Chương 4. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
4.3. Thử hiệu lực khả năng kháng nấm bệnh của các chủng vi khuẩn phân lập được
4.3.1. Xác định cơ chế kháng bệnh thông qua chủng loại và mật độ vi khuẩn nội sinh
Từ 30 chủng vi khuẩn phân lập được tiến hành thử nghiệm hiệu lực của các chủng này với nấm Colletotrichum gloeosporioides (Penz.) Sacc. Kết quả thử nghiệm hiệu lực kháng nấm gây bệnh và mật độ các chủng vi khuẩn được trình bày ở Bảng 4.05.
Từ Bảng 4.05 cho thấy trong số 30 chủng vi khuẩn phân lập được thì có 7 chủng khuẩn nội sinh (B01, B02, B03, P01, P02, X01, X02, X1.1) có khả năng kháng nấm Colletotrichum gloeosporioides (Penz.) Sacc.
- Cấp bị bệnh 0 (cây khoẻ): phân lập được 10 chủng khuẩn có 6 chủng có khả năng kháng nấm gây bệnh (B01, B02, B03, P01, X01, X02). Đặc biệt chủng vi khuẩn B03 phân lập được từ phần vỏ của cây không bị bệnh (cây khoẻ) mọc rất nhanh và làm cho nấm bệnh chậm phát triển tạo nên vòng ức chế rất rõ.
- Cấp bị bệnh I (hại nhẹ): phân lập được 9 chủng khuẩn có 4 chủng (B01, B02, X02, X1.1) có hiệu lực kháng nấm gây bệnh. Các chủng B1.2, B1.3, P1.1, P2.2, P1.3 cũng có hiệu lực song còn thấp.
- Cấp bị bệnh II (cây bị hại trung bình): Trong 5 chủng đã phân lập được 1 chủng X02 có hiệu lực kháng nấm gây bệnh được phân lập từ phần gỗ của cây chủ.
- Cấp bị bệnh III (cây bị hại nặng): phân lập được 4 chủng vi khuẩn nhưng không có chủng vi khuẩn nào có hiệu lực kháng nấm gây bệnh.
- Cấp bị bệnh IV (cây bị hại rất nặng): phân lập được 2 chủng vi khuẩn nhưng không có chủng nào có hiệu lực kháng nấm gây bệnh.
Như vậy ta thấy rằng không phải tất cả các chủng vi khuẩn phân lập được đều có khả năng kháng nấm gây bệnh Colletotrichum gloeosporioides (Penz.) Sacc.
Chỉ có những cây chủ khoẻ mạnh, hoặc bị bệnh ở mức độ nhẹ và trung bình thì có khả năng ức chế với nấm gây bệnh. Các cây chủ ở mức độ bị bệnh nặng và rất nặng không có chủng nào đủ hiệu lực ức chế nấm gây bệnh.
41
Bảng 4.05: Khả năng kháng nấm Colletotrichum gloeosporioides (Penz.) Sacc của các chủng khuẩn nội sinh
STT Mức độ bị bệnh
Số lượng
Chủng vi khuẩn
Mật độ (CFU/1gam)
Đường kính vòng ức chế (mm) 1
Cây khoẻ, cây không bị bệnh 10
B01 12 . 105 37.5
2 B02 12 . 105 30
3 B03 13 x 105 41,6
4 B1.3 9 . 105 16
5 P01 8 . 104 34
6 P1.3 8 . 104 18
7 P2.2 4 . 104 15
8 X01 12 . 105 28
9 X02 11 . 105 37
10 X2.2 7 . 105 16
11
Hại nhẹ 9
B01 10 . 105 37.5
12 B03 11 . 105 30
13 B1.2 4 . 105 14
14 B1.3 9 . 105 16
15 P1.1 6 . 105 14
16 P1.3 3 . 105 18
17 P2.2 4 . 105 15
18 X1.1 7 . 105 25
19 X02 9 . 105 37
20
Hại trung bình 5
B1.3 9 . 105 16
21 B3.1 3 . 105 3
22 P2.1 5 . 105 12
23 P1.2 6 . 105 2
24 X0.2 7 . 105 37
25
Hại nặng 4
B1.3 6 . 105 16
26 B3.1 3 . 105 3
27 P3.1 2 . 105 2
28 X3.1 4 . 105 1
29 Hại rất nặng 2 B4.1 1 . 105 0
30 P4.1 1 . 105 0
42
4.3.2. Mật độ tế bào của các chủng vi khuẩn có hiệu lực cao
Từ kết quả ở Bảng 4.05 cho thấy: mật độ của các chủng khuẩn có khả năng ức chế nấm gây bệnh có trong cây chủ nằm ở mức 1.105 - 13.105 CFU/1gam. Cây không bị bệnh (cây khoẻ) có số lượng vi khuẩn cao hơn so với cây chủ bị bệnh ở mức độ nhẹ và trung bình. Những chủng khuẩn có đường kính vòng ức chế lớn hơn 20mm thường là những chủng có mật độ cao (7.105 - 13.105).
