô thực vật loài thông: thông (Pinus radiata) thông đỏ (Thuija plicata) đầy đủ vào sách “Cẩm nang bệnh keo nhiệt đới Ôxtrâylia, Đông Nam Á L Araujo cộng (2002) tiến hành biện pháp phòng trừ sinh học Ấn Độ” tiếng Anh có tên A Manual of Diseases of Tropical Acacias việc sử dụng sản phẩm trao đổi chất vi khuẩn Bacillus sp., phân in Australia, South-east Asia and India (Old, K.M et al, 2000) [35] Cuốn sách lập từ mô thực vật Ông cộng sâu vào nghiên cứu loài vi khuẩn đề cập đến bệnh quen thuộc gặp nước ta bệnh phấn sống mô thực vật để tìm chất kháng sinh có khả kiềm chế trắng (powdery mildew), bệnh đốm lá, bệnh phấn hồng (pink disease) rỗng nguồn gây bệnh trồng phương pháp sinh học nhằm làm giảm bớt ruột (heart rot) tác động đến môi trường, người sử dụng nhiều chất hoá học để phòng trừ bệnh côn trùng gây hại cánh đồng Với 1.1.2 Nghiên cứu vi khuẩn nội sinh phương pháp nhóm ông phân lập tuyển chọn số chủng vi Đã có nhiều nhà khoa học sâu nghiên cứu vi khuẩn đặc biệt vi khuẩn sống nội sinh mô thực vật Phần lớn loài vi khuẩn nội khuẩn nội sinh lựa chọn giống cam, quýt nghiên cứu để tìm chất kháng sinh có hiệu lực cao việc phòng trừ nấm bệnh sinh có hoạt tính sinh học, tạo chất kháng sinh quan trọng để ngăn chặn Jinwi Kim (2000) [32] tách chất ức chế B-lactamase từ vi khuẩn sống xâm nhập sinh vật gây bệnh gây chủ, có lâm mô thực vật Tác giả phân lập tuyển chọn vi khuẩn sống mô nghiệp nông nghiệp Vì vậy, việc nghiên cứu sử dụng chủng vi khuẩn nội 25 loài thực vật khác phân lập 600 chủng vi khuẩn Trong sinh để bảo vệ trồng vấn đề quan trọng nhiều nước tìm 10 chủng có hiệu lực cao, KJ3, Z3, PQ, RV2, HL2, CL21, giới quan tâm PG5, GB5, GB18, AS3, S21 có khả chống lại hoạt động nấm Candida Năm 1955 giới tìm 500 chất kháng sinh 20 năm sau, albicans, lựa chọn chủng vi khuẩn Z3, RV2 có khả sinh năm 1975 tìm 5.000 chất kháng sinh Hiện nói chung chất kháng sinh -lactamase Chủng vi khuẩn Z3 lựa chọn để sản xuất với giới biết 13.000 chất kháng sinh sản xuất từ thiên nhiên quy mô lớn Chủng Z3 phân lập từ rễ gừng chống lại nấm C (Berdy 1984) Sau số công trình nghiên cứu tiêu biểu vi khuẩn nội albicans, không chống lại nấm Aspergillus nấm Fusarium sinh có khả sản sinh chất kháng sinh trình trao đổi chất dùng để phòng trừ bệnh hại trồng Miss Yuparet Puangmali (1999) [34] phân lập tuyển chọn số loài vi khuẩn sống mô cỏ có khả sản xuất chất kháng sinh Theo Willson (1995) vi khuẩn nội sinh vi khuẩn tiền nhân sống mô L- sparaginase Tác giả phân lập 657 loài vi khuẩn từ thân thực vật mà không gây bệnh cho chủ Vi khuẩn nội sinh tìm thấy thảo để sản xuất L-sparaginase Trong ông tìm 220 loài vi khuẩn nhiều loài giống loài vi khuẩn sống đất, nước như: có hiệu lực mạnh để thử nghiệm Nhóm vi khuẩn CMU - HB - 63, tạo chất Pseudomonas, Bacillus Azospirillum kháng sinh lớn môi trường; CMC 0.6% (w/v), KH2PO4 0.3% (w/v), Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn NaCl 0.05% (w/v), 1M MgSO4.7 H2O 0.2% (w/v), 0.1M CaCl2.2 H2O 0.1% với o pH = Sử dụng 0.2% số lượng vi khuẩn để tủ lắc nhiệt độ 45 C với tốc cảnh báo nguy gây hại lớn bệnh rừng trồng tập trung đề xuất định hướng nghiên cứu độ 175 vòng/phút vòng 48 Vi khuẩn hoạt động để sinh chất Dự án mang tên “Giảm thiểu tác động bệnh bạch đàn vùng Đông kháng sinh L - Asparaginase 50.24 mU/ml hoạt động có hiệu 202.58 Nam Á” ACIAR PN 9441 Trung tâm Nghiên cứu Nông nghiệp Quốc tế mU/ml Đã ứng dụng cách tiêm chủng vi khuẩn vào để xúc tiến Ôxtrâylia (ACIAR) tài trợ bắt đầu triển khai Việt Nam, Thái Lan sinh trưởng kiểm soát bệnh Các thí nghiệm ông với cà chua Ôxtrâylia Dự án Viện Khoa học Lâm nghiệp triển khai Việt Nam Cho dưa chuột đem lại hiệu ức chế số loại mầm bệnh giảm mức độ tới kết thúc dự án vào cuối năm 2000, dự án đặt móng cho định bị bệnh Mầm bệnh ông sử dụng nghiên cứu bao gồm: Pythium ultimum, hướng nghiên cứu bệnh mở đầu nghiên cứu chọn giống bạch đàn Rhizoctonia, Fusarium oxysporum, Pseuodomonas syringe, Colletotrichum kháng bệnh nước ta Bước đầu dự án tìm hiểu loài nấm hại, điều orbiculore, Erwinia teracheiphila thể khảm virus dưa chuột tra đánh giá mức độ nhiễm bệnh ảnh hưởng loài, xuất xứ Nhận xét: gia đình nấm hại Tuy nhiên việc xác định, tuyển chọn loài, Việc sử dụng vi sinh vật để phòng trừ bệnh giới nghiên xuất xứ kháng bệnh bước tuyển chọn gia cứu áp dụng sản xuất đạt hiệu cao Đã có nhiều nhà khoa học đình dòng kháng bệnh mục tiêu lâu dài cần đầu tư Các kết sâu nghiên cứu vi khuẩn đặc biệt vi khuẩn sống nội sinh mô bước đầu dự án thông báo Hội thảo dự án bệnh bạch đàn thực vật Các nhà khoa học tìm thấy số loài vi khuẩn nội sinh có hoạt tổ chức vào tháng 11 năm 2000 TP Hồ Chí Minh (Nguyễn Hoàng tính sinh học cao, tạo chất kháng sinh quan trọng để ngăn chặn xâm nhập Nghĩa (2000); Phạm Quang Thu (2000) sinh vật gây bệnh gây chủ, có lâm nghiệp, nông Cho tới năm 1980, Keo tràm loài keo trồng rộng rãi nghiệp ăn Bằng phương pháp sinh học làm giảm bớt tác động tỉnh phía Nam Hiện Vườn thực vật Trung tâm Khoa xấu đến môi trường, người sử dụng nhiều chất hoá học học Sản xuất Lâm nghiệp Đông Nam Bộ nằm địa phận thị trấn Trảng Bom, để phòng trừ bệnh côn trùng gây hại huyện Thống Nhất, tỉnh Đồng Nai tồn hai hàng Keo tràm trồng 1.2 Tình hình nghiên cứu nƣớc từ đầu năm 1960, thuộc loại lớn tuổi nước ta (Nguyễn Hoàng 1.2.1 Nghiên cứu bệnh hại rừng Nghĩa, 1992) Cây có chiều cao khoảng 20 m đường kính 40 - 60 Vào cuối năm 1980 đầu năm 1990, bệnh