nghiên cứu sử dụng vi khuẩn nội sinh có khả năng phân hủy nacyllhomoserine lactones (ahls) trong phòng trừ bệnh thối nhũn khoai tây do vi khuẩn erwinia carotovora subsp. carotovora

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM --- --- NGUYỄN THỊ THU HÀ NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG VI KHUẨN NỘI SINH CÓ KHẢ NĂNG PHÂN HỦY N-ACYL-L-HOMOSERINE LA

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

- -

NGUYỄN THỊ THU HÀ

NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG VI KHUẨN NỘI SINH CÓ KHẢ NĂNG

PHÂN HỦY N-ACYL-L-HOMOSERINE LACTONES (AHLs)

TRONG PHÒNG TRỪ BỆNH THỐI NHŨN KHOAI TÂY DO VI KHUẨN

ERWINIA CAROTOVORA SUBSP CAROTOVORA

LUẬN VĂN THẠC SĨ

HÀ NỘI – 2014

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

- -

NGUYỄN THỊ THU HÀ

NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG VI KHUẨN NỘI SINH CÓ KHẢ NĂNG

PHÂN HỦY N-ACYL-L-HOMOSERINE LACTONES (AHLs)

TRONG PHÒNG TRỪ BỆNH THỐI NHŨN KHOAI TÂY DO VI KHUẨN

ERWINIA CAROTOVORA SUBSP CAROTOVORA

CHUYÊN NGÀNH : CÔNG NGHỆ SINH HỌC

MÃ SỐ: 60.42.02.01

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

TS HOÀNG HOA LONG

TS ĐỒNG HUY GIỚI

HÀ NỘI – 2014

LỜI CAM ĐOAN

- Tôi xin cam đoan rằng, số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn là trung thực và chưa được sử dụng để bảo vệ một học vị nào

- Tôi xin cam đoan rằng, mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn đã được cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong luận văn đều được chỉ rõ nguồn gốc

Hà Nội, ngày tháng năm 2014

Tác giả luận văn

NGUYỄN THỊ THU HÀ

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin trân trọng bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới: TS Hoàng Hoa Long và

TS Đồng Huy Giới đã quan tâm, hướng dẫn và tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp

tôi trong quá trình nghiên cứu đề tài và hoàn thành luận văn

Tôi xin gửi lời cảm ơn tới ThS Nguyễn Thanh Hà, CN Nguyễn Thị Thu

Hà, cùng các cán bộ, anh chị em trong Bộ môn Bệnh học Phân tử - Viện Di truyền

Nông nghiệp đã giúp đỡ tôi rất nhiều trong quá trình thực hiện đề tài

Tôi xin cảm ơn các thầy, cô giáo khoa Công nghệ sinh học, bộ môn Sinh học

đã tận tình giúp đỡ và đóng góp các ý kiến quý báu để tôi hoàn thành luận văn

Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, người thân, bạn bè và đồng nghiệp đã động viên, giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài này

Hà Nội, ngày tháng năm 2014

NGUYỄN THỊ THU HÀ

1.2.3 Cơ chế trao đổi thông tin của vi khuẩn Erwinia gây bệnh (Quorum

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20

2.3.1 Phương pháp nghiên cứu vi khuẩn gây bệnh thối nhũn khoai tây

2.3.3 Tuyển chọn các chủng vi khuẩn nội sinh có khả năng phân huỷ AHLs

2.3.4 Đánh giá khả năng ức chế sự phát triển của vi khuẩn gây bệnh thối

2.3.5 Phân loại vi khuẩn nội sinh và đánh giá mức độ an toàn sinh học của

2.3.6 Đánh giá khả năng tồn tại của các chủng vi khuẩn nội sinh bên trong

3.1.2 Đánh giá độc tính của tác nhân gây bệnh trên củ khoai tây trong phòng

3.4.1 Đánh giá khả năng phòng bệnh của VKNS trên lát cắt khoai tây với vi

3.4.2 Đánh giá khả năng phòng trừ bệnh thối nhũn gây ra bởi chủng vi khuẩn

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC BẢNG

DANH MỤC HÌNH ẢNH

MỞ ĐẦU

1 Đặt vấn đề

Cây khoai tây tên khoa học là Solanum tuberosum L., thuộc họ Cà

Solanaceae, có nguồn gốc từ vùng núi Andes của Bolivia và Peru Ngày nay, khoai tây trở thành cây lương thực quan trọng trên khắp thế giới, từ khoai tây người ta đã chế biến ra hàng trăm món ăn khác nhau, thơm ngon, rẻ tiền, rất bổ dưỡng vì trong khoai tây có chứa các vitamin, khoáng chất và phân loại của chất phytochemical như carotenoids và phenol tự nhiên Nghiên cứu còn cho thấy khoai tây không chỉ là lương thực, mà còn là dược phẩm Theo giáo sư Venket Rao khoa dinh dưỡng Trường đại học Y Toronto, Canada, trong khoai tây có nhiều chất chống ôxy hóa, nó có khả năng ngăn ngừa quá trình lão hóa, hạn chế

sự phát triển của ung thư, kích thích tiêu hóa, chữa viêm tuyến dịch vị và một số bệnh khác Những nghiên cứu gần đây còn cho hay khoai tây rất giàu sterol, giúp

tăng cường khả năng miễn dịch cho cơ thể (Hylla S et al., 1998)

Tuy nhiên, người nông dân đang phải đối mặt với tình trạng gây hại của

sâu bệnh trên khoai tây, đặc biệt là bệnh thối nhũn khoai tây do vi khuẩn Erwinia

carotovora subsp carotovora gây ra Bệnh trở nên nghiêm trọng hơn khi điều

kiện thời tiết nóng ẩm và mưa nhiều Hiện nay, biện pháp phòng trừ bệnh chủ yếu là dựa vào các phương pháp truyền thống và sử dụng thuốc trừ sâu hóa học, nhưng các biện pháp này đều không có hiệu quả cao trong đó việc sử dụng thuốc hóa học đã gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến chất lượng nông sản và môi trường sống của con người Vì vậy, đề xuất một biện pháp phòng trừ sâu bệnh hại hiệu quả, thân thiện với môi trường trở thành vấn đề cấp bách hiện nay

Vi khuẩn gây bệnh Erwinia carotovora subsp carotovora sử dụng

quorum sensing (QS) như một cơ chế trao đổi thông tin giữa các tế bào và phụ thuộc mật độ quần thể QS được biết đến như một cơ chế điều hòa biểu hiện gen liên quan đến tính độc và các hoạt động của tế bào vi khuẩn Trong cơ chế này,

cũng là các phân tử tín hiệu có mặt trong hầu hết các vi khuẩn gây bệnh Gram

âm (Esmaeil Mahmoudi et al., 2011; Lazaro Molina et al., 2003) Trong tự

nhiên, vi khuẩn nội sinh tồn tại bên trong mô cây chủ và không gây ra triệu chứng bệnh cho cây Theo các nghiên cứu gần đây, một nhóm vi khuẩn có khả năng phân hủy AHLs qua cơ chế quorum quenching (QQ) đã được sử dụng trong

phòng trừ sinh học bệnh thực vật (Esmaeil Mahmoudi et al., 2011)

Do vậy, tôi tiến hành chọn nghiên cứu đề tài “Nghiên cứu sử dụng vi

khuẩn nội sinh có khả năng phân hủy N-acyl-L-homoserine lactones (AHLs) trong phòng trừ bệnh thối nhũn khoai tây do vi khuẩn Erwinia carotovora subsp carotovora ”

2 Mục tiêu nghiên cứu

- Phân lập và định danh được các chủng vi khuẩn nội sinh phân hủy AHLs

có khả năng ức chế sự phát triển của vi khuẩn thối nhũn từ khoai tây

- Thử nghiệm các chủng vi khuẩn nội sinh để phòng trừ bệnh thối nhũn

khoai tây do vi khuẩn Erwinia carotovora subsp carotovora

3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

- Đề tài tập trung khai thác tiềm năng của vi khuẩn nội sinh ức chế sự phát triển của vi khuẩn gây bệnh thối nhũn, làm rõ cơ chế tương tác giữa vi khuẩn nội sinh và vi khuẩn gây bệnh thông qua phá hủy mạng lưới QS Vấn đề này không chỉ có ý nghĩa khoa học đối với một loại bệnh nhất định trên cây trồng mà còn giúp tạo cơ sở để nghiên cứu điều trị các bệnh trên người do vi khuẩn phụ thuộc tín hiệu QS gây ra