4.3.3. Một số đặc điểm sinh học của các chủng vi khuẩn có hiệu lực cao 4.3.3.1. Chủng B01
Chủng vi khuẩn B01 phân lập được từ phần vỏ của cây không bị bệnh và cây bị bệnh cấp 1 có hiệu lực ức chế nấm Colletotrichum gloeosporioides (Penz.) Sacc. rất cao. Cấy khuẩn vào chính giữa của hộp lồng chứa môi trường PDA sau 3 đến 4 ngày cấy nấm vào 3 góc của hộp lồng. Theo dõi trong vòng 20 ngày ta thu được kết quả sau.
Nấm Colletotrichum gloeosporioides (Penz.) Sacc. sinh trưởng bình thường trong 24 giờ đầu, sau 24 giờ nấm sinh trưởng chậm dần và ngừng sinh trưởng, thậm chí ở vị trí đối diện giữa nấm và vi khuẩn sợi nấm bị ức chế không thể phát triển được và một phần bị tiêu diệt (Hình 4.08a).
Hình 4.08(a,b): Khuẩn và bào tử B01 đối kháng với nấm Colletotrichum gloeosporioides (Penz.) Sacc.
a b
a a
43
Vi khuẩn có màu trắng bề mặt nhẵn bóng, hình tròn không đều. Tốc độ sinh trưởng của vi khuẩn khá nhanh. Nhuộm vi khuẩn bằng thuốc nhuộm Rose bengan bào tử vi khuẩn có hình hạt gạo, màu trắng đục. Thể dinh dưỡng của vi khuẩn có kích thước lớn hơn và có màu vàng da cam (Hình 4.08b).
4.3.3.2. Vi khuẩn chủng B02
Chủng vi khuẩn B02 phân lập được từ phần vỏ của cây chủ có hiệu lực ức chế nấm Colletotrichum gloeosporioides (Penz.) Sacc rất cao. Cấy khuẩn vào chính giữa của hộp lồng chứa môi trường PDA sau 3 đến 4 ngày cấy nấm vào 3 góc của hộp lồng. Theo dõi trong vòng 20 ngày ta thu được kết quả sau.
Nấm Colletotrichum gloeosporioides (Penz.) Sacc. sinh trưởng rất nhanh trong 48 giờ đầu, sau 48 giờ nấm sinh trưởng chậm lại
Khuẩn lạc màu vàng nhạt, viền mép vi khuẩn lồi lõm, mọc không đều.
Đây là loại vi khuẩn có khả năng ức chế bệnh cao (Hình 4.09a).
Bào tử vi khuẩn có hình hạt gạo, hai đầu của nhẵn bằng. Thể sinh dưỡng có màu vàng da cam hình trụ dài (Hình 4.09b).
Hình 4.09(a,b): Khuẩn và bào tử B02 đối kháng với nấm Colletotrichum gloeosporioides (Penz.) Sacc.
a b
44 4.3.3.3. Vi khuẩn chủng B03
Chủng vi khuẩn B03 được phân lập từ phần vỏ của cây chủ. Sau vài ngày đầu mới cấy nấm bệnh vẫn sinh trưởng bình thường, hai ngày sau thì yếu dần, và dừng hẳn sau 3 đến 4 ngày. Đây là loại vi khuẩn có khả năng đối kháng nấm gây bệnh rất cao (Hình 4.10a). Khuẩn lạc tròn nhẵn màu vàng nhạt, bào tử hình hat gạo nhỏ, thể sinh dưỡng màu da cam thon 2 đầu dài (Hình 4.10.b).