dịch cháy lá, chết cm Cây to có đường kính đạt tới 80 cm, chí có hai thân, thân bạch đàn (die - back) xuất diện rộng mối đe dọa lớn cho có đường kính 50 cm Sau này, loài keo trở nên quen thuộc nhà trồng rừng khắp nước, đặc biệt vùng Đông Nam Bộ miền chương trình trồng rừng tỉnh phía Bắc Trung (Quảng Nam, Đà Nẵng Huế) Từ đầu năm 1980 trở lại đây, nhiều loài keo nhập thử Nguyễn Hoàng Nghĩa (1997) [12] cho thấy diện tích rừng bạch đàn bị nghiệm nước ta Keo tai tượng (A mangium), Keo liềm (A nấm công lên tới 50% tổng diện tích, với mức độ hại khác crassicarpa), Keo đa thân (A aulacocarpa), Keo bụi (A cincinnata), Keo sim Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn (A holosericea) sau keo lai tự nhiên phát chủ động lai Phạm Quang Thu (2002) [19], [20] sử dụng vi sinh vật nội sinh thực vật có khả ức chế phát triển nấm gây bệnh rừng nghiên cứu tạo (Sedgley et al., 1992) Mùa xuân năm 1990, xuất xứ Keo tai tượng Keo tràm gieo Việt Nam từ năm 2002, tác giả sâu vào nghiên cứu khả tương tác vườn ươm Chèm, Từ Liêm, Hà Nội bị bệnh phấn trắng với mức độ khác vi sinh vật có khả ức chế sinh vật gây bệnh với loài sinh vật đặc Nhìn bề ngoài, keo bị rắc lớp phấn trắng hay vôi bột Mức độ thù khác vi sinh vật phân giải lân, vi sinh vật kích thích sinh trưởng, vi bệnh đánh giá qua quan sát mắt thường xếp theo thứ tự sinh vật cố định đạm hội sinh cộng sinh, vi sinh vật đối kháng với nấm gây nặng hay nhẹ Nhìn chung bệnh chưa gây nên ảnh hưởng lớn tới sinh trưởng bệnh để tạo chế phẩm hỗn hợp gọi “phân vi sinh chức năng” Phân vườm ươm điều kiện để tìm hiểu sâu vi sinh chức nghiên cứu sản xuất thử cho đối tượng nguồn gốc bệnh vấn đề có liên quan (Nguyễn Hoàng Nghĩa, 1997) [12] trồng như: Bông, Đậu, Cà chua, Điều số khác Một vài năm gần diện tích gây trồng keo tăng lên đáng kể (gần keo, Thông nhựa, Thông mã vĩ 230.000 vào cuối năm 1999) xuất bệnh rừng trồng Tại Đạ Phạm Quang Thu, Trần Thanh Trăng (2002) [20] phân lập tuyển chọn Tẻh (Lâm Đồng) Keo tai tượng trồng loài diện tích 400 có vi khuẩn đối kháng với nấm gây bệnh thông vườn ươm, với 12 loài 118,5 bị bệnh với tỷ lệ từ - 59% có số diện tích bị nặng dùng làm mẫu để phân lập vi khuẩn phân lập 70 chủng vi khuẩn (Phạm Quang Thu, 2002) [21] Tại Bầu Bàng, Bình Dương số dòng keo lai khác tuyển chọn 11 chủng vi khuẩn có hiệu lực đối kháng với bị mắc bệnh phấn hồng (Pink Disease) với tỷ lệ mắc mức độ bệnh cao nấm gây bệnh thối cổ rễ Fusarium oxysporum gây thiệt hại cho sản xuất Tại Kon Tum năm 2001 có khoảng 1000 rừng keo Nguyễn Hoàng Nghĩa, Phạm Quang Thu, 2006 [13] Vai trò vi khuẩn lai tuổi bị nhiễm bệnh loét thân, thối vỏ dẫn đến khô Tỷ lệ nặng nội sinh chế kháng bệnh loét thân, cành nấm Colletotrichum Ngọc Tụ, Ngọc Hồi (Kon Tum) lên đến 90% số bị chết [18] gloeosporioides (Penz.) Sacc gây bệnh hại keo lai 1.2.2 Nghiên cứu biện pháp phòng trừ sinh học Nhận xét: Biện pháp phòng trừ loại nấm bệnh chế phẩm sinh học có Việc sử dụng vi sinh vật để phòng trừ bệnh trồng Việt Nam nguồn gốc từ nấm vi khuẩn nhiều nhà khoa học nước nghiên cứu áp dụng sản xuất hệ thống biện pháp phòng trừ nghiên cứu áp dụng Nguyễn Lân Dũng, Phạm Văn Ty Lê Mai Hương tổng hợp Việc phân lập, tuyển chọn chủng có hiệu lực cao sử dụng chúng (1998) [5] sử dụng xạ khuẩn để phòng chống bệnh thối cổ rễ thông phòng trừ bệnh rừng nghiên cứu áp dụng vào sản xuất vườn ươm nấm Fusarium oxysporum gây Phạm Văn Mạch (1991) [8] Nghiên cứu sâu vào việc phân lập xác định vi khuẩn nội sinh keo công trình nghiên cứu sử dụng chủng Tricoderma spp., xạ lai trồng Phú Thọ thí nghiệm sử dụng vi khuẩn nội sinh phòng trừ khuẩn Streptomyces spp để phòng chống bệnh thối cổ rễ thông vườn bệnh đốm lá, khô cành nấm Colletotrichum gloeosporioides (Penz.) ươm Tuy nhiên nghiên cứu dừng lại thí nghiệm Sacc gây hại chủng nấm xạ khuẩn phân lập từ đất Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Bào tử có hình trứng nhỏ màu xám, thể sinh dưỡng màu da cam, màu xám khuẩn phân bố không đồng (Hình 4.12b) dần đến ngày thứ ngừng, từ ngày trở sợi nấm gần khuẩn bị tiêu diệt tạo thành tam giác (Hình 4.14a) Bào tử khuẩn X1.1 có hình thon dài đầu nhọn, có vách ngăn 4.3.3.6 Chủng X02 Chủng vi khuẩn X02 phân lập từ phần gỗ chủ Khuẩn có màu xám màu nâu nhạt (Hình 4.14b) nhạt, hình tròn, bề mặt nhẵn bóng, mép tương đối phẳng Nấm gây bệnh vài ngày đầu cấy sinh trưởng nhanh phía hộp lồng Vài ngày sau nấm sinh trưởng chậm dần, cuối bị tiêu diệt phần gần khuẩn nội sinh tạo thành vòng ức chế hình tam giác lệch phía bên phải a b Hình 4.14(a,b): Khuẩn bào tử X1.1 đối kháng với nấm Colletotrichum gloeosporioides (Penz.) Sacc 4.4 Đánh giá mối quan hệ vi khuẩn nội sinh với chủ cấp bị bệnh khác để tìm hiểu chế a b Qua kết nghiên cứu số lượng chủng khuẩn ức chế với nấm gây bệnh Hình 4.13(a,b): Khuẩn bào tử X02 đối kháng với nấm Colletotrichum gloeosporioides (Penz.) Sacc Bào tử vi khuẩn hình hạt gạo, màu trắng đục phân bố không đồng mật độ chúng có đơn vị khối lượng vị trí khác chủng khuẩn có hiệu lực khác nhau, bước đầu có nhận xét sau: - Cây không bị bệnh có số chủng loại vi khuẩn nhiều bị bệnh Cây bị bệnh mức độ hại nặng nặng phân lập vi khuẩn nội sinh (Hình 4.13b) mật độ có khả ức chế nấm gây bệnh đốm lá, khô cành 4.3.3.7 Chủng khuẩn X1.1 keo lai Chủng khuẩn X1.1 phân lập từ phần gỗ bị bệnh nhẹ (cấp 1) Khuẩn có màu xám, bề mặt khuẩn có nhiều nếp nhăn, mép tương đối Nấm gây bệnh ngày đầu ngày thứ phát triển