Chương 4. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
4.5. Ứng dụng vi khuẩn nội sinh trong phòng chống bệnh đốm lá, khô cành ngọn
4.5.1. Nhân sinh khối sản xuất chế phẩm
Nhân sinh khối mỗi loại khuẩn riêng biệt của 7 chủng khuẩn nội sinh (B01, B02, B03, P01, X01, X02, X1.1) trên môi trường lỏng PD.
Lấy khuẩn cho vào môi trường PD sau đó lắc với tốc độ 200 vòng/phút ở 280 C trong 24 giờ, 48 giờ và 72 giờ. Đếm số lượng khuẩn lạc thu được từ các hộp lồng tính theo CFU/ml (CFU là chữ viết tắt của từ tiếng Anh: Colony Forming Unit) được ghi ở Bảng 4.06.
49
Bảng 4.06: Mật độ tế bào của các chủng khuẩn có hiệu lực cao STT Chủng
khuẩn
Mật độ khuẩn theo thời gian
24 giờ TB1 48 giờ TB2 72 giờ TB3 1 B01 10.104 4,21.103 12.105 2,52.104 14.107 1,6.106 2 B02 10.104 4,21. 103 12.105 2,52.104 13.107 1,82. 106 3 B03 12.104 5,04.103 13.105 2,73. 104 14,5.107 2,15. 106 4 P01 8.104 3,38.103 9.105 1,9. 104 10.107 1,4. 106 5 X01 7.104 2,96.103 8.105 1,69. 104 8.107 1,13. 106 6 X02 7.104 2,96.103 8.105 1,69. 104 8.107 1,13. 106 7 X11 7.104 2,96.103 8.105 1,69. 104 8.107 1,13. 106
Từ kết quả ở Bảng 4.06 ta thấy thời gian lắc ảnh hưởng tới mật độ khuẩn rất nhiều, mật độ khuẩn biến động 7.104 - 14,5.107. Mật độ khuẩn tăng lên theo thời gian lắc. Mật độ tăng nhanh trong vòng 24 giờ, từ 24 giờ đến 48 giờ mật độ sinh trưởng bình thường, từ 48 giờ đến 72 giờ thì mật độ tăng trung bình/giờ giảm dần.
Qua bảng trên ta thấy mật độ của chủng khuẩn B03 sau 72 giờ đạt (14,5.107) sau đó là chủng B01, B02 đạt lần lượt 14.107, 13.107.
4.5.2. Thử nghiệm hiệu lực kháng nấm bệnh của khuẩn nội sinh trong phòng thí nghiệm
Thử nghiệm hiệu lực kháng nấm bệnh của các chủng vi khuẩn nội sinh thông qua gây bệnh nhân tạo trong phòng thí nghiệm. Nhúng các lá keo và cành non keo lai vào dung dịch các chủng vi khuẩn có hiệu lực kháng nấm sau khoảng 30 phut thì phun nấm bệnh vào. Theo dõi mức độ bị bệnh của các công thức thí nghiệm tại phòng thí nghiệm của Viện khoa học Lâm nghiệp Việt Nam từ ngày 03/04/2008 đến ngày 09/04/2008, kết quả thu được kết quả ở Bảng 4.07.
50
Bảng 4.07: Hiệu lực kháng nấm gây bệnh của các chủng khuẩn nội sinh STT Ký hiệu
chủng
Mức độ bị bệnh theo thời gian (R%) Sau 2 ngày Sau 4 ngày Sau 6 ngày
1 B01 11,25 20,00 30,00
2 B02 15,00 29,50 37,50
3 B03 0 0 0
4 P01 7,50 15,00 22,50
5 X01 17,50 26,25 40,00
6 X02 5,00 12,50 25,00
7 X11 25,00 33,50 53,50
8 Đối chứng 61,25 78,25 92,50
Từ Bảng 4.07 cho thấy: Mức độ bị bệnh của các chủng khuẩn (trừ chủng B03) tăng dần theo thời gian.