- Ứng dụng vi khuẩn nội sinh phòng trừ bệnh thối nhũn khoai tây góp phần tạo ra sản phẩm nông sản an toàn, làm giảm sử dụng thuốc hóa học giúp bảo vệ môi trường, sức khỏe con người và tăng thu nhập cho người nông dân Trên cơ sở đó có thể mở rộng ứng dụng để phòng trừ bệnh trên nhiều loài cây trồng khác nhau

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Tổng quan về khoai tây

Khoai tây (Solanum tuberosum L.), thuộc họ Cà (Solanaceae) là loài cây

nông nghiệp ngắn ngày, trồng lấy củ chứa tinh bột Đây là loại cây trồng lấy củ rộng rãi nhất thế giới và là loại cây trồng phổ biến thứ tư về mặt sản lượng tươi chỉ xếp sau lúa, lúa mì và ngô Ngày nay, khoai tây trở thành loại cây trồng quan trọng trên khắp thế giới, từ khoai tây người ta đã chế biến ra hàng trăm món ăn khác nhau với giá trị dinh dưỡng cao Trong khoai tây có chứa rất nhiều chất dinh dưỡng quan trọng, nghiên cứu cho thấy một củ khoai tây còn vỏ có kích thước trung bình 150g, cung cấp 27mg vitamin C (45% giá trị hàng ngày),

620 mg kali (18%), 0.2 mg vitamin B6 (10%) và một lượng rất nhỏ thiamin, riboflavin, folate, niacin, magie, photpho, sắt, kẽm… Nghiên cứu còn cho thấy khoai tây không chỉ là lương thực hay thực phẩm đơn thuần, mà còn là dược phẩm Trong khoai tây có nhiều chất chống oxy hóa, có khả năng ngăn ngừa quá trình lão hóa, hạn chế sự phát triển của ung thư, kích thích tiêu hóa, chữa viêm tuyến dịch vị và một số bệnh khác Những nghiên cứu của một số nhà khoa học trên thế giới còn cho hay khoai tây rất giàu sterol, giúp tăng cường khả năng

miễn dịch cho cơ thể (Hylla S et al., 1998)

Tổ chức FAO (Food and Agriculture Organization of the United Nations -

Tổ chức Lương thực và Nông nghiệp Liên Hiệp Quốc) báo cáo sản lượng khoai tây toàn thế giới năm 2009 là 330 triệu tấn Trong đó chỉ hơn 2/3 là thức ăn trực tiếp của con người, còn lại là thức ăn cho động vật và nguyên liệu sản xuất tinh bột Trung bình mỗi năm mỗi người ăn khoảng 33kg khoai tây Châu Âu là nơi sản xuất khoai tây có năng suất cao nhất thế giới, trong khi Trung Quốc là nước sản xuất khoai tây lớn nhất thế giới, riêng sản lượng khoai tây sản xuất ở Trung Quốc chiếm một phần ba sản lượng toàn cầu Trong năm 2008, một số tổ chức quốc tế đã nêu bật vai trò của khoai tây đối với lương thực thế giới Họ đã chỉ ra rằng khoai tây là một loại cây trồng ít tốn kém công chăm sóc, thích hợp với

nhiều loại khí hậu, hạn chế lớn nhất là do củ khoai tây nhanh hỏng, chỉ 5% sản lượng được giao dịch quốc tế, đóng góp ít vào việc ổn định thị trường lương thực, cũng như trong trong cuộc khủng hoảng lương thực năm 2007 - 2008 Liên Hiệp Quốc chính thức tuyên bố năm 2008 là năm quốc tế về khoai tây để nâng cao hình ảnh của khoai tây ở các quốc gia đang phát triển, họ gọi khoai tây là

“cây lương thực kho báu” (Rosenthal and Elisabeth, 2008)

Ở Việt Nam, khoai tây là một cây lương thực chủ lực chỉ đứng sau lúa, ngô, khoai lang về sản lượng và giá trị dinh dưỡng, góp phần lớn trong việc đảm bảo an ninh lương thực quốc gia Ở vụ đông, khoai tây là cây lương thực quan trọng thứ hai chỉ sau ngô ở đồng bằng sông Hồng Hiện nay, mỗi vụ 30.000 - 35.000 ha khoai tây được trồng ở đồng bằng sông Hồng chiếm 98% tổng số diện tích trồng khoai tây trên cả nước Khoai tây mang lại nguồn lương thực thực phẩm với giá trị dinh dưỡng cao, có giá trị kinh tế và có tiềm năng xuất khẩu lớn Chúng được trồng khá phổ biến ở các vùng Trung du và miền núi phía Bắc, đang dần trở thành các cây nông sản chính ở một số vùng của Việt Nam (Phạm Xuân Tùng, 2000)

Tuy nhiên, trong một vài năm trở lại đây, người nông dân đang phải đối mặt với tình trạng gây hại của sâu, bệnh…, đặc biệt là bệnh thối nhũn khoai tây

do chi vi khuẩn Erwinia gây ra Bệnh trở nên nghiêm trọng hơn khi điều kiện

thời tiết nóng ẩm và mưa nhiều như Việt Nam Hiện nay, biện pháp phòng trừ bệnh chủ yếu là dựa vào các phương pháp truyền thống và sử dụng thuốc BVTV hóa học Tuy nhiên, các biện pháp này đều không có hiệu quả cao, đặc biệt là việc sử dụng thuốc BVTV hóa học đã gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến chất lượng nông sản cũng như sức khỏe và môi trường sống của con người Vì vậy, tìm hiểu rõ tác nhân gây bệnh để từ đó đề xuất một biện pháp phòng trừ hiệu quả

và thân thiện với môi trường trở thành vấn đề cấp bách hiện nay

1.2 Bệnh thối nhũn trên khoai tây do vi khuẩn thuộc chi Erwinia gây ra

1.2.1 Bệnh thối nhũn trên khoai tây

Nguyên nhân chính gây lên bệnh thối nhũn khoai tây là do các loài thuộc

chi vi khuẩn Erwinia gây ra Bệnh thường gặp ở các vùng trồng khoai tây có điều

kiện khí hậu nóng ẩm Tuy nhiên trong điều kiện thuận lợi, một số chi vi khuẩn khác

cũng có thể góp phần gây ra bệnh như: Pseudomonas spp., Bacillus spp.,

Clostridium spp… (Perombelon and Salimond, 1995 ; Perombelon M C M., 2002)

Triệu chứng bệnh ở cây: Vết bệnh có màu đen và nhớt, thường xuất hiện ở phần gốc của cây do mầm của củ mẹ bị bệnh phát triển lan ra toàn thân Cây non thường bị còi cọc và phồng lên, lá bị úa vàng, uốn cong, cuối cùng bị thối và chết Nhổ cây lên nếu có củ thì thấy củ thường bị thối ở phần cuối, có mùi khó ngửi (Nguyễn Thị Thanh Hà, 2006)

Triệu chứng bệnh ở củ: Trên củ có những vùng bị thối, hơi lõm xuống và

có hình tròn, từ đó bệnh sẽ lan dần ra Bổ đôi củ thấy có những vùng mô bị ướt, mềm, có màu kem hoặc nâu vàng rất dễ phân biệt với các mô khỏe mạnh Nếu củ

bị bệnh nặng, các vùng thối sẽ phát triển rộng và toàn bộ củ bị thối nhũn (Nguyễn Thị Thanh Hà, 2006)

Hình 1.1 Triệu chứng bệnh thối nhũn trên khoai tây

(Nguyễn Thị Thanh Hà, 2006)

1.2.2 Bệnh thối nhũn trên khoai tây do chi vi khuẩn Erwinia gây ra

Phân loại khoa học của chi Erwinia:

Chi Erwinia là một thành viên của họ vi khuẩn Enterobacteriaceae, được

chia thành 2 nhóm: nhóm gây thối mềm (soft rot) hay “carotovora” và nhóm gây bệnh hoặc tàn rụi cây trồng “non – soft rot”

Trên thế giới đã có một số công trình nghiên cứu về tác nhân gây bệnh thối nhũn do vi khuẩn gây ra Perombelon và Salimond (1995) đã chỉ ra rằng chi

vi khuẩn Erwinia là nguyên nhân chính gây ra bệnh thối nhũn trên thực vật, với

phổ gây bệnh rất rộng

Bảng 1.1: Bệnh thối nhũn do chi vi khuẩn Erwinia gây ra

(Perombelon and Salimond, 1995)