nhanh sau chậm - Các chủng vi khuẩn nội sinh có khả ức chế nấm gây bệnh, có tất phận song số lượng chủng phần vỏ nhiều Các chủng vi khuẩn sinh sống phần tượng tầng phần gỗ khả ức chế nấm 46 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 47 http://www.lrc-tnu.edu.vn Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Colletotrichum gloeosporioides (Penz.) Sacc thấp việc bảo vệ chống xâm nhiễm nấm gây bệnh Bảng 4.06: Mật độ tế bào chủng khuẩn có hiệu lực cao STT - Mật độ tế bào hữu hiệu chủng vi khuẩn ức chế nấm gây bệnh Mật độ khuẩn theo thời gian Chủng khuẩn 24 TB1 48 TB3 B01 10.10 4,21.10 12.10 2,52.10 14.10 1,6.106 bị bệnh) có mật độ vi khuẩn cao bị bệnh B02 10.104 4,21 103 12.105 2,52.104 13.107 1,82 106 Những kết nghiên cứu bước đầu cho thấy mối quan hệ vi B03 12.104 5,04.103 13.105 2,73 104 14,5.107 2,15 106 khuẩn nội sinh với nấm gây bệnh Sản phẩm trình trao đổi chất vi khuẩn P01 8.104 3,38.103 9.105 1,9 104 10.107 1,4 106 nội sinh ức chế nấm gây bệnh hợp chất thân chủ ngăn X01 7.104 2,96.103 8.105 1,69 104 8.107 1,13 106 cản không cho nấm ký sinh gây bệnh xâm nhập phát triển thể X02 7.104 2,96.103 8.105 1,69 104 8.107 1,13 106 X11 7.104 2,96.103 8.105 1,69 104 8.107 1,13 106 khuẩn nội sinh để phòng trừ bệnh cho trồng Dịch sinh khối vi khuẩn 72 Kết nghiên cứu có ý nghĩa lớn thực tiễn sử dụng vi TB2 có khác chủ có cấp bị bệnh khác Cây khoẻ (không chủ Từ kết Bảng 4.06 ta thấy thời gian lắc ảnh hưởng tới mật độ khuẩn nhiều, mật độ khuẩn biến động 7.104 - 14,5.107 Mật độ khuẩn tăng nhân lên từ chủng có hiệu lực kháng nấm bệnh cao đưa vào gỗ lên theo thời gian lắc Mật độ tăng nhanh vòng 24 giờ, từ 24 đến 48 phần vỏ phần tượng tầng, từ phận dẫn truyền vi khuẩn nấm mật độ sinh trưởng bình thường, từ 48 đến 72 mật độ tăng bệnh khắp quan tạo mạng lưới bảo vệ Vì phần trung bình/giờ giảm dần vỏ phần tượng tầng hai quan sinh trưởng dễ bị tổn thương nhất, Qua bảng ta thấy mật độ chủng khuẩn B03 sau 72 đạt bị bệnh vật gây bệnh thường xâm nhập qua hai quan này, làm (14,5.107) sau chủng B01, B02 đạt 14.107, 13.107 cho bị bệnh 4.5.2 Thử nghiệm hiệu lực kháng nấm bệnh khuẩn nội sinh 4.5 Ứng dụng vi khuẩn nội sinh phòng chống bệnh đốm lá, khô cành phòng thí nghiệm keo lai Thử nghiệm hiệu lực kháng nấm bệnh chủng vi khuẩn nội sinh thông qua gây bệnh nhân tạo phòng thí nghiệm Nhúng keo cành 4.5.1 Nhân sinh khối sản xuất chế phẩm Nhân sinh khối loại khuẩn riêng biệt chủng khuẩn nội sinh (B01, B02, B03, P01, X01, X02, X1.1) môi trường lỏng PD non keo lai vào dung dịch chủng vi khuẩn có hiệu lực kháng nấm sau khoảng 30 phut phun nấm bệnh vào Theo dõi mức độ bị bệnh công Lấy khuẩn cho vào môi trường PD sau lắc với tốc độ 200 vòng/phút thức thí nghiệm phòng thí nghiệm Viện khoa học Lâm nghiệp Việt Nam 280 C 24 giờ, 48 72 Đếm số lượng khuẩn lạc thu từ từ ngày 03/04/2008 đến ngày 09/04/2008, kết thu kết Bảng 4.07 hộp lồng tính theo CFU/ml (CFU chữ viết tắt từ tiếng Anh: Colony Forming Unit) ghi Bảng 4.06 48 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 49 http://www.lrc-tnu.edu.vn Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Bảng 4.07: Hiệu lực kháng nấm gây bệnh chủng khuẩn nội sinh STT Ký hiệu 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 Mức độ bị bệnh theo thời gian (R%) chủng Sau ngày Sau ngày Sau ngày B01 11,25 20,00 30,00 B02 15,00 29,50 37,50 B03 0 P01 7,50 15,00 22,50 X01 17,50 26,25 40,00 X02 5,00 12,50 25,00 X11 25,00 33,50 53,50 Đối chứng 61,25 78,25 92,50 R Sau ngày Sau ngày Sau ngày B01 B02 B03 P01 X01 X02 X11 ĐC Hình 4.15: Mức độ ức chế nấm bệnh chủng khuẩn Sau số hình ảnh gây bệnh nhân tạo phòng thí nghiệm Từ Bảng 4.07 cho thấy: Mức độ bị bệnh chủng khuẩn (trừ chủng B03) tăng dần theo thời gian Tất chủng so với đối chứng có khả ức chế nấm chủng khuẩn B03, có khả ức chế phát triển nấm gây bệnh tốt gây bệnh nhân tạo phòng thí nghiệm, mức độ bị bệnh thấp sau 2, 4, ngày là: 0; (theo thứ tự) a Chủng khuẩn P01 mức độ bị bệnh thấp sau 2,4,6 ngày theo dõi thu đươc b Chủng khuẩn B01 Chủng khuẩn B02 kết sau: 7,5%; 15% ; 22,5% mức độ bị bệnh tăng dần ngày Chủng khuẩn X02 mức độ bị bệnh thấp sau 2,4,6 ngày theo dõi thu đươc kết sau: 5%; 12,5% ; 25% Riêng chủng X01, B01, B02 X1.1 khả ức chế nấm gây bệnh hơn, dẫn đến mức độ bị bệnh cao sau ngày theo dõi kết thu 40%; 30%; 37,5%; 53,50% (theo thứ tự) Kết thể rõ qua sơ đồ c (Hình 4.15) d Chủng khuẩn B03 Chủng khuẩn B01, B02, B03 Hình 4.16(a,b,c,d): Khả ức chế chủng khuẩn B01, B02, B03 50 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 51 http://www.lrc-tnu.edu.vn Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Công thức tiêm 15 ml dung dịch vi khuẩn Công thức tiêm 20 ml dung dịch vi khuẩn Công thức tiêm 10 ml nước cất Thử nghiệm hiệu lực vi khuẩn vườn ươm tiến hành với chủng khuẩn theo dõi chúng vòng 60 ngày ta thu kết Bảng 4.08 b a Chủng khuẩn P01 Chủng khuẩn X1.1 Hình 4.17 (a,b): Khả ức chế chủng khuẩn P01 X1.1 a b Chủng khuẩn X01 Chủng khuẩn X02 Hình 4.18 (a,b): Khả ức chế chủng khuẩn X01 X02 Từ kết Bảng 4.07 Hình 4.15 ta chọn chủng khuẩn có hiệu lực cao nhất: B03, P01 X02 để tiến hành thí nghiệm gây bệnh nhân tạo giai đoạn vườn ươm 4.5.3 Thử nghiệm hiệu lực vi khuẩn nội sinh giai đoạn vƣờn ƣơm Từ kết gây bệnh nhân tạo phòng thí nghiệm chọn chủng khuẩn có hiệu lực ức chế nấm cao để đem ứng dụng vào giai đoạn vườn ươm với công thức Công thức tiêm ml dung dịch vi khuẩn Công thức tiêm 10 