Tất cả các chủng đều so với đối chứng đều có khả năng ức chế nấm trong đó chủng khuẩn B03, có khả năng ức chế sự phát triển của nấm gây bệnh tốt nhất khi gây bệnh nhân tạo trong phòng thí nghiệm, mức độ bị bệnh thấp sau 2, 4, 6 ngày lần lượt là: 0; (theo thứ tự).
Chủng khuẩn P01 mức độ bị bệnh thấp sau 2,4,6 ngày theo dõi thu đươc kết quả sau: 7,5%; 15%; 22,5%. mức độ bị bệnh tăng dần đều trong 6 ngày.
Chủng khuẩn X02 mức độ bị bệnh thấp sau 2,4,6 ngày theo dõi thu đươc kết quả sau: 5%; 12,5%; 25%.
Riêng chủng X01, B01, B02 và X1.1 khả năng ức chế nấm gây bệnh kém hơn, dẫn đến mức độ bị bệnh còn cao sau 6 ngày theo dõi kết quả thu được là 40%; 30%; 37,5%; 53,50% (theo thứ tự). Kết quả được thể hiện rõ qua sơ đồ (Hình 4.15)
51 0
10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
B01 B02 B03 P01 X01 X02 X11 ĐC R
Sau 2 ngày Sau 4 ngày Sau 6 ngày
Hình 4.15: Mức độ ức chế nấm bệnh của các chủng khuẩn Sau đây là một số hình ảnh gây bệnh nhân tạo trong phòng thí nghiệm.
Chủng khuẩn B01 Chủng khuẩn B02
Chủng khuẩn B03 Chủng khuẩn B01, B02, B03 Hình 4.16(a,b,c,d): Khả năng ức chế của các chủng khuẩn B01, B02, B03
a b
c d
52
Chủng khuẩn P01 Chủng khuẩn X1.1
Hình 4.17 (a,b): Khả năng ức chế của các chủng khuẩn P01 và X1.1
Chủng khuẩn X01 Chủng khuẩn X02 Hình 4.18 (a,b): Khả năng ức chế của các chủng khuẩn X01 và X02
Từ kết quả của Bảng 4.07 và Hình 4.15 ta chọn được 3 chủng khuẩn có hiệu lực cao nhất: B03, P01 và X02 để tiến hành thí nghiệm gây bệnh nhân tạo trong giai đoạn vườn ươm.
4.5.3. Thử nghiệm hiệu lực của vi khuẩn nội sinh trong giai đoạn vườn ươm Từ kết quả gây bệnh nhân tạo trong phòng thí nghiệm chọn được 3 chủng khuẩn có hiệu lực ức chế nấm cao nhất để đem ứng dụng vào trong giai đoạn vườn ươm với 5 công thức.
Công thức 1 tiêm 5 ml dung dịch vi khuẩn Công thức 2 tiêm 10 ml dung dịch vi khuẩn a
a
b b
53 Công thức 3 tiêm 15 ml dung dịch vi khuẩn Công thức 4 tiêm 20 ml dung dịch vi khuẩn Công thức 5 tiêm 10 ml nước cất.
Thử nghiệm hiệu lực vi khuẩn ở vườn ươm được tiến hành với 3 chủng khuẩn và theo dõi chúng trong vòng 60 ngày ta thu được kết quả ở Bảng 4.08.