E carotovora subsp odorifera Thối nhũn, xoắn lá Rau diếp

Loài vi khuẩn Erwinia carotovora (tên gọi khác Pectobacterium

carotovorum) là nguyên nhân chính gây bệnh thối nhũn trên nhiều loại cây trồng, chủ yếu là khoai tây, được đặc trưng bởi sự thối nhũn của củ trong điều kiện bảo quản không tốt, gây thiệt hại năng suất trên toàn thế giới Ba loài thuộc chi

Erwinia là: E carotovora subsp carotovora (tên gọi khác là Pectobacterium

carotovorum subsp carotovorum), E carotovora subsp atroseptica (tên gọi khác là Pectobacterium atrosepticum) và E chrysanthemi (tên gọi khác là

Pectobacterium chrysanthemi) gây ra thối nhũn trên củ khoai tây Giống như các tác nhân gây bệnh cơ hội khác, vi khuẩn này có khuynh hướng gây bệnh khi sức

đề kháng của cây chủ bị suy yếu Vi khuẩn này khá phổ biến hầu như luôn luôn hiện diện trên bề mặt, trên vết thương của củ khoai tây sau khi thu hoạch Phát hiện gần đây trên cơ sở phân tử cho thấy bệnh phát triển trong củ khoai tây và thân cây do sự tương tác giữa tác nhân gây bệnh, vật chủ, môi trường và sự cạnh

tranh của vi sinh vật E carotovora đôi khi có thể gây ra sự mục nát thân cây nhưng thường không gây triệu chứng điển hình Tiếp theo, loài E carotovora subsp atroseptica gây bệnh trên cây khoai tây với triệu chứng điển hình ban đầu

là cây còi cọc, vàng lá, héo Còn khi nhiễm trên củ khoai tây thì triệu chứng thối

tương tự như E carotovorum gây ra E chrysanthemi là tác nhân gây bệnh trong điều kiện nhiệt độ cao hơn hai loài trên Loài này được tìm thấy chủ yếu trong thời gian ấm áp, mùa mưa và gây bệnh tương tự như E carotovora subsp

atroseptica nhưng ở mức độ nhẹ hơn Chi Erwinia này gây bệnh thối nhũn trên

nhiều loài thực vật bao gồm: cà rốt, khoai tây, dưa chuột, hành tây, cà chua, rau diếp, mù tạt, cây cảnh…(Perombelon and Salimond, 1995; Perombelon M C

M., 2002; Prajapat R et al., 2013; Toth I K et al., 2003; Toth I K and Birch P

R J., 2005)

Phân bố địa lý: E carotovora subsp carotovora là một loài vi khuẩn phân

bố rộng khắp mọi nơi, nó là nguyên nhân gây bệnh thối mềm trên các loại cây

cảnh (ornamental) và cây công nghiệp khác nhau E carotovora subsp

carotovora phân bố rộng khắp cả vùng ôn đới, nhiệt đới và có phổ ký chủ rộng hơn những nhóm phụ khác (Fiori M., and Schiaffino A., 2003)

Đặc điểm: hình thái tế bào vi khuẩn được quan sát dưới kính hiển vi điện tử: vi khuẩn có dạng hình gậy, đơn lẻ hoặc thành từng cặp, có khả năng

di động do có lông roi bao quanh và có kích thước trung bình từ 0.6 -0.7 ×

2-2.5µm Một số đặc tính sinh hóa của E carotovora subsp carotovora trình

bày ở bảng 1.2 (Fiori M., and Schiaffino A., 2003)

Bảng 1.2 : Đặc tính sinh hóa E carotovora subsp carotovora

• Chú thích:

( + ): Phản ứng dương tính ( - ): Phản ứng âm tính

Con đường lây nhiễm: Erwinia xâm nhập vào cây thông qua con đường tự

nhiên như khí khổng (stomata) và lỗ vỏ, thân, rễ hoặc thông qua vết thương gây bởi côn trùng, động vật ăn cỏ, gió (Marcos Montesano, 2002)

Khả năng gây bệnh: E carotovora subsp carotovora là tác nhân gây bệnh

cơ hội mà độc tính của nó phụ thuộc vào sự tương tác giữa nó với ký chủ và môi trường Trong những điều kiện thuận lợi, tác nhân gây bệnh biểu hiện những nhân tố độc như các enzyme ngoại bào (extracellular enzymes) Tổng hợp các enzyme phân hủy thành tế bào bao gồm: protease, pectinolytic enzymes là enzyme ngoại bào

chính liên quan đến sự phát triển của bệnh Pectinases bao gồm pectate lyase (Pel), pectin lyase (Pnl), polyglacturonases (Peh) và pectin methylesterases (Pme), phá vỡ

cấu trúc của pectin, gây hư hại tế bào và làm mô suy yếu Theo Darrasse et al.,

(1994), đã xác định được trình tự của một vài gen mã hóa cho pectate lyase Có 3 họ

đã được xác định và giữa chúng có tính tương đồng cao: họ BC (BC family) chứa

gen Pel chung cho cả hai loài: E carotovora và E chysanthemi, họ ADE (ADE family) bao gồm những gen chỉ có mặt ở loài E chysanthemi, nhóm thứ ba tương ứng với gen được tìm thấy trên một số chủng thuộc loài E carotovora và trên vi khuẩn Yersinina pseudotuberculosis (Y family) Tuy nhiên, ngoài các emzyme phân

hủy thành tế bào, các nhân tố khác cũng ảnh hưởng ở giai đoạn sớm của bệnh, thiết lập và phát triển quá trình lây nhiễm, đáp ứng tốt với cơ chế kháng của ký chủ Các nhân tố này bao gồm tính đi động (motility), LPS (lipopolydacharides), tổng hợp

siderophores, gen hrp (hypersensitive reation and pathogenicity) liên quan đến phản

ứng siêu nhậy, khả năng gây bệnh, NLPs (N -1 like protein) và những nhân tố chống lại sự phá hủy oxy (oxygen damage) hoặc những peptide kháng khuẩn (antimicrobial peptides) (Heidi Hyytiainen, 2005)

Triệu chứng: triệu chứng phổ biến đặc trưng cho các loài vi khuẩn

E.carotovora là hiện tượng thối nhũn củ khoai tây, cà rốt, bắp cải … Hiện tượng thối hỏng là hậu quả của quá trình phá vỡ cấu trúc mô tế bào của cây do tác động chủ yếu của các enzyme phân hủy tế bào của vi khuẩn, toàn bộ thịt củ, quả bị thối biến thành một khối nhão, có mùi (Lê Lương Tề và Vũ Triệu Mân, 1999)

Mức độ gây hại của vi khuẩn E carotovora subsp carotovora: bệnh thối nhũn là

một bệnh rất nguy hiểm bởi vì vi khuẩn này có khả năng ký sinh, chọn lọc phạm

vi ký chủ rất rộng bao gồm nhiều loại cây trong nhiều họ thực vật khác nhau Hiện nay chưa có cách phòng trừ hiệu quả và thiệt hại do vi khuẩn này gây ra rất lớn (Nguyễn Thị Thanh Hà, 2006)

1.2.3 Cơ chế trao đổi thông tin của vi khuẩn Erwinia gây bệnh (Quorum Sensing)

Vi khuẩn Gram âm (trong đó có Erwinia) sử dụng một dạng “giao tiếp của

vi khuẩn” gọi là Quorum Sensing (QS) QS dựa trên cơ sở tổng hợp, giải phóng, phát hiện và phản ứng với các phân tử tín hiệu (được gọi là các chất tự cảm ứng –

autoinducers) của tế bào vi khuẩn liền kề Khi mật độ tế bào vi khuẩn tăng lên, các phân tử này sẽ được tích lũy trong môi trường ngoại bào và thông qua đó giúp vi khuẩn có thể kiểm soát được số lượng tế bào cũng như sự hiện diện của các loài vi khuẩn khác Những phân tử này khi đạt đến một ngưỡng nhất định sẽ kích hoạt tín hiệu bên trong vi khuẩn và cực đại hóa hoạt động của một số gen đặc hiệu Hầu hết vi khuẩn gây bệnh sử dụng hệ QS đã được nghiên cứu đều cho thấy rằng QS có liên quan đến các gen gây bệnh (Coutteau P and Goossens T.,

2013; Dong et al., 2000; Whitehead N A et al., 2001)