ml dung dịch vi khuẩn 52 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 53 http://www.lrc-tnu.edu.vn Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Bảng 4.08: Hiệu lực kháng nấm gây bệnh vi khuẩn nội sinh P%, R% đến keo lai giai đoạn vườn ươm STT Công Ký hiệu thức chủng 70 P% R% H (cm) 60 D g (mm) 50 40 B03 12,50 13,50 49,20 4,90 P01 20,50 19,25 48,60 4,80 X02 23,00 17,25 51,00 4,70 10 B03 21,00 18,00 49,90 5,00 P01 16,00 19,00 49,50 5,00 X02 18,00 20,00 49,40 5,10 B03 0 53,00 5,50 CT1 CT2 CT3 30 P% 20 R% B03 P01 X02 B03 P01 X02 B03 P01 X02 B03 P01 X02 ĐC CT1 CT2 CT3 CT4 Chủng khuẩn CT5 P01 15,30 17,50 50,80 5,20 X02 18,10 17,50 51,00 5,00 10 B03 8,00 10,50 51,50 5,00 P01 14,30 20,50 48,80 4,90 Mức độ ảnh hưởng chủng khuẩn tác động đến sinh trưởng X02 19,40 14,00 50,00 5,10 qua chiều cao vút ( H vn) đường kính cổ rễ ( D g) biểu đồ (Hình 4.22) ĐC 59,30 53,25 45,40 4,70 cho thấy tất chủng sinh trưởng nhanh so với đối chứng Hvn 11 CT4 12 13 CT5 Hình 4.19: Ảnh hưởng khuẩn nội sinh đến tỷ lệ bị bệnh mức độ bị bệnh keo lai giai đoạn vườn ươm Dg có chủng B03 sinh trưởng nhanh Từ Bảng 4.08 ta thấy tất chủng khuẩn có khả ức chế nấm gây bệnh (tỷ lệ bị bệnh mức độ bị bệnh thấp nhiều so với công thức đối chứng) Các chủng khuẩn có tác dụng kích thích sinh trưởng giai đoạn vườn ươm (chiều cao đường kính gốc tăng so với đối chứng) Qua Bảng 4.08 sử dụng phần mềm SPSS để sử lý số liệu, chủng B03 chủng có khả ức chế phát triển nấm gây bệnh tốt thử nghiệm hiệu lực vi khuẩn vườn ươm mức độ bị bệnh tỷ lệ bị bệnh công Dg 56 (mm) Hvn (cm) Hvn (cm) 54 54 52 50 48 46 44 42 40 52 50 48 Dg 46 44 B03 P01 X02 B03 P01 X02 B03 P01 X02 B03 P01 X02 ĐC 42 B03 P01 X02 B03 P01 X02 B03 P01 X02 B03 P01 X02 ĐC a thức thấp (0) (Hình 4.19) CT1 CT2 CT3 CT4 b CT5 CT1 CT2 CT3 CT4 CT5 Hình 4.20(a,b): Ảnh hưởng chủng khuẩn đến chiều cao đường kính gốc keo lai giai đoạn vườn ươm 54 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 55 http://www.lrc-tnu.edu.vn Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Bảng 4.09: Ảnh hưởng vi khuẩn nội sinh đến keo lai tuổi Kết thử nghiệm chủng khuẩn vườn ươm ta so sánh qua bảng 4.08 biểu đồ (Hình 4.19 Hình 4.20) ta lựa chọn chủng khuẩn B03 có mức độ bị bệnh, tỷ lệ bị bệnh bị thấp sinh trưởng chiều cao, đường kính gốc đạt giá trị cao (Hình 21) Đây sở để lựa chọn chủng B03 thử nghiệm ứng dụng giai đoạn rừng trồng tuổi (Hình 4.21) STT Công thức P% R% H VN D 1.3 M (m) (cm) (kg) (kg) tươi M khô CT1 21,32 47,25 3,20 3,60 3,10 1,43 CT2 13,00 28,75 3,60 3,80 3,50 1,61 CT3 4,00 5,00 4,90 4,00 4,57 2,10 CT4 19,00 22,5 3,80 3,70 4,33 1,99 ĐC 65,13 76,25 3,00 3,10 2,60 1,20 Từ Bảng 4.09 thấy tỷ lệ bị bệnh mức độ bị bệnh chủng khuẩn B03 công thức thấp ( P = 4%, R = 5% công thức đối chứng tỷ lệ bị bệnh mức độ bị bệnh cao ( P = 65,13%, P = 76,25%) Điều chứng tỏ chủng khuẩn B03 có tác dụng tốt việc phòng trừ bệnh dùng liều lượng thích hợp (30 ml/cây) chủ phát huy tác dụng cách tôt Ở công thức 1, 2, chủ chưa phát huy hết khả kháng bệnh (công thức 1: P = 21,32%, R = 47,25%; công thức 2: P = 13%, R = 28,75%; công thức 4: P = 19%, R = 22,5%) Hình 4.21: Ảnh hưởng khuẩn nội sinh đến keo lai giai đoạn vườn ươm 4.5.4 Ảnh hƣởng vi khuẩn nội sinh đến keo lai giai đoạn rừng Để so sánh công thức chủng B03 ta xem Hình 4.23 ta thấy khác biệt rõ tỷ lệ bị bệnh mức độ bị bệnh non (1 tuổi) Qua kết thử nghiệm chủng khuẩn giai đoạn vườn ươm ta tìm chủng khuẩn B03 có khả ức chế bệnh tốt kích thích sinh trưởng thông qua chiều cao, đường kính gốc Ta tiếp tục thử nghiệm ứng dụng chủng B03 giai đoạn rừng trồng năm tuổi thu kết Bảng 4.09 56 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 57 http://www.lrc-tnu.edu.vn Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 90 Chủng khuẩn B03 có tác dụng kích thích sinh trưởng cho chủ sinh 80 khối, chiều cao, đường kính gốc Qua Bảng 4.09 sử dụng phần mềm SPSS để sử 70 lý số liệu ta thấy công thức phát huy tác dụng tốt ( H = 4,90 m, D 1.3 = 60 cm) chủ việc sinh trưởng làm tăng sinh khối tươi 50 P% R% 40 30 khô ( M tươi = 4,57 kg/cây, M khô = 2,1 kg Trong công thức đối chứng khả sinh trưởng thấp nhiều so với công thức ( H = m; D g = 3,1cm; M tươi = 2,6 kg/cây; M khô = 1,2 kg/cây) 20 Nhận xét: 10 Hầu hết chủng khuẩn có khả ức chế nấm Colletotrichum CT1 CT2 CT3 CT4 gloeosporioides (Penz.) Sacc Chủng B03 có khả ức chế nấm kích thích ĐC sinh trưởng cho cách tốt so với đối chứng, phương pháp Hình 4.22: Ảnh hưởng khuẩn nội sinh đến tỷ lệ bị bệnh mức độ phòng chống bệnh hay giảm chi phí tới mức tối thiểu, không gây ô nhiễm môi trường, dế sử dụng bị bệnh keo lai giai đoạn rừng tuổi Việc áp dụng khuẩn nội sinh phòng trừ bệnh đốm lá, khô cành keo lai nấm Colletotrichum gloeosporioides (Penz.) Sacc diện rộng Hvn, D1.3 cách phun giai đoạn vườn tiêm giai đoạn rừng trồng khả thi khuẩn nội sinh, sinh sản nhanh môi trường thích hợp Chúng có Hvn (m) thể lan tỏa phận chạm vào như: rễ, thân cành D1.3 (cm) Mtươi (kg) Mkhô (kg) Công thức CT1 CT2 CT3 CT4 CT5 Hình 4.23: Ảnh hưởng thể tích dịch khuẩn đến giai đoạn rừng non tuổi 58 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 59 http://www.lrc-tnu.edu.vn Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn nấm bệnh, có chủng vi khuẩn có hiệu lực cao (B01, B02, X02, X1.1)) Chương KẾT LUẬN - TỒN TẠI VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 Kết luận Cây bị bệnh trung bình (cấp bị bệnh 2) phân lập chủng vi khuẩn, chủng có khả kháng nấm có chủng có hiệu lực cao (X1.1) Cây bị bệnh nặng (cấp bị bệnh 3) phân lập chủng vi khuẩn, chủng có khả 5.1.1 Nấm gây bệnh đốm lá, khô cành keo lai Phú Thọ xác ức chế với hiệu lực Cây bị bệnh nặng (cấp bị bệnh 4) phân lập định Colletotrichum gloeosporioides (Penz.) Sacc., thuộc chi nấm bào tử đĩa chủng vi khuẩn chủng có hiệu lực kháng nấm bệnh gai Colletotrichum; họ nấm đĩa : Melanconiaceae, ngành phụ nấm bất toàn 5.1.6 Phân bố vi khuẩn nội sinh chủ yếu phần vỏ phần tượng tầng Deuteromycetes Giai đoạn hữu tính nấm gây bệnh xuất tổ chiếm tỷ lệ là: 43,33%; 30% phần gỗ chiếm tỷ lệ thấp 26,67% chức bị bệnh xác định nấm Glomerella cingulata (Stonem.) Spauld.