Hình 4.10(a,b): Khuẩn và bào tử B03 đối kháng với nấm Colletotrichum gloeosporioides (Penz.) Sacc.
4.3.3.4. Chủng P01
Chủng P01 được phân lập từ phần tượng tầng của cây chủ. Hai ngày đầu tiên cấy nấm bệnh vẫn sinh trưởng bình thường, bắt đầu sang ngày thứ ba thì nấm bệnh sinh trưởng chậm dần, đến ngày thứ tư nấm bắt đầu ngừng sinh trưởng. Ở vị trí đối diện giữa nấm và khuẩn lạc ta thấy nấm bệnh bị tiêu diệt, đường viền của nấm bệnh lõm vào hình vòng cung khuẩn lạc có mép ngoài lồi lõm (Hình 4.11a).
Bào tử của vi khuẩn hình hạt gạo nhỏ, màu đục. Thể sinh dưỡng màu da cam hình trụ (Hình 4.11b).
a b
45
Hình 4.11(a,b): Khuẩn và bào tử P01 đối kháng với nấm Colletotrichum gloeosporioides (Penz.) Sacc.
4.3.3.5. Chủng X01
Chủng vi khuẩn X01 phân lập từ phần gỗ của cây chủ hoàn toàn không b ị bệnh.
Khuẩn có màu vàng nhạt hình tròn, bề mặt nhẵn bóng, mép ngoài lồi lõm. Nấm gây bệnh vài ngày đầu khi cấy sinh trưởng bình thường, tiếp đến vài ngày sau thì nấm sinh trưởng chậm dần và cuối cùng là ngừng sinh trưởng. Nấm gây bệnh gần khuẩn lạc bị tiêu diệt tạo thành hình tam giác, khuẩn lạc hình tròn, màu vàng (Hình 4.12a).
Hình 4.12(a,b): Khuẩn và bào tử X01 đối kháng với nấm Colletotrichum gloeosporioides (Penz.) Sacc.
a b
a b
46
Bào tử có hình trứng nhỏ màu xám, thể sinh dưỡng màu da cam, ở giữa màu xám khuẩn phân bố không đồng đều (Hình 4.12b).
4.3.3.6. Chủng X02
Chủng vi khuẩn X02 phân lập từ phần gỗ của cây chủ. Khuẩn có màu xám nhạt, hình tròn, bề mặt nhẵn bóng, mép ngoài tương đối bằng phẳng. Nấm gây bệnh vài ngày đầu khi cấy sinh trưởng nhanh và đều về các phía của hộp lồng.
Vài ngày sau thì nấm sinh trưởng chậm dần, cuối cùng bị tiêu diệt ở những phần gần khuẩn nội sinh tạo thành vòng ức chế hình tam giác nhưng hơi lệch về phía bên phải.
Hình 4.13(a,b): Khuẩn và bào tử X02 đối kháng với nấm Colletotrichum gloeosporioides (Penz.) Sacc.
Bào tử của vi khuẩn hình hạt gạo, màu trắng đục phân bố không đồng đều (Hình 4.13b).
4.3.3.7. Chủng khuẩn X1.1
Chủng khuẩn X1.1 phân lập từ phần gỗ của cây bị bệnh nhẹ (cấp 1).
Khuẩn có màu xám, bề mặt khuẩn có nhiều nếp nhăn, mép ngoài tương đối bằng. Nấm gây bệnh ngày đầu và ngày thứ 2 phát triển rất nhanh sau đó chậm
a b
47
dần và đến ngày thứ 4 thì ngừng, từ ngày 5 trở đi những sợi nấm gần khuẩn bị tiêu diệt tạo thành tam giác đều (Hình 4.14a)
Bào tử khuẩn X1.1 có hình thon dài 2 đầu nhọn, chính giữa có vách ngăn màu nâu nhạt (Hình 4.14b).
Hình 4.14(a,b): Khuẩn và bào tử X1.1 đối kháng với nấm Colletotrichum gloeosporioides (Penz.) Sacc.