Ở các loài vi khuẩn gây bệnh thuộc chi Erwinia có tồn tại ít nhất hai hệ

thống QS và được xác định bởi bản chất của các tín hiệu hóa học liên quan: N-acyl homoserine lactones (AHLs; còn gọi là tín hiệu AI-1), được tổng hợp bởi nhóm protein LuxI; và tín hiệu AI-2, được tổng hợp bởi nhóm protein tương đồng LuxS

Hệ thống QS ở một số loài Erwinia đóng vai trò quan trọng trong điều hòa biểu hiện

gen, tổng hợp các chất trao đổi thứ cấp và khả năng gây bệnh trên cây chủ Nghiên cứu này của chúng tôi tập trung chính vào khả năng sản sinh phân tử tín hiệu AHLs

của loài vi khuẩn Erwinia carotovora subsp carotovora có liên quan đến khả năng

gây bệnh thối nhũn trên khoai tây (Barnard A M L and Salmond G P C., 2006;

Engebrecht J et al., 1983; Nasser W et al., 1998; Schaefer A L et al., 1996)

Hình 1.2 Cấu trúc phân tử N-acyl homoserine lactones

(Barnard A M L and Salmond G P C., 2006)

Phân tử tín hiệu N-acyl homoserine lactones (AHLs) được đặc trưng bởi một vòng homoserine lactone bất biến gắn với một chuỗi bên N-acyl Các phân

tử tín hiệu AHLs khác nhau về cấu trúc của chuỗi bên N-acyl có thể thay đổi

(Hình 1.2) Mỗi tế bào trong quần thể vi khuẩn đều có khả năng sản sinh ra các

tín hiệu QS, cho biết sự hiện diện của chúng với các tế bào khác trong quần thể AHLs được tạo ra từ một phản ứng enzyme hóa, được xúc tác bởi LuxI

autoinducer synthase LuxI tổng hợp N-AHLs: N-(3-oxohexanoyl)-L-homoserine

lactone (3-oxo-C6-HSL), sử dụng S-adenosyl methionine và protein mang nhóm hexanoyl acyl làm cơ chất cho phản ứng Các đồng phân LuxI khác cũng xúc tác cho phản ứng tương tự để tạo ra các AHLs cần thiết như: N-(3-oxooctanoyl)-L-homoserine lactone (3-oxo-C8-HSL), N-hexanoyl-L-homoserine lactone (C6-

HSL)…(Toth I K et al, 2003; Val D L and Cronan J E Jr.,1998)

Bảng 1.3 : Hệ thống QS sử dụng phân tử tín hiệu N-AHLs

của một số loài Erwinia (Barnard A M L and Salmond G P C., 2006)

Chủng vi khuẩn Tín hiệu QS

chính

Đồng phân LuxI

Đồng phân LuxR

3-oxo-C6-HSL

AhlI ExpR1(ExpR)*,

ExpR2

Gây bệnh, tổng hợp enzyme ngoại bào

Erwinia nhóm 2

Ecc ATCC39048 3-oxo-C6-HSL CarI CarR,

EccR(ExpR)*, VirR

Tổng hợp kháng sinh, gây bệnh, tổng hợp enzyme ngoại bào Ecc SCRI193 3-oxo-C6-HSL AhlI ExpR, VirR, [CarR

(cryptic)]

Gây bệnh, tổng hợp enzyme ngoại bào

(HslI)*

ExpR1(ExpR)*, ExpR2

Gây bệnh, tổng hợp enzyme ngoại bào Eca SCRI1043 3-oxo-C6-HSL ExpI ExpR, VirR Gây bệnh, tổng hợp

enzyme ngoại bào

pectinase

*Danh pháp thay thế

Theo như bảng 1.3 thì ở hầu hết các loài thuộc chi Erwinia có mối quan hệ

mật thiết giữa khả năng sản sinh phân tử tín hiệu AHLs và khả năng gây bệnh trên cây chủ Đây là cơ sở chính để chúng tôi tiến hành nghiên cứu này

1.3 Vi sinh vật đối kháng

1.3.1 Quan hệ đối kháng trong thế giới vi sinh vật

Trong tự nhiên nhiều loài vi sinh vật có khả năng ức chế sinh trưởng, phát triển của các loài vi sinh vật khác và chúng thường được gọi là vi sinh vật đối kháng Vi sinh vật đối kháng có khả năng khống chế sinh học, tác động đối kháng lên nhóm vi sinh vật gây bệnh, tiêu diệt hoặc hạn chế quá trình sống của chúng (AVRDC Internal Review and Planning Workshop 2000) Hiện tượng đối kháng được quan sát ở nhiều nhóm vi sinh vật khác nhau bao gồm nấm, vi khuẩn, xạ khuẩn có thể trực tiếp (competition, antibiosis) hoặc không trực tiếp (tạo tính kháng của cây chủ) Việc sử dụng hiện tượng đối kháng này trong công tác bảo vệ thực vật được gọi là biện pháp phòng trừ sinh học Phương pháp này

đã được sự quan tâm và đầu tư rất lớn của nhiều phòng thí nghiệm trên thế giới trong nhiều thập kỷ qua

Nhiều tác giả đã cho thấy sự đối kháng trực tiếp có thể có những cơ chế

khác, không có bất kỳ một sự đối kháng nào thể hiện trong điều kiện in vitro, lại

không có hiệu quả trong việc giảm mức độ bệnh của cây trong điều kiện nhà kính

và trên đồng ruộng Bên cạnh đấy, một số chủng độc mất độc tính và không có

hoạt tính kháng trong điều kiện phòng thí nghiệm, nhưng lại có hiệu quả giảm độ

nghiêm trọng của bệnh trong điều kiện nhà kính và trên đồng ruộng

1.3.2 Vi sinh vật nội sinh đối kháng

Nội sinh (endophyte) theo tiếng Hy Lạp “endon” có nghĩa là bên trong và

“phyte” có nghĩa là thực vật và thuật ngữ này thường được áp dụng cho nấm bao gồm nấm cộng sinh (mycorrhizal fungi) (Clay K., 1988) Theo Wilson D., 1995), định nghĩa nội sinh cho đến nay được áp dụng cho cả nấm và vi khuẩn có tất cả hay một phần của chu trình sống xâm nhập vào mô thực vật sống và không gây nhiễm cũng như gây triệu chứng bệnh rõ ràng cho mô thực vật (Wilson D., 1995; Kado and C.I., 1992)

Nhận thức về môi trường ngày càng tăng đã thúc đẩy việc phát triển các phương pháp sinh học thay thế cho các phương pháp bảo vệ thực vật bằng các tác nhân hoá học Vi khuẩn từ vùng lá (Phylloplane) có thể phòng trừ sinh học một

số bệnh cây trồng Hầu hết các vi khuẩn được dùng làm tác nhân phòng trừ sinh học đều được chọn lọc từ vi khuẩn hệ rễ Tuy nhiên, các vi khuẩn này không đảm đương được vai trò của mình do khả năng tạo dòng kém ở hệ rễ và không bền vững khi nuôi cấy dài ngày Chính vì vậy, quan hệ mật thiết giữa vi khuẩn nội sinh và cây chủ đã khiến vi khuẩn nội sinh trở thành ứng viên tự nhiên cho công tác chọn lọc các tác nhân phòng trừ sinh học do chúng có khả năng tồn tại trong

hệ rễ với mật độ cao và đây được xem là một tính trạng cần thiết của vi khuẩn nội sinh để xử lý vào hạt hay rễ trước và khi trồng

Vi khuẩn nội sinh tạo một ổ sinh thái tương tự như ổ sinh thái của các vi khuẩn gây bệnh thực vật, đặc biệt là các mầm bệnh xâm nhiễm mạch gây héo Điều này tạo cho vi khuẩn nội sinh trở nên ưu thế khi sử dụng như các tác nhân phòng trừ sinh học Có rất nhiều các công trình nghiên cứu sử dụng các tác nhân phòng trừ sinh học hệ rễ cho thấy rằng 5 trong số 6 vi khuẩn hệ rễ cảm ứng kháng hệ thống ở dưa chuột có khả năng tạo dòng rễ cả trong và ngoài Vi khuẩn nội sinh có hoạt tính đối kháng chống lại một số mầm bệnh thực vật như

Clavibacter michiganensis subsp sepedonicum, tác nhân gây bệnh thối vòng trên khoai tây (Van Buren AM et al., 1993) và P fluorescens 89B-27 và Serratia

marcescens 90-166 cảm ứng kháng với P syringae pv lachrymans, Fusarium

oxyporum f.sp cucumerium và Colletrotrichum orbiculare (Liu L et al., 1995)