& 5.1.7 Mật độ tế bào chủng khuẩn có khả ức chế nấm gây bệnh có Schrenk.; thuộc chi Glomerella; họ Phyllachoraceae; Phyllachorales; lớp chủ nằm mức 1.105 - 13.105 CFU/1 gam Cây không bị bệnh (cây khoẻ) có số Sordariomycetes; ngành phụ Pezizomycotina lượng vi khuẩn cao so với chủ bị bệnh mức độ nhẹ trung bình Những 5.1.2 Bào tử vô tính có dạng hạt gạo thuôn dài (bên bào tử có màu hồng), chủng khuẩn có đường kính vòng ức chế lớn 20mm thường chủng có kích thước: chiều dài từ 11,8 m đến 16,38 m, chiều rộng 3,26 m đến 4,78 m Bào tử túi đơn bào hình bầu dục, bên vỏ túi có bào tử túi 5.1.3 Tốc độ sinh trưởng hệ sợi nấm bệnh nuôi môi truờng dinh dưỡng PDA Sau 24 đường kính khuẩn lạc đạt 8,35 mm, sau 48 đường kính khuẩn lạc đạt 18,50 mm; sau 72 đường kính khuẩn lạc đạt 23,19 mm 5.1.4 Kết luận tỷ lệ mức độ bị bệnh mật độ cao (7.105 - 13.105 CFU/ 1gam) 5.1.8 Sử dụng chủng vi khuẩn B03 với liều lượng 30 ml dung dịch vi khuẩn mật độ - 13.105CFU/ml tiêm trực tiếp vào thân có tác dụng tốt việc phòng chống bệnh đôm khô cành, keo lai nấm Colletotrichum gloeosporioides (Penz.) Sacc.gây hại 5.1.9 Cây keo lai giai đoạn vườn ươm giai đoạn rừng non tuổi tiêm dung dịch vi khuẩn chủng B03 với thể tích dung dịch 30 ml tôt Tỷ lệ bị hại trung bình rừng trồng keo lai Lâm trường Tam Thắng 44,17%, mức độ bị hại trung bình (29,10%), số tổn thất DI = 0,129 ) chứng tỏ diện tích rừng trồng keo lai Lâm trường bị bệnh nặng dẫn đến tổn sinh trưởng Các tiêu chiều cao, đường kính ngang ngực , trọng lượng tươi trọng lượng khô thí nghiệm tăng so với công thức đối chứng Vậy trình sử dụng vi khuẩn nội sinh có tác dụng tốt việc thất lớn mặt kinh tế phòng trừ bệnh kích thích sinh trưởng đường kính, chiều cao, trọng 5.1.5 Vi khuẩn nội sinh keo lai có vai trò kháng bệnh đốm khô cành lượng tươi trọng lượng khô so với đối chứng nấm Colletotrichum gloeosporioides Phân lập 30 chủng vi khuẩn Đây kết bước đầu có triển vọng lớn cho nghành Lâm nghiệp keo lai không bị bệnh (cấp bị bệnh 0) phân lập 10 chủng vi nước nhà việc phòng trừ bệnh việc ứng dụng công nghệ sinh học làm khuẩn 10 chủng có hoạt tính kháng nấm bệnh có chủng vi tăng sức đề kháng, kích thích sinh trưởng cây, giảm chi phí không gây ô khuẩn có hiệu lực cao (B01, B02, B03, P01, X01, X02) Cây bị bệnh nhe (cấp bị nhiễm môi trường bệnh 1) phân lập chủng khuẩn có tất chủng có khả kháng 60 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 61 http://www.lrc-tnu.edu.vn Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 5.2 Tồn kiến nghị TÀI LIỆU THAM KHẢO Do thời gian nhiều hạn chế nên việc nghiên cứu định loại chủng vi Tiếng Việt Bộ Nông nghiệp khuẩn có hiệu lực chưa tiến hành Qua thực tập, nghiên cứu vi khuẩn sống mô thực vật để phòng trừ bệnh đốm lá, khô cành thấy lĩnh vực nghiên cứu nước Vì vậy, cần phải có nghiên cứu bổ sung thử nghiệm phạm vi PTNT (2001), Chiến lược phát triển Lâm nghiệp Việt Nam giai đoạn 2001 - 2010, Hà Nội Cục thống kê Phú Thọ (2005), Niên giám thống kê 2005 huyện Thanh Sơn Lê Đình Khả (2004) Kết nghiên cứu khoa học chọn giống rừng Nhà xuất Nông nghiệp, Hà Nội rộng Nguyễn Lân Dũng (1982), Vi sinh vật học, (Tập I – II), Nxb Khoa học, Hà Nội Nguyên Lân Dũng, Phạm Văn Ty Lê Mai Hương (1998), Vi sinh vật học, Nxb Giáo Dục, Hà Nội Nguyễn Lân Dũng, Bùi Xuân Đồng, Lê Đình Lương (1982), Vi nấm, Nxb Khoa học, Hà Nội Nguyễn Lân Dũng (2002), Công nghệ nuôi trồng nấm, Nxb Nông Nghiệp, Hà Nội Phạm Văn Mạch (1991), Góp phần nghiên cứu bệnh thối nhũn (Damping-off) thông nhựa thông caribe số vùng miền Bắc Việt Nam, Luận án PTS KHNN, Hà Nội Trần Văn Mão (2002), Sử dụng vi sinh vật có ích, Nxb Nông nghiệp, Hà Nội 10 Trần Văn Mão (2001), Một số loài sâu bệnh nguy hiểm hại quế Việt Nam giải pháp phòng trừ (Báo cáo chuyên đề) 11 Trần Văn Mão (2003), Tình hình sâu bệnh hại keo, Thông bạch đàn phục vụ cho nguyên liệu giấy Kon Tum (Báo cáo chuyên đề) 12 Nguyễn Hoàng Nghĩa (1997), Kết nghiên cứu khoa học chọn giống rừng Báo cáo khoa học, Viện khoa học lâm nghiệp Việt Nam 13 Nguyễn Hoàng Nghĩa, Phạm Quang Thu, (2006) Vai trò vi khuẩn nội sinh chế kháng bệnh loét thân, cành nấm Colletotrichum gloeosporioides (Penz.) Sacc gây bệnh hại keo lai 62 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 63 http://www.lrc-tnu.edu.vn Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 14 Nguyễn Hoàng Nghĩa (2006), Chọn giống kháng bệnh có suất cao cho 25 Nguyễn Hải Tuất (2003), Tài liệu hướng dẫn sử dụng SPSS 10.0 For Bạch đàn keo (Báo cáo khoa học), Viện khoa học Lâm nghiệp Windows để sử lý số liệu nghiên cứu thực nghiệm Lâm nghiệp, Trường 15 Nguyễn Hoàng Nghĩa (2006), Lâm nghiệp Việt Nam (Báo cáo khoa học), đại học Lâm nghiệp Viện khoa học Lâm nghiệp 26 Nguyễn