54
Bảng 4.08: Hiệu lực kháng nấm gây bệnh của vi khuẩn nội sinh đến keo lai ở giai đoạn vườn ươm
STT Công thức
Ký hiệu
chủng P% R% Hvn (cm) Dg (mm)
1
CT1
B03 12,50 13,50 49,20 4,90
2 P01 20,50 19,25 48,60 4,80
3 X02 23,00 17,25 51,00 4,70
4
CT2
B03 21,00 18,00 49,90 5,00
5 P01 16,00 19,00 49,50 5,00
6 X02 18,00 20,00 49,40 5,10
7
CT3
B03 0 0 53,00 5,50
8 P01 15,30 17,50 50,80 5,20
9 X02 18,10 17,50 51,00 5,00
10
CT4
B03 8,00 10,50 51,50 5,00
11 P01 14,30 20,50 48,80 4,90
12 X02 19,40 14,00 50,00 5,10
13 CT5 ĐC 59,30 53,25 45,40 4,70
Từ Bảng 4.08 ta thấy tất cả các chủng khuẩn đều có khả năng ức chế nấm gây bệnh (tỷ lệ bị bệnh và mức độ bị bệnh thấp hơn rất nhiều so với công thức đối chứng). Các chủng khuẩn trên có tác dụng kích thích sự sinh trưởng của cây trong giai đoạn vườn ươm (chiều cao và đường kính gốc tăng so với đối chứng).
Qua Bảng 4.08 sử dụng phần mềm SPSS để sử lý số liệu, chủng B03 là chủng có khả năng ức chế sự phát triển của nấm gây bệnh tốt nhất khi thử nghiệm hiệu lực vi khuẩn ở vườn ươm mức độ bị bệnh và tỷ lệ bị bệnh ở công thức 3 thấp nhất (0). (Hình 4.19)
55
0 10 20 30 40 50 60 70
B03 P01 X02 B03 P01 X02 B03 P01 X02 B03 P01 X02 ĐC
CT1 CT2 CT3 CT4 CT5
Chủng khuẩn P%, R%
P%
R%
Hình 4.19: Ảnh hưởng của khuẩn nội sinh đến tỷ lệ bị bệnh và mức độ bị bệnh của keo lai ở giai đoạn vườn ươm
Mức độ ảnh hưởng của các chủng khuẩn tác động đến sinh trưởng của cây qua chiều cao vút ngọn (Hvn) và đường kính cổ rễ (Dg) biểu đồ (Hình 4.22) cho thấy tất cả các chủngđều sinh trưởng nhanh hơnso với đối chứng về Hvn và Dg trong đó có chủng B03 sinh trưởng nhanh nhất.
Hvn (cm)
40 42 44 46 48 50 52 54
B03 P01 X02 B03 P01 X02 B03 P01 X02 B03 P01 X02 ĐC
CT1 CT2 CT3 CT4 CT5
Hvn (cm)
42 44 46 48 50 52 54 56
B03 P01 X02 B03 P01 X02 B03 P01 X02 B03 P01 X02 ĐC
CT1 CT2 CT3 CT4 CT5
Dg (mm)
Dg
Hình 4.20(a,b): Ảnh hưởng của chủng khuẩn đến chiều cao và đường kính gốc của keo lai ở giai đoạn vườn ươm
a b
56
Kết quả thử nghiệm của 3 chủng khuẩn ở vườn ươm ta so sánh qua bảng 4.08 và biểu đồ (Hình 4.19 và Hình 4.20) ta lựa chọn được chủng khuẩn B03 có mức độ bị bệnh, tỷ lệ bị bệnh bị thấp nhất và sinh trưởng chiều cao, đường kính gốc đạt giá trị cao nhất (Hình 21). Đây cũng là cơ sở để lựa chọn chủng B03 thử nghiệm và ứng dụng trong giai đoạn rừng trồng 1 tuổi. (Hình 4.21)
Hình 4.21: Ảnh hưởng của khuẩn nội sinh đến keo lai ở giai đoạn vườn ươm 4.5.4. Ảnh hưởng của vi khuẩn nội sinh đến cây keo lai ở giai đoạn rừng non (1 tuổi).
Qua kết quả thử nghiệm các chủng khuẩn ở giai đoạn vườn ươm ta tìm được chủng khuẩn B03 có khả năng ức chế bệnh tốt nhất và kích thích sự sinh trưởng của cây thông qua chiều cao, đường kính gốc.