Ứng dụng vi khuẩn nội sinh vào cây bông bằng tiêm cành làm giảm thối rễ gây ra

bởi Rhizoctonia solani và héo mạch gây ra bởi F oxysporum f.sp vasinfectum (Chen C et al., 1994) Xử lý hạt cà chua với chủng vi khuẩn nội sinh Bacillus

pumilus SE4 cản trở đường vào của nấm bệnh gây héo mạch F oxysporum f.sp

radicislycospersici và sự sinh trưởng của khuẩn ty chỉ hạn chế ở biểu bì và bao rễ

ngoài Ứng dụng chủng P fluorescens 63-28 hạn chế sự sinh trưởng của Pythium

ultimum ở đậu và F oxysporum f.sp radici-lycopersici ở cà chua Chủng

Pseudomonas fluorescent (CCA90) có thể tạo dòng cả bên trong và bên ngoài

mô rễ và cành Và các chủng vi khuẩn nội sinh phân lập từ cây sồi có hoạt tính

sinh học chống lại mầm bệnh gây héo sồi Ceratocystis fagacearum (Brooks DS

et al., 1994)

Tương tự, vi khuẩn nội sinh trong một quần thể hoạt động giống như các tác nhân phòng trừ sinh học Sturz và Matheson (1996) chỉ ra rằng kháng với sự

phát triển bệnh thối nhũn do vi khuẩn Erwinia carotovora var atroseptica ở củ

khoai tây có tương quan với mật độ quần thể vi khuẩn nội sinh trong củ khoai

tây, gây ức chế sinh trưởng mầm bệnh in vitro Chen và cộng sự cũng chỉ ra rằng

trong số 170 chủng vi khuẩn phân lập từ nội mô của cây bông, 40 chủng có hoạt

tính sinh học chống lại Rhizoctonia solani ở cây bông và 25 chủng cảm ứng kháng với Colletotrichum orbiculare ở dưa chuột (Chen C et al., 1995)

Crop Genetics International (Hannover, MD) kiểm tra tiềm năng sử dụng

vi khuẩn nội sinh được tạo ra bằng kỹ thuật di truyền để phòng trừ sinh học bệnh

cây trồng nông nghiệp Bằng kỹ thuật di truyền, vi khuẩn nội sinh Clavibacter

xylli đã được chuyển gen nội độc tố delta của Bacillus thuringensis subsp kurtaki

vào cây bông để phòng trừ sâu đục thân hại ngô Mặc dù các công nghệ như vậy vẫn còn đắt và chưa được công nhận rộng rãi nhưng chúng có thể là các hệ thống chuyển thuốc trừ sâu sinh học đích và không gây lo ngại về môi trường truyền thống như sử dụng các tác nhân phòng trừ hoá học

1.3.3 Ứng dụng vi khuẩn nội sinh trong phát triển nền nông nghiệp bền vững

Ở những vùng khí hậu mùa xuân ẩm, lạnh và mùa trồng trọt ngắn, việc sử dụng vi khuẩn nội sinh hệ rễ có thể thúc đẩy sự hình thành hạt và ổn định trong các điều kiện bất lợi Ví dụ, trong các điều kiện stress về nhiệt, khoai tây được xử

lý với vi khuẩn nội sinh có thể tăng cường khả năng tạo củ (+63%)

Để tăng năng suất cây trồng cần xem xét đến việc cải tạo độ bền vững của tương tác vi khuẩn nội sinh và cây chủ Có thể cải tạo khả năng làm chủ (phản ứng) của cây chủ hoặc chọn các tính trạng có lợi của vi khuẩn trong các quần thể vi khuẩn

cư trú trong cây chủ Chính vì vậy, một vài chu trình trong cùng một cây chủ có thể biến đổi vi khuẩn nội sinh để sống trong cây chủ mới đó Tương tự một số cây chủ phản ứng với xử lý vi khuẩn nội sinh kích thích sinh trưởng hơn các cây chủ khác

Ví dụ, khoai tây giống Red Pontiac phản ứng tốt với các tác động kích thích sinh

trưởng sau khi xử lý với vi khuẩn Pseudomonad PsJN hơn giống khoai Shepody

Lịch sử canh tác cây trồng và chọn lọc giống cây trồng kích thích quần thể

vi khuẩn nội sinh đặc hiệu Quần thể vi khuẩn nội sinh thực vật đóng góp vào quần thể vi khuẩn nội sinh tồn tại trong đất ruộng Khi thực vật chết, thực vật cũng giải phóng quần thể vi khuẩn nội sinh trở lại đất, chính vì vậy mật độ quần thể tỷ lệ trực tiếp với dung tích vật liệu thực vật phân huỷ Ví dụ như củ khoai tây chứa mật

độ cao quần thể vi khuẩn nội sinh và có thể đóng góp vào quần thể vi khuẩn nội sinh của đất khi củ khoai tây mẹ thối rữa Mở rộng ra với trình tự cây trồng đặc hiệu có thể tạo ưu thế xây dựng lên quần thể vi khuẩn nội sinh đặc hiệu

Tóm lại, vi khuẩn nội sinh thực vật giúp tăng trưởng thực vật, kháng bệnh

và tăng năng suất cây trồng Để sử dụng chúng hiệu quả hơn cần phải chọn lọc, cải tạo quần thể vi khuẩn nội sinh cây trồng và các nguồn đất của chúng, để ổn định chúng ở mức độ tối ưu Do các chất hoá học sử dụng trong nông nghiệp có thể phá vỡ trạng thái bền vững của quần thể vi khuẩn nội sinh nên cần xem xét sự liên quan của các tác động có hại tiềm tàng trên cây trồng, đất trồng và ngay bản thân bên trong quần thể vi khuẩn nội sinh Chẳng hạn như việc sử dụng bừa bãi các loại thuốc hoá học nông nghiệp có thể phá vỡ thế bền vững của vi hệ sinh thái đất - cây trồng Thách thức với cộng đồng nghiên cứu sẽ là phát triển hệ thống để tối ưu quan hệ có lợi của thực vật và vi khuẩn nội sinh

1.4 Tình hình nghiên cứu sử dụng vi khuẩn nội sinh phòng bệnh thối nhũn

1.4.1 Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam

Ở nước ta, hiện chưa có nghiên cứu nào về cơ chế gây bệnh của vi khuẩn thối nhũn cũng như sử dụng các chủng vi khuẩn nội sinh đối kháng để phân hủy AHLs của vi khuẩn gây bệnh trong phòng trừ bệnh thối nhũn do vi khuẩn gây hại cây trồng Trong lĩnh vực thủy sản, TS Nguyễn Thị Ngọc Tĩnh (Viện nghiên cứu Thủy sản II) chủ trì thực hiện đề tài “Nghiên cứu tạo enzyme AHL lactonase tái

tổ hợp có khả năng phân hủy phân tử tín hiệu liên quan đến độc lực ở một số loài

vi khuẩn gây bệnh trên động vật thủy sản” được quỹ Nafosted tài trợ từ năm

2010 Trong khuôn khổ đề tài này, nhóm tác giả tập trung vào tổng hợp enzyme

AHL lactonase tái tổ hợp từ các chủng vi khuẩn Bacillus có tác dụng phân hủy phân tử tín hiệu liên quan đến độc lực ở Vibrio harveyi và Edwardsiella ictaluri

Nhóm nghiên cứu đã xác định được gen aiiA từ các chủng Bacillus phân lập từ môi trường ao nuôi cá tra, sau đó được dòng hóa vào chủng vi khuẩn E coli

BL21 bằng các vector dòng hóa thích hợp Enzyme AHL lactonase được biểu hiện sẽ được kiểm tra họat tính phân hủy phân tử AHL tổng hợp, đồng thời khảo

sát lại khả năng phân hủy các phân tử AHL liên quan đến độc lực ở Vibrio

harveyi và Edwardsiella ictaluri, hai loài vi khuẩn gây bệnh quan trọng trên tôm

sú và cá tra Thông qua đề tài này, nhóm tác giả mong muốn ứng dụng phương pháp tiếp cận mới nói trên trong việc kiểm soát bệnh gây ra bởi vi khuẩn Gram

âm, nhóm vi khuẩn gây bệnh quan trọng trong nuôi trồng thủy sản Nếu thành công, những kết quả của đề tài sẽ mở ra một hướng mới trong việc kiểm soát dịch bệnh trong nuôi trồng thủy sản ở Việt Nam (Nguyễn Thị Ngọc Tĩnh, 2011)