Hải Tuất (2003), Xử lý thống kê kết nghiên cứu thực 16 Nguyễn Hoàng Nghĩa, Phạm Quang Thu Nguyễn Văn Chiến (2007) Báo nghiệm Lâm nghiệp, Trường đại học Lâm nghiệp cáo công nhận giống dòng Bạch đàn, keo lai Keo tràm chống chịu 27 Nguyễn Hải Tuất, Nguyễn Trọng Bình (2005), Khai thác sử dụng SPSS bệnh có suất cao Bộ NN&PTNT - Viện KHLN Việt Nam Hà Nội để xử lý số liệu nghiên cứu Lâm nghiệp, Nxb Nông nghiệp, Hà Nội 17 Phạm Quang Thu (1998), Nghiên cứu số đặc điểm nấm Lim 28 Nguyễn Hải Tuất (2006), Phân tích thống kê Lâm nghịêp, Nxb Nông Ganoderma lucidum Karet vùng Đông Bắc, Việt Nam, Kết nghiên cứu nghiệp, Hà Nội khoa học nghiên cứu sinh, Nxb Nông nghiệp, Hà Nội 29 Vụ khoa học công nghệ chất lượng sản phẩm (2001), Văn tiêu chuẩn 18 Phạm Quang Thu, Nguyễn Văn Độ (2001), “ Tình hình sâu, bệnh hại số kỹ thuật Lâm sinh, Tập I-II, Nxb Nông nghiệp, Hà Nội loài trồng rừng định hướng nghiên cứu lĩnh vực bảo vệ thực Tiếng nƣớc vật rừng “ Tạp chí Nông nghiệp ” PTNT Tr.827-828-829 30 John Boyce (1961), Forest pathology, New York, Toronto, London 19 Phạm Quang Thu (2002), Bước đầu nghiên cứu bệnh khô héo Thông ba 31 Chanway (1996), Endophytes: They are not just fungi Canadian Journal of tuyến trùng Lâm đồng, Thông tin KHKT Lâm nghiệp số 2/2002 Botany 74: 321-322 20 Pham Quang Thu, Trần Thanh Trăng (2002), Phân lập tuyển chọn vi 32 Jinwi Kim (2000), isolation and purification of antifulgal compound and khuẩn đối kháng với nấm gây bệnh vùng rễ trồng Thông con, Thông tin lactamase inhibitor from endophytic bacteria MS thesis, SNU KHKT Lâm nghiệp số 3/2002 33 Lee (1993) Acacia mangium growing and utilization, Kuala Lumpur, 21 Phạm Quang Thu (2002), “ Một số biện pháp phòng trừ, quản lý bệnh hại Malaysia Keo tai tượng Lâm trường Đạ Tẻh - Lâm Đồng” Tạp chí Nông nghiệp 34 Miss Yuparet Puangmali (1999) Isolation and selection of some Herbal PTNT số 6/2002, Tr 532 - 533 Endophytic Bacteria Capable of Producing L-Asparaginase 22 Phạm Quang Thu (2003), Bệnh hại số loài trồng Việt Nam, (http://www.grad.cmu.ac.th/abstract/1999/sci/abstract/sci990064.html) Bài giảng chuyên môn hoá, Trường đại học Lâm nghiệp 35.Old, K.M et al (2000) A Manual of Diseases of Tropical Acacias in 23 Phạm Quang Thu Nguyễn Thị Thuý Nga, (2007) Phân lập tuyển chọn Australia, South-East Asia and India CFOR, Indonesia vi khuẩn nội sinh để phòng trừ nấm Cryptosporiopsis eucalypti Sankaran & 36 Roger L (1952, 1953, 1954), Phytopathologie des payschauds, (Tome I, II, Sutton gây bệnh cháy bạch đàn Thông tin khoa học kỹ thuật Lâm nghiệp số III), Paris 4/2007 37 Sharma J.K (1986) Eucalypts in India, Peechi 24 Nguyễn Hải Tuất, Ngô Kim Khôi, Nguyễn văn Tuấn (2001), Tin học ứng 38 Sharma J.K (1994) Điều tra bệnh vườn ươm rừng trồng Việt dụng Lâm nghiệp, Nxb Nông nghiệp, Hà Nội Nam, Dự án ViE/92/022, Hà Nội, Việt Nam 64 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 65 http://www.lrc-tnu.edu.vn Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Phụ lục 1: Các đặc trƣng thống kê chung khuẩn Multiple Comparisons Descriptives N Hvn Dg P R B03 P01 X02 Total B03 P01 X02 Total B03 P01 X02 Total B03 P01 X02 Total 150 150 150 450 150 150 150 450 150 150 150 450 150 150 150 450 Mean 49.6410 48.3525 49.3708 49.1214 5.0200 4.9200 4.9200 4.9533 20.1600 25.0800 27.5467 24.2622 19.0533 25.9000 24.4000 23.1178 Std Deviation 3.13428 2.92592 2.86186 3.02115 69966 66069 66069 67408 23.93730 21.39671 20.72044 22.22606 20.17766 16.11733 16.72758 17.96723 Std Error 25591 23890 23367 14242 05713 05395 05395 03178 1.95447 1.74703 1.69182 1.04775 1.64750 1.31597 1.36580 84698 95% Confidence Interval for Mean Lower Bound Upper Bound 49.1353 50.1467 47.8804 48.8245 48.9091 49.8325 48.8415 49.4013 4.9071 5.1329 4.8134 5.0266 4.8134 5.0266 4.8909 5.0158 16.2979 24.0221 21.6278 28.5322 24.2036 30.8897 22.2031 26.3213 15.7979 22.3088 23.2996 28.5004 21.7012 27.0988 21.4532 24.7823 Minimum 40.00 41.00 42.00 40.00 4.00 4.00 4.00 4.00 00 00 00 00 00 00 4.00 00 Maximum 58.00 54.00 56.00 58.00 6.00 6.00 6.00 6.00 92.00 92.00 92.00 92.00 79.00 79.00 79.00 79.00 Dependent Variable Hvn Bonferroni (I) Kyhieuchung B03 P01 X02 Dg Bonferroni B03 P01 X02 P Bonferroni B03 P01 X02 R Bonferroni B03 Test of Homogeneity of Variances Hvn Dg P R Levene Statistic 341 075 3.031 6.970 P01 df1 2 2 df2 447 447 447 447 Sig .712 927 049 001 X02 Mean Difference (I-J) Std Error 1.28853* 34367 27020 34367 -1.28853* 34367 -1.01833* 34367 -.27020 34367 1.01833* 34367 10000 07782 10000 07782 -.10000 07782 00000 07782 -.10000 07782 00000 07782 -4.92000 2.54746 -7.38667* 2.54746 4.92000 2.54746 -2.46667 2.54746 7.38667* 2.54746 2.46667 2.54746 -6.84667* 2.05125 -5.34667* 2.05125 6.84667* 2.05125 1.50000 2.05125 5.34667* 2.05125 -1.50000 2.05125 (J) Kyhieuchung P01 X02 B03 X02 B03 P01 P01 X02 B03 X02 B03 P01 P01 X02 B03 X02 B03 P01 P01 X02 B03 X02 B03 P01 Sig .001 1.000 001 010 1.000 010 598 598 598 1.000 598 1.000 162 012 162 1.000 012 1.000 003 028 003 1.000 028 1.000 * The mean difference is significant at the 05 level Hvn ANOVA Hvn Dg P R Between Groups Within Groups Total Between Groups Within Groups Total Between Groups Within Groups Total Between Groups Within Groups Total Sum of Squares 138.516 3959.666 4098.182 1.000 203.020 204.020 4242.684 217562.4 221805.1 3885.684 141061.1 144946.8 df 447 449 447 449 447 449 447 449 Mean Square 69.258 8.858 F 7.818 Sig .000 500 