Ta tiếp tục thử nghiệm và ứng dụng chủng B03 ở giai đoạn rừng trồng 1 năm tuổi thu được kết quả ở Bảng 4.09
57
Bảng 4.09: Ảnh hưởng của vi khuẩn nội sinh đến keo lai 1 tuổi STT Công thức P% R% HVN
(m)
D1.3
(cm)
Mtươi
(kg)
Mkhô
(kg)
1 CT1 21,32 47,25 3,20 3,60 3,10 1,43
2 CT2 13,00 28,75 3,60 3,80 3,50 1,61
3 CT3 4,00 5,00 4,90 4,00 4,57 2,10
4 CT4 19,00 22,5 3,80 3,70 4,33 1,99
5 ĐC 65,13 76,25 3,00 3,10 2,60 1,20
Từ Bảng 4.09 thấy tỷ lệ bị bệnh và mức độ bị bệnh của chủng khuẩn B03 ở công thức 3 là thấp nhất (P= 4%, R = 5% khi đó ở công thức đối chứng tỷ lệ bị bệnh và mức độ bị bệnh cao (P = 65,13%, P= 76,25%). Điều đó chứng tỏ chủng khuẩn B03 có tác dụng rất tốt trong việc phòng trừ bệnh nếu như dùng liều lượng thích hợp (30 ml/cây) thì cây chủ sẽ phát huy tác dụng một cách tôt nhất. Ở các công thức 1, 2, 4 cây chủ chưa phát huy được hết khả năng kháng bệnh (công thức 1: P = 21,32%, R = 47,25%; công thức 2: P = 13%, R = 28,75%; công thức 4: P = 19%, R = 22,5%).
Để so sánh các công thức của chủng B03 ta xem Hình 4.23 ta thấy sự khác biệt rất rõ về tỷ lệ bị bệnh và mức độ bị bệnh.
58
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90
CT1 CT2 CT3 CT4 ĐC
P%
R%
Hình 4.22: Ảnh hưởng của khuẩn nội sinh đến tỷ lệ bị bệnh và mức độ bị bệnh của keo lai ở giai đoạn rừng tuổi 1
0 1 2 3 4 5 6
CT1 CT2 CT3 CT4 CT5
Công thức Hvn, D1.3
Hvn (m) D1.3 (cm) Mtươi (kg) Mkhô (kg)
Hình 4.23: Ảnh hưởng của thể tích dịch khuẩn đến giai đoạn rừng non 1 tuổi
59
Chủng khuẩn B03 có tác dụng kích thích sinh trưởng cho cây chủ về sinh khối, chiều cao, đường kính gốc. Qua Bảng 4.09 sử dụng phần mềm SPSS để sử lý số liệu ta thấy công thức 3 phát huy tác dụng tốt (Hvn = 4,90 m, D1.3 = 4 cm) đối với cây chủ trong việc sinh trưởng và làm tăng sinh khối tươi cũng như khô (Mtươi = 4,57 kg/cây, Mkhô = 2,1 kg. Trong khi đó công thức đối chứng thì khả năng sinh trưởng thấp hơn nhiều so với công thức 3 (Hvn = 3 m; Dg = 3,1cm; Mtươi = 2,6 kg/cây; Mkhô = 1,2 kg/cây).
Nhận xét:
Hầu hết các chủng khuẩn đều có khả năng ức chế nấm Colletotrichum gloeosporioides (Penz.) Sacc. Chủng B03 có khả năng ức chế nấm và kích thích sinh trưởng cho cây một cách tốt nhất so với đối chứng, đây là một phương pháp phòng chống bệnh rất hay như giảm chi phí tới mức tối thiểu, không gây ô nhiễm môi trường, dế sử dụng...
Việc áp dụng khuẩn nội sinh trong phòng trừ bệnh đốm lá, khô cành ngọn keo lai do nấm Colletotrichum gloeosporioides (Penz.) Sacc. trên diện rộng bằng cách phun ở giai đoạn vườn và tiêm ở trong giai đoạn rừng trồng là rất khả thi vì khuẩn nội sinh, sinh sản rất nhanh trong môi trường thích hợp. Chúng có thể lan tỏa ra các bộ phận của cây chạm vào nhau như: rễ, thân cành và lá...