1.4.2 Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu phòng trừ sinh học bệnh thối nhũn do

vi khuẩn E carotovora subsp carotovora gây ra trên nhiều đối tượng cây trồng

khác nhau như khoai tây, bắp cải, cà rốt Điển hình là chủng vi khuẩn biểu mô

Erwinia herbicola Eh252 có khả năng ức chế vi khuẩn gây bệnh thối nhũn do sản sinh một loại kháng sinh có gốc peptide Khi lây nhiễm chủng vi khuẩn này trên lát khoai tây và cà rốt trước khi nhiễm vi khuẩn gây bệnh, biểu hiện bệnh thối

nhũn giảm đáng kể so với đối chứng (VannesteJ.L et al., 1998)

Trong những năm gần đây phòng trừ sinh học bệnh thối nhũn do vi khuẩn sử dụng các chủng vi khuẩn đối kháng phân hủy AHLs đang gây được nhiều chú ý Các chủng vi khuẩn này được phân lập từ nhiều nguồn khác nhau như: đất, hệ rễ của

cây chủ và ruột cá (Park et al., 2003; Uroz et al., 2003; Morohoshi T et al., 2005)

Hình 1.3 Phân hủy phân tử tín hiệu AHLs bằng các loại enzyme khác nhau Các đường đứt nét biểu thị vị trí phân tách bởi enzyme; 1: lactonase; 2:

decarboxylase; 3: acylase; 4: deaminase

Do tính nghiêm trọng của bệnh trên một phổ rộng các loài cây trồng có giá trị kinh tế, nhiều nghiên cứu trên thế giới đã đi sâu tìm hiểu cơ chế tương tác giữa

vi khuẩn gây bệnh và vi khuẩn đối kháng Dong và cộng sự (2000) đã phát hiện

Bacillus sp 240B1 Vai trò của gen này trong sinh tổng hợp được củng cố khi biểu

hiện trong vi khuẩn gây bệnh E carotovora SCG1 Kết quả cho thấy vi khuẩn gây

bệnh trên một số loài cây trồng như khoai tây, cà rốt, cần tây, súp lơ, thuốc lá và cải thảo Nhóm tác giả này cũng chứng minh được rằng khi thực vật biểu hiện AHL lactonase đã ức chế việc truyền tín hiệu QS của vi khuẩn gây bệnh và do đó

tăng khả năng kháng bệnh thối nhũn (Dong et al., 2001) Vai trò của enzyme AiiA cũng đã được nghiên cứu trong vi khuẩn Bacillus thuringiensis (Park et al., 2008)

Ngoài ra, các tác giả cũng chứng minh được rằng một chủng vi khuẩn đột biến gen

bệnh thối nhũn do E carotovora gây ra trên lát cắt củ khoai tây

Một gene khác ahlD liên quan đến sinh tổng hợp enzyme AHL lactonase AhlD phân hủy AHLs được phân lập từ chủng vi khuẩn Arthrobacter sp

IBN110 Phân tích quang phổ (MS) cho thấy rằng enzyme này có vai trò phá hủy vòng lactone của phân tử N-3-hexanoyl-L-homoserine lactone Nghiên cứu này

cũng chỉ ra rằng các gen tương tự như ahlD có thể tồn tại trong một số loài vi khuẩn khác và hoạt tính phân hủy AHLs được xác định ở loài vi khuẩn Klebsiella

pneumoniae và B stearothermophilus (Park et al., 2003)

Ngoài enzyme AHL lactonase như AiiA và AhlD phát hiện được ở các

chủng vi khuẩn Gram dương, các chủng vi khuẩn Gram âm như Ralstonia sp sản sinh một nhóm enzyme amidase/acylase phân hủy AHLs như AiiD (Lin et al., 2003) Gen aiiD mã hóa cho enzyme AiiD làm bất hoạt AHLs được xác định từ chủng vi khuẩn Ralstonia sp XJ12B Chức năng của gen đã được kiểm chứng khi biểu hiện trong loài vi khuẩn P aeruginosa PAO1 và làm cho chủng vi khuẩn này

giảm khả năng di chuyển, sản sinh elasterase và pyocyanin để dung giải giun tròn

Không chỉ các enzyme phân hủy AHLs tham gia vào việc phá hủy mạng lưới QS, mới đây các nhà khoa học trên thế giới đã phát hiện ra một số chất hữu

cơ bay hơi (volatile organic compounds – VOCs) của các chủng vi khuẩn đối

kháng P fluorescens B-4117 và Serratia plymuthica IC1270 đóng vai trò như

các chất ức chế mạng lưới thông tin QS giữa tế bào với tế bào ở một số vi khuẩn

gây bệnh thực vật như Agrobacterium, Pectobacterium (Chernin et al., 2011)

Nhóm tác giả này cũng xác định được ảnh hưởng của Dimethyl Disulfide (DMDS), một VOC do chủng vi khuẩn IC1270 tạo ra, đến sự ức chế phiên mã

của gen AHL synthase phzl và csal Đây là một trong những phát hiện mới và thú

vị về vai trò của VOCs từ vi khuẩn vì VOCs không chỉ được biết là có hoạt tính

kháng sinh sử dụng trong phòng trừ sinh học các loại bệnh thực vật (Farag et al.,

2006) mà nay còn là chất ức chế mạng lưới QS của vi sinh vật khác

Chủng CV026 là một đột biến mini-Tn5 của C violaceum mất khả năng

sản sinh sắc tố violacein nhưng khả năng tổng hợp sắc tố này được khôi phục khi tiếp xúc với dịch nuôi cấy chủng vi khuẩn dạng dại không bị đột biến có chứa phân tử AHLs Nghiên cứu sử dụng các phân tử AHLs cho thấy rằng

violacein có thể được cảm ứng tổng hợp bởi các phân tử AHLs chuỗi ngắn có

chiều dài chuỗi N-acyl từ 4-8 Cacbon và các phân tử AHLs có chiều dài chuỗi

Do vậy, chủng vi khuẩn CV026 được sử dụng làm chỉ thị sinh học (biosensor/reporter strain) để xác định khả năng sản sinh phân tử AHLs chuỗi

ngắn (McClean K H et al., 1997; Morohoshi T et al., 2008)

1.5.3 Chromobacterium violaceum VIR07

Chủng VIR07 cũng là một chủng đột biến của C violaceum không có khả

năng tổng hợp violacein Khả năng tổng hợp violacein của chủng vi khuẩn này

được khôi phục khi bổ sung các phân tử AHLs chuỗi dài (chuỗi N-acyl có chiều

dài từ 10-16 Cacbon), nhưng bị ức chế tổng hợp sắc tố này khi thêm các phân tử AHLs chiều dài chuỗi N-acyl từ 4-8 Cacbon Chủng VIR07 có phản ứng tổng hợp violacein khi AHLs khuếch tán từ một số chủng vi khuẩn sản sinh AHLs trên đĩa thạch Do vậy, có thể sử dụng chủng này làm chỉ thị sinh học để xác định khả

năng sản sinh AHLs chuỗi dài (Morohoshi T et al., 2008)

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Vật liệu nghiên cứu

2.1.1.Thời gian và địa điểm nghiên cứu

- Thời gian: Từ tháng 06/2013 đến 06/2014

- Địa điểm: Bộ môn Bệnh Học Phân Tử - Viện Di Truyền Nông Nghiệp

2.1.2.Đối tượng nghiên cứu

- Mẫu củ khoai tây bị bệnh thối nhũn

- Mẫu củ khoai tây sạch bệnh

- Các chủng vi khuẩn gây bệnh sản sinh AHLs: Erwinia carotovora subsp

carotovora (Ecc) gây bệnh thối nhũn khoai tây và Burkholderia glumae (Bg) gây

bệnh đen lép hạt lúa

- Chủng vi khuẩn chỉ thị Chromobacterium violaceum CV026 và VIR07

có khả năng phản ứng với các phân tử AHLs và hình thành sắc tố màu tím (violacein)

2.1.3 Môi trường sử dụng trong nghiên cứu

2.1.3.1 Môi trường phân lập và nuôi cấy vi khuẩn

Thành phần môi trường YPDA (g/l): cao nấm men 1.5, dextrose 1.5, peptone 0.3, agar 20, nước cất, pH 7.2, khử trùng 121ºC trong 15 phút