454 1.101 333 2121.342 486.717 4.358 013 1942.842 315.573 6.157 002 Duncan a Kyhieuchung P01 X02 B03 Sig N 150 150 150 Subset for alpha = 05 48.3525 49.3708 49.6410 1.000 432 Means for groups in homogeneous subsets are displayed a Uses Harmonic Mean Sample Size = 150.000 95% Confidence Interval Lower Bound Upper Bound 4627 2.1144 -.5557 1.0961 -2.1144 -.4627 -1.8442 -.1925 -1.0961 5557 1925 1.8442 -.0870 2870 -.0870 2870 -.2870 0870 -.1870 1870 -.2870 0870 -.1870 1870 -11.0416 1.2016 -13.5083 -1.2651 -1.2016 11.0416 -8.5883 3.6549 1.2651 13.5083 -3.6549 8.5883 -11.7759 -1.9175 -10.2759 -.4175 1.9175 11.7759 -3.4292 6.4292 4175 10.2759 -6.4292 3.4292 Descriptives Dg Duncan a Kyhieuchung P01 X02 B03 Sig N 150 150 150 Subset for alpha = 05 4.9200 4.9200 5.0200 228 Means for groups in homogeneous subsets are displayed a Uses Harmonic Mean Sample Size = 150.000 N Hvn D1.3 P Duncan a Kyhieuchung B03 P01 X02 Sig N 150 150 150 Subset for alpha = 05 20.1600 25.0800 25.0800 27.5467 054 333 P Means for groups in homogeneous subsets are displayed a Uses Harmonic Mean Sample Size = 150.000 R R Duncan a Kyhieuchung B03 X02 P01 Sig N 150 150 150 Subset for alpha = 05 19.0533 24.4000 25.9000 1.000 465 Ptuoi Means for groups in homogeneous subsets are displayed a Uses Harmonic Mean Sample Size = 150.000 P h n â ho tíc ô th ín g im h vic h u g n B ệ Pkho CT1 CT2 CT3 CT4 CT5 Total CT1 CT2 CT3 CT4 CT5 Total CT1 CT2 CT3 CT4 CT5 Total CT1 CT2 CT3 CT4 CT5 Total CT1 CT2 CT3 CT4 CT5 Total CT1 CT2 CT3 CT4 CT5 Total 30 30 30 30 30 150 30 30 30 30 30 150 30 30 30 30 30 150 30 30 30 30 30 150 30 29 30 30 30 149 30 30 30 30 30 150 Mean 3.2120 3.6037 4.8993 3.6833 3.1227 3.7042 3.6047 3.8020 3.9843 3.7013 3.0973 3.6379 21.3333 13.0000 4.0000 19.0000 65.1333 24.4933 47.2333 28.2333 4.0000 22.5000 76.2333 35.6400 3.1033 3.5028 4.5723 4.3300 2.5993 3.6223 1.4267 1.6090 2.0997 1.9873 1.1987 1.6643 Std Deviation 75631 74966 36565 74266 60838 91252 94470 85972 89362 80509 58866 86950 6.48783 7.63386 4.07685 9.78035 11.90692 22.82020 10.01614 7.81106 4.16057 7.38008 11.20863 26.00059 55216 67703 94144 89463 59058 1.04847 35775 33887 39237 32467 37350 48960 Std Error 13808 13687 06676 13559 11107 07451 17248 15696 16315 14699 10747 07099 1.18451 1.39375 74433 1.78564 2.17390 1.86326 1.82869 1.42610 75961 1.34741 2.04641 2.12294 10081 12572 17188 16334 10782 08589 06532 06187 07164 05928 06819 03998 95% Confidence Interval for Mean Lower Bound Upper Bound 2.9296 3.4944 3.3237 3.8836 4.7628 5.0359 3.4060 3.9606 2.8955 3.3498 3.5570 3.8514 3.2519 3.9574 3.4810 4.1230 3.6506 4.3180 3.4007 4.0020 2.8775 3.3171 3.4976 3.7782 18.9107 23.7559 10.1495 15.8505 2.4777 5.5223 15.3480 22.6520 60.6872 69.5794 20.8115 28.1752 43.4932 50.9734 25.3166 31.1500 2.4464 5.5536 19.7442 25.2558 72.0480 80.4187 31.4450 39.8350 2.8972 3.3095 3.2452 3.7603 4.2208 4.9239 3.9959 4.6641 2.3788 2.8199 3.4526 3.7921 1.2931 1.5603 1.4825 1.7355 1.9532 2.2462 1.8661 2.1086 1.0592 1.3381 1.5853 1.7433 Minimum 2.00 2.50 3.99 2.05 2.03 2.00 2.05 2.20 2.20 2.08 2.08 2.05 8.00 00 00 4.00 39.00 00 28.00 15.00 00 3.00 49.00 00 2.10 2.30 2.74 2.10 1.85 1.85 1.02 1.08 1.13 1.32 65 65 Maximum 4.84 4.80 5.33 5.15 4.80 5.33 5.50 5.27 5.50 5.40 4.20 5.50 32.00 30.00 15.00 37.00 85.00 85.00 69.00 48.00 16.00 37.00 94.00 94.00 4.10 4.90 6.77 5.70 3.70 6.77 2.40 2.40 2.78 2.49 2.20 2.78 Multiple Comparisons Test of Homogeneity of Variances Hvn D1.3 P R Ptuoi Pkho Levene Statistic 5.301 2.162 11.841 5.894 2.447 074 df1 4 4 4 df2 145 145 145 145 144 145 95% Confidence Interval Sig .001 076 000 000 049 990 Dependent Variable CT1 Hvn Bonferroni CT2 ANOVA Hvn D1.3 P R Ptuoi Pkho Between Groups Within Groups Total Between Groups Within Groups Total Between Groups Within Groups Total Between Groups Within Groups Total Between Groups Within Groups Total Between Groups Within Groups Total Sum of Squares 60.580 63.492 124.071 13.329 99.320 112.649 67315.360 10278.133 77593.493 90324.960 10403.600 100728.6 81.990 80.704 162.694 17.107 18.609 35.716 df 145 149 145 149 145 149 145 149 144 148 145 149 Mean Square 15.145 438 3.332 685 F 34.588 4.865 Sig .000 CT3 001 CT4 16828.840 70.884 237.415 22581.240 71.749 314.726 20.498 560 36.574 4.277 128 33.325 000 000 CT5 000 CT1 000 D1.3 Bonferroni CT2 CT3 CT4 CT5 CT2 Mean Difference (I-J) -.39167 Std Error 17086 Sig .233 Lower Bound -.8787 Upper Bound 0954 CT3 -1.68733(*) 17086 000 -2.1744 -1.2003 CT4 -.47133 17086 066 -.9584 0157 CT5 08933 17086 1.000 -.3977 5764 CT1 39167 17086 233 -.0954 8787 CT3 -1.29567(*) 17086 000 -1.7827 -.8086 CT4 -.07967 17086 1.000 -.5667 4074 CT5 48100 17086 056 -.0060 9680 CT1 1.68733(*) 17086 000 1.2003 2.1744 CT2 1.29567(*) 17086 000 8086 1.7827 CT4 1.21600(*) 17086 000 7290 1.7030 CT5 1.77667(*) 17086 000 1.2896 2.2637 CT1 47133 17086 066 -.0157 9584 CT2 07967 17086 1.000 -.4074 5667 CT3 -1.21600(*) 17086 000 -1.7030 -.7290 CT5 56067(*) 17086 013 0736 1.0477 CT1 -.08933 17086 1.000 -.5764 3977 CT2 -.48100 17086 056 -.9680 0060 CT3 -1.77667(*) 17086 000 -2.2637 -1.2896 CT4 -.56067(*) 17086 013 -1.0477 -.0736 CT2 -.19733 21369 1.000 -.8065 4118 CT3 -.37967 21369 777 -.9888 2295 CT4 -.09667 21369 1.000 -.7058 5125 CT5 50733 21369 189 -.1018 1.1165 CT1 19733 21369 1.000 -.4118 8065 CT3 -.18233 21369 1.000 -.7915 4268 CT4 10067 21369 1.000 -.5085 7098 CT5 70467(*) 21369 012 0955 