2.1.3.2 Môi trường bảo quản vi khuẩn

Thành phần môi trường sữa tách béo (%): skim milk 10, L-glutamic acid 0.05, glycerol 10, nước cất, khử trùng 121ºC trong 15 phút

2.1.3.3 Môi trường thử khả năng sản sinh và phân hủy AHLs

Thành phần môi trường LB (g/l): tryptone 10, cao nấm men 5, NaCl 5, agar 20, nước cất, pH 7, khử trùng 121ºC trong 15 phút

2.1.3.4 Cách pha một số hóa chất dùng trong thí nghiệm

cất, sau đó cho 3 giọt Tween vào và lắc đều

2.1.4 Thiết bị nghiên cứu

- Các thiết bị và máy móc của Bộ môn Bệnh học Phân tử, Viện Di truyền Nông nghiệp, bao gồm một số thiết bị chính như: tủ cấy an toàn sinh học NUAIRE (Mỹ), nồi khử trùng OMRON (Nhật Bản), máy ly tâm lạnh UNIVERSAL (Mỹ), cân điện tử AND (Anh), máy đo pH HORIBA (Nhật Bản), máy PCR, tủ lạnh giữ giống VESTROST (Đan Mạch), tủ nuôi cấy JEIOTECH (Hàn Quốc), bể điện di MUPID (Nhật Bản), tủ sấy LENTON (Anh), máy khuấy

từ FISHER (Mỹ), máy soi gel UVITEC Cambridge ( Mỹ),…

- Dụng cụ: đĩa Petri, pipette các loại, ống Falcon, ống nghiệm, ống Eppendorf,

ống đong, đèn cồn, bình tam giác (50, 100, 250 ml), bình Schott, que cấy…

2.2 Nội dung nghiên cứu

- Nội dung 1: Phân lập các chủng vi khuẩn gây bệnh thối nhũn trên củ

khoai tây nhiễm bệnh

- Nội dung 2: Phân lập các chủng vi khuẩn nội sinh từ củ, rễ, thân, lá của

các loài cà dại, khoai tây và cà chua

- Nội dung 3: Tuyển chọn các chủng vi khuẩn nội sinh có khả năng phân

hủy AHLs trong điều kiện in vitro và in vivo

- Nội dung 4: Đánh giá khả năng ức chế sự phát triển của vi khuẩn gây bệnh

thối nhũn và triệu chứng bệnh trên lát cắt củ khoai tây của vi khuẩn nội sinh

- Nội dung 5: Phân loại, đánh giá mức độ an toàn sinh học của các chủng

vi khuẩn nội sinh

- Nội dung 6: Đánh giá khả năng tồn tại của các chủng vi khuẩn nội sinh

bên trong mô cây chủ

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp nghiên cứu vi khuẩn gây bệnh thối nhũn khoai tây Erwinia carotovora subsp carotovora

2.3.1 1 Điều tra và thu thập mẫu bệnh

Mẫu khoai tây bị bệnh thối nhũn được thu thập từ các chợ đầu mối trên địa bàn Hà Nội và trên các cánh đồng trồng khoai tây khu vực Thường Tín, Đông Anh, Sóc Sơn

Các mẫu bệnh được thu dựa trên triệu chứng thối nhũn điển hình: mô bệnh

bị thối, có màu kem đến màu nâu, ướt, nhũn Quá trình thối bắt đầu trên bề mặt

củ và ăn sâu vào bên trong Ranh giới giữa mô bệnh và khỏe rõ ràng bởi đường viền tối màu hoặc đen (Hình 2.1) Thường thối nhũn không có mùi trong giai đoạn đầu phân hủy, nhưng khi có sự xâm nhiễm thứ cấp có mùi rất khó chịu

Hình 2.1 Mẫu khoai tây bị bệnh thu thập được

Mẫu bệnh thu thập được để riêng biệt trong túi báo, bảo quản ở nhiệt độ

2.3.1.2 Phân lập vi khuẩn gây bệnh

Phân lập vi khuẩn gây bệnh được tiến hành theo phương pháp của Furuya

và cộng sự (2002)

• Các bước tiến hành:

- Rửa mẫu dưới vòi nước

- Xịt cồn 70% trên toàn mẫu

- Cắt những miếng nhỏ (1x1cm) giữa vùng bị bệnh và vùng không bị bệnh trên 3 điểm khác nhau của mẫu bệnh, sau đó đặt vào đĩa Petri đã khử trùng

- Nhỏ 1ml nước cất đã khử trùng vào sau đó nghiền nát để lấy dịch gốc

- Chuẩn bị 6 ống eppendorf 1.5ml, mỗi ống chứa 900µl nước cất khử trùng

- Hút 100µl dịch gốc nhỏ vào ống 1 trộn đều, tiếp tục hút 100µl dịch từ ống 1

nhỏ sang ống 2 và làm lần lượt cho đến ống thứ 6 để được các nồng độ pha loãng

- Lấy 100µl từ các ống eppendorf với 6 nồng độ đã được pha loãng nhỏ lần lượt vào các đĩa môi trường YPDA và trang đều trên bề mặt đĩa

- Mô tả đặc điểm của các khuẩn lạc trên đĩa, sau đó chuyển cấy vào môi trường YPDA mới

- Bảo quản các chủng vi khuẩn đã phân lập được trong sữa tách béo 10%

2.3.1.3 Đánh giá độc tính của tác nhân gây bệnh trên củ khoai tây trong phòng thí nghiệm

Đánh giá độc tính của các tác nhân gây bệnh trong phòng thí nghiệm bằng phương pháp lây nhiễm trực tiếp lên lát cắt củ khoai tây (Nguyễn Thanh Hà và cs., 2013)

- Đối chứng dương được sử dụng là chủng vi khuẩn Erwinia carotovora

chứng âm được sử dụng với nước cất khử trùng

- Mẫu khoai tây sau khi nhiễm được đặt trên giấy thấm ẩm trong đĩa Petri

chủng vi khuẩn được lây nhiễm trên 3 lát cắt Thí nghiệm được lặp lại 3 lần

2.3.1.4 Xác định khả năng sản sinh AHLs

Xác định khả năng sản sinh AHLs của vi khuẩn gây bệnh theo phương pháp đồng nuôi cấy của Molina và cộng sự (2003) với một số thay đổi

Xác định khả năng sản sinh AHLs chuỗi ngắn

• Các bước tiến hành:

- Chủng vi khuẩn chỉ thị CV026 và Ecc được cấy trên môi trường LB và

- Các chủng vi khuẩn nghiên cứu được cấy trên môi trường YPDA và ủ ở

- Các chủng vi khuẩn được cấy vạch thành một đường trên môi trường

LB, kèm sát bên phải là chủng vi khuẩn chỉ thị CV026 cũng được cấy vạch thành một đường, tạo thành 2 đường cấy song song

- Đối chứng dương gồm hai chủng Ecc và CV026 cấy sát nhau

- Đối chứng âm là chủng Ecc và chủng CV026 được cấy riêng biệt

- Thí nghiệm được làm nhắc lại 3 lần và kết quả được thể hiện sau 24 giờ

• Cách đọc kết quả:

- Dương tính (+): vạch cấy của chủng vi khuẩn chỉ thị CV026 chuyển màu tím

- Sản sinh AHLs yếu (±): vạch cấy của chủng vi khuẩn chỉ thị CV026 có màu tím nhạt hơn

- Âm tính (-): vạch cấy của chủng vi khuẩn chỉ thị CV026 không chuyển màu tím (màu của khuẩn lạc vi khuẩn)

Xác định khả năng sản sinh AHLs chuỗi dài

Làm tượng tự như với thí nghiệm xác định khả năng sản sinh AHLs chuỗi ngắn, với một số thay đổi:

- Chủng đối chứng Bg thay cho chủng Ecc ở thí nghiệm trước

- Chủng chỉ thị VIR07 thay cho chủng CV026 ở thí nghiệm trước

- Thí nghiệm được làm nhắc lại 3 lần và kết quả được thể hiện sau 24h

• Cách đọc kết quả:

- Dương tính (+): vạch cấy của chủng vi khuẩn chỉ thị VIR07 chuyển màu tím

- Sản sinh AHLs yếu (±): vạch cấy của chủng vi khuẩn chỉ thị VIR07 có màu tím nhạt hơn

- Âm tính (-): vạch cấy của chủng vi khuẩn chỉ thị VIR07 không chuyển màu tím (màu của khuẩn lạc vi khuẩn)

Hình 2.2 Thí nghiệm thử khả năng sản sinh AHLs của vi khuẩn

2.3.2 Phương pháp nghiên cứu vi khuẩn nội sinh

2.3.2.1 Vật liệu nghiên cứu

Tổng số 25 mẫu củ khoai tây sạch bệnh thu thập từ các chợ đầu mối trên

địa bàn Hà Nội và các vùng trồng khoai tây ở Thường Tín, Đông Anh

2.3.2.2 Phương pháp phân lập vi khuẩn nội sinh

Phân lập VKNS được tiến hành theo phương pháp của Furuya và cộng sự (2002) với một số thay đổi như sau:

Vi khuẩn nội sinh được phân lập và tuyển chọn từ những mẫu khoai tây ngoài tự nhiên Mẫu thu về được rửa sạch dưới vòi nước để phục vụ cho việc

phân lập Ngâm mẫu trong cồn 70% khoảng 3 phút và dung dịch Sodium hypochlorite (3% Cl-) trong 5 phút Sau đó rửa 3 lần bằng nước cất vô trùng Nghiền mẫu trong đĩa petri khử trùng Nhỏ 1ml nước cất đã khử trùng vào dịch nghiền và trộn đều để tạo dịch gốc Chuẩn bị 6 ống efpendorf 1.5ml, mỗi ống chứa 900µl nước cất khử trùng Hút 100µl dịch gốc nhỏ vào ống 1 trộn đều, tiếp tục hút 100µl dịch từ ống 1 nhỏ sang ống 2 và làm lần lượt cho đến ống thứ 6 để được các nồng độ pha loãng Lấy 100µl từ các ống pendorf với 6 nồng độ đã được pha loãng nhỏ lần lượt vào các đĩa môi trường YPDA và trang đều trên bề

các khuẩn lạc trên đĩa, sau đó chuyển cấy vào môi trường YPDA mới Bảo quản

thí nghiệm tiếp theo

2.3.3 Tuyển chọn các chủng vi khuẩn nội sinh có khả năng phân huỷ AHLs trong điều kiện in vitro và in vivo

2.3.3.1 Vật liệu nghiên cứu

- Tập hợp các chủng VKNS phân lập từ củ khoai tây sạch bệnh

- Chủng gây bệnh thối nhũn sản sinh AHLs: Erwinia carotovora subsp

carotovora (Ecc)

- Chủng vi khuẩn chỉ thị Chromobacterium violaceum CV026/VIR 07 có

khả năng phản ứng với các phân tử AHLs và hình thành sắc tố màu tím

- Môi trường nuôi cấy YPDA (nuôi cấy VKNS) và LB (nuôi cấy chủng chỉ thị)

2.3.3.2 Phương pháp nghiên cứu

Xác định khả năng phân hủy AHLs của vi khuẩn gây bệnh theo phương pháp đồng nuôi cấy của Molina và cộng sự (2003) với một số thay đổi

- Chủng vi khuẩn chỉ thị CV026 và Ecc được cấy trên môi trường LB và

- Các chủng Vi khuẩn nội sinh được cấy trên môi trường YPDA và ủ ở

- Thử khả năng phân hủy AHLs của vi khuẩn gây bệnh theo phương pháp

đồng nuôi cấy

- Các chủng VKNS được cấy vạch thành một đường trên môi trường, kèm sát hai bên là chủng vi khuẩn Ecc và chủng vi khuẩn chỉ thị CV026 cũng được cấy vạch thành một đường, tạo thành 3 đường cấy song song

- Đối chứng dương chỉ gồm hai chủng Ecc và CV026 cấy sát nhau

- Đối chứng âm là chủng Ecc và chủng CV026 được cấy riêng biệt

Lưu ý: Thí nghiệm được làm nhắc lại 3 lần và kết quả được thể hiện sau 24h

2.3.4 Đánh giá khả năng ức chế sự phát triển của vi khuẩn gây bệnh thối nhũn và triệu chứng bệnh trên lát cắt củ khoai tây của VKNS

2.3.4.1 Chuẩn bị lát cắt củ khoai tây

- Rửa củ khoai tây dưới vòi nước chảy cho hết bùn đất và để ráo nước

- Cắt lát khoai tây và khoan một lỗ trên mỗi lát cắt khoai tây (sử dụng khoan đục lỗ thạch)

- Khử trùng bề mặt lát cắt khoai tây với cồn 70% trong 3 phút, tiếp theo

khử trùng 3 lần

- Thấm khô bằng giấy thấm khử trùng

- Đặt mỗi lát cắt khoai tây vào mỗi đĩa Petri

2.3.4.2 Chuẩn bị dịch vi khuẩn:

- Chuẩn bị ống eppendorf (1.5ml) chứa 1000µl nước cất khử trùng

- Dùng que cấy lấy 1 - 2 đầu que cấy vi khuẩn (VKNS và vi khuẩn gây bệnh Ecc) đã nuôi trên đĩa Petri cho vào ống nước cất, trộn kỹ trên máy vortex

Đối chứng âm: 50µl nước cất vô trùng

Đối chứng vi khuẩn gây bệnh Ecc: 25µl nước cất vô trùng + 25µl dịch khuẩn Ecc

Đĩa thí nghiệm: Dùng hỗn hợp dịch khuẩn nhỏ đều xung quanh thành lỗ khoan

• Cách 2: nhiễm VKNS trước 24h và nhiễm Ecc sau

Đối chứng âm: 50µl nước cất vô trùng, sau 24h thêm 50µl nước cất vô trùng

Đối chứng dương: 50µl nước cất vô trùng, sau 24h thêm 50µl Ecc

Đĩa thí nghiệm: Nhỏ trước 50µl VKNS và sau 24h sau tiến hành nhỏ tiếp 50µl Ecc vào thành lỗ khoan

• Cách 3: nhiễm Ecc trước 24h và nhiễm VKNS sau

Đối chứng âm: 50µl nước cất vô trùng, sau 24h thêm 50µl nước cất vô trùng

Đối chứng dương: 50µl Ecc, sau 24h thêm 50µl nước cất vô trùng

Đĩa thí nghiệm: Nhỏ trước 50µl Ecc và sau 24h sau tiến hành nhỏ tiếp 50µl VKNS vào thành lỗ khoan

2.3.4.4 Đánh giá kết quả thí nghiệm:

- Đánh số các đĩa 1,2,3 (mỗi chủng 3 đĩa)

- Cân từng miếng khoai tây đã lây nhiễm và ghi kết quả

- Rửa nhẹ dưới vòi nước chảy để loại bỏ hết phần thối

- Cân lại trọng lượng lát cắt khoai tây sau khi lây nhiễm và ghi kết quả

2.3.5 Phân loại vi khuẩn nội sinh và đánh giá mức độ an toàn sinh học của các chủng vi khuẩn nội sinh

2.3.5.1 Phương pháp phân loại các chủng vi khuẩn nội sinh:

Phản ứng nhân gen PCR và giải trình tự gen sử dụng primer F27 AGAGTTTATCMTGGCTCAG-3’ và R1492 5’-GRTACCTTGTTACGACTT-

5’-3’ Giải trình tự gen 16S rRNA trực tiếp từ phản ứng PCR sử dụng hỗn hợp Big Dye và tiến hành trên máy ABI Sequence Detector System SDS 7700 Trình tự gen 16S rRNA được phân tích bằng chương trình BLAST (www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST) dựa vào cơ sở dữ liệu của NCBI (National

Center for Biotechnology Information)

2.3.5.2 Định danh các chủng VKNS

Phản ứng nhân gen (PCR) vùng 16S rARN sử dụng cặp mồi F27 và R1492 trên ADN khuôn hệ gen vi khuẩn Sau đó sản phẩm PCR được tinh sạch và giải trình tự gen 16S rARN sử dụng cặp mồi F27 và R1492 Kết quả giải trình tự được phân tích bằng BLASTN trên GenBank (Nguyễn Thanh Hà và cs., 2013)

a Tách chiết ADN genome vi khuẩn

Tách chiết ADN genome vi khuẩn được tiến hành bằng phương pháp sốc nhiệt (Nguyễn Thanh Hà và cs., 2013)

- Lấy 1 đầu que cấy vi khuẩn cho vào ống eppendoft chứa 500µl nước cất tiêm

- Pha loãng nồng độ xuống 10 lần

- Để ống eppendoft trên nước đun sôi 10 phút, sau đó lấy ra cho lên đá lạnh 15 phút