1.3138 CT1 37967 21369 777 -.2295 9888 CT2 18233 21369 1.000 -.4268 7915 CT4 28300 21369 1.000 -.3262 8922 CT5 88700(*) 21369 001 2778 1.4962 CT1 09667 21369 1.000 -.5125 7058 CT2 -.10067 21369 1.000 -.7098 5085 CT3 -.28300 21369 1.000 -.8922 3262 CT5 60400 21369 054 -.0052 1.2132 CT1 -.50733 21369 189 -1.1165 1018 CT2 -.70467(*) 21369 012 -1.3138 -.0955 CT3 -.88700(*) 21369 001 -1.4962 -.2778 P Bonferroni CT1 CT2 CT3 CT4 CT5 CT1 R Bonferroni CT2 CT3 CT4 CT5 Ptuoi Bonferroni CT1 CT4 -.60400 21369 054 -1.2132 0052 CT5 50400 19329 101 -.0471 CT2 8.33333(*) 2.1738 2.1738 002 2.1365 14.5301 CT1 39943 19495 423 -.1564 9552 000 11.1365 23.5301 CT3 -1.06957(*) 19495 000 -1.6254 CT4 -.82724(*) 19495 000 -1.3830 -.5138 -.2714 2.1738 2.1738 1.000 -3.8635 8.5301 CT5 90343(*) 19495 000 3476 1.4592 000 -49.9968 -37.6032 CT1 1.46900(*) 19329 000 9179 2.0201 002 -14.5301 -2.1365 CT2 1.06957(*) 19495 000 5138 1.6254 001 2.8032 15.1968 CT4 24233 19329 1.000 -.3087 7934 065 -12.1968 1968 CT5 1.97300(*) 19329 000 1.4219 2.5241 000 -58.3301 -45.9365 CT1 1.22667(*) 19329 000 6756 1.7777 000 -23.5301 -11.1365 CT2 82724(*) 19495 000 2714 1.3830 001 -15.1968 -2.8032 CT3 -.24233 19329 1.000 -.7934 3087 000 -21.1968 -8.8032 CT5 1.73067(*) 19329 000 1.1796 2.2817 000 -67.3301 -54.9365 CT1 -.50400 19329 101 -1.0551 0471 1.000 -8.5301 3.8635 CT2 -.90343(*) 19495 000 -1.4592 -.3476 065 -.1968 12.1968 CT3 -1.97300(*) 19329 000 -2.5241 -1.4219 000 8.8032 21.1968 CT4 -1.73067(*) 19329 000 -2.2817 -1.1796 000 -52.3301 -39.9365 CT2 -.18233 09250 506 -.4460 0813 000 37.6032 49.9968 CT3 -.67300(*) 09250 000 -.9367 -.4093 000 45.9365 58.3301 CT4 -.56067(*) 09250 000 -.8243 -.2970 000 54.9365 67.3301 CT5 22800 09250 149 -.0357 4917 000 39.9365 52.3301 CT1 18233 09250 506 -.0813 4460 000 12.7655 25.2345 CT3 -.49067(*) 09250 000 -.7543 -.2270 000 36.9988 49.4678 CT4 -.37833(*) 09250 001 -.6420 -.1147 000 18.4988 30.9678 CT5 41033(*) 09250 000 1467 6740 000 -35.2345 -22.7655 CT1 67300(*) 09250 000 4093 9367 000 -25.2345 -12.7655 CT2 49067(*) 09250 000 2270 7543 000 17.9988 30.4678 CT4 11233 09250 1.000 -.1513 3760 097 -.5012 11.9678 CT5 90100(*) 09250 000 6373 1.1647 000 -54.2345 -41.7655 CT1 56067(*) 09250 000 2970 8243 000 -49.4678 -36.9988 CT2 37833(*) 09250 001 1147 6420 000 -30.4678 -17.9988 CT3 -.11233 09250 1.000 -.3760 1513 000 -24.7345 -12.2655 CT5 78867(*) 09250 000 5250 1.0523 000 -78.4678 -65.9988 CT1 -.22800 09250 149 -.4917 0357 000 -30.9678 -18.4988 CT2 -.41033(*) 09250 000 -.6740 -.1467 097 -11.9678 5012 CT3 -.90100(*) 09250 000 -1.1647 -.6373 000 12.2655 24.7345 CT4 -1.0523 -.5250 000 -59.9678 -47.4988 -.78867(*) 09250 000 * The mean difference is significant at the 05 level .000 22.7655 35.2345 000 41.7655 54.2345 000 65.9988 78.4678 000 47.4988 59.9678 423 -.9552 1564 CT3 17.33333(*) CT4 2.33333 CT5 -43.80000(*) CT1 -8.33333(*) CT3 9.00000(*) CT4 -6.00000 CT5 -52.13333(*) CT1 -17.33333(*) CT2 -9.00000(*) CT4 -15.00000(*) CT5 -61.13333(*) CT1 -2.33333 CT2 6.00000 CT3 15.00000(*) CT5 -46.13333(*) CT1 43.80000(*) CT2 52.13333(*) CT3 61.13333(*) CT4 46.13333(*) CT2 19.00000(*) CT3 43.23333(*) CT4 24.73333(*) CT5 -29.00000(*) CT1 -19.00000(*) CT3 24.23333(*) CT4 5.73333 CT5 -48.00000(*) CT1 -43.23333(*) CT2 -24.23333(*) CT4 -18.50000(*) CT5 -72.23333(*) CT1 -24.73333(*) 2.1738 2.1738 2.1738 2.1738 2.1738 2.1738 2.1738 2.1738 2.1738 2.1738 2.1738 2.1738 2.1738 2.1738 2.1738 2.1738 2.1870 2.1870 2.1870 2.1870 2.1870 2.1870 2.1870 2.1870 2.1870 2.1870 2.1870 2.1870 2.1870 2.1870 CT2 CT2 -5.73333 CT3 18.50000(*) CT5 -53.73333(*) CT1 29.00000(*) CT2 48.00000(*) CT3 72.23333(*) CT4 53.73333(*) CT2 -.39943 2.1870 19495 CT3 -1.46900(*) 19329 000 -2.0201 -.9179 CT4 -1.22667(*) 19329 000 -1.7777 -.6756 2.1870 2.1870 2.1870 2.1870 2.1870 CT3 CT4 CT5 CT1 Pkho Bonferroni CT2 CT3 CT4 CT5 1.0551 Hvn Duncan a Congthuc CT5 CT1 CT2 CT4 CT3 Sig Ptuoi Subset for alpha = 05 3.1227 3.2120 3.6037 3.6833 4.8993 602 642 1.000 N 30 30 30 30 30 Duncan a,b Means for groups in homogeneous subsets are displayed a Uses Harmonic Mean Sample Size = 30.000 Congthuc CT5 CT1 CT4 CT2 CT3 Sig Subset for alpha = 05 3.0973 3.6047 3.7013 3.8020 3.9843 1.000 107 N 30 30 30 30 30 N 30 30 30 30 30 Duncan a Subset for alpha = 05 4.0000 13.0000 19.0000 21.3333 1.000 1.000 65.1333 1.000 285 R Duncan a N 30 30 30 30 30 4.0000 Subset for alpha = 05 22.5000 28.2333 47.2333 1.000 3.1033 3.5028 1.000 1.000 Congthuc CT5 CT1 CT2 CT4 CT3 Sig N 1.000 30 30 30 30 30 Subset for alpha = 05 1.1987 1.4267 1.6090 1.9873 2.0997 1.000 051 227 Means for groups in homogeneous subsets are displayed a Uses Harmonic Mean Sample Size = 30.000 Means for groups in homogeneous subsets are displayed a Uses Harmonic Mean Sample Size = 30.000 Congthuc CT3 CT4 CT2 CT1 CT5 Sig 30 30 29 30 30 Subset for alpha = 05 Pkho P Congthuc CT3 CT2 CT4 CT1 CT5 Sig 2.5993 4.3300 4.5723 214 b The group sizes are unequal The harmonic mean of the group sizes is used Type I error levels are not guaranteed Means for groups in homogeneous subsets are displayed a Uses Harmonic Mean Sample Size = 30.000 Duncan a N Means for groups in homogeneous subsets are displayed a Uses Harmonic Mean Sample Size = 29.795 D1.3 Duncan a Congthuc CT5 CT1 CT2 CT4 CT3 Sig 1.000 Means for groups in homogeneous subsets are displayed a Uses Harmonic Mean Sample Size = 30.000 1.000 1.000 76.2333 1.000