ứng dụng vi khuẩn nội sinh phân hủy n-acyl-l-homoserine lactones (ahls) trong phòng trừ bệnh thối nhũn khoai tây

SỞ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO HÀ NỘI TRƯỜNG THPT chuyên Hà Nội - Amsterdam ************** ĐỀ TÀI DỰ THI KHOA HỌC, KỸ THUẬT DÀNH CHO HỌC SINH TRUNG HỌC CẤP THÀNH PHỐ LẦN THỨ TƯ (NĂM HỌC 2014 - 2015). Tên đề tài: ỨNG DỤNG VI KHUẨN NỘI SINH PHÂN HỦY N-ACYL-L-HOMOSERINE LACTONES (AHLs) TRONG PHÒNG TRỪ BỆNH THỐI NHŨN KHOAI TÂY Lĩnh vực: Sinh học tế bào và phân tử NGƯỜI HƯỚNG DẪN - TS. Hoàng Hoa Long - Đơn vị công tác: Viện Di truyền nông nghiệp, KM2, đường Phạm Văn Đồng, Từ Liêm, Hà Nội TÁC GIẢ: 1. Vũ Văn Hiệp Lớp: 12 Hóa 1 Trường: THPT chuyên Hà Nội - Amsterdam 2. Nguyễn Chu Hải Linh Lớp: 12 Toán 1 Trường: THPT chuyên Hà Nội - Amsterdam Hà Nội, tháng 11 năm 2014 1 DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT CHỮ VIẾT TẮT CHỮ VIẾT ĐẦY ĐỦ AND Acid Deoxyribo Nucleic AHLs N-acyl-L-homoserine lactones ARN Acid Ribo Nucleic CV026 Chromobacterium violaceum CFU (Colony Forming Unit) đơn vị hình thành khuẩn lạc CS Cộng sự Ecc Erwinia cartovora subsp. carotovora Ep Endophytes (vi khuẩn nội sinh) LB Môi trường Luria Bertani medium PCR Polymerase chain reaction QQ Quorum Quenching QS Quorum Sensing TB Tế bào VKNS Vi khuẩn nội sinh YPDA Yeast Peptone Dextrose Agar DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1: Mẫu khoai tây bị bệnh thối nhũn 9 Hình 2: Thí nghiệm thử khả năng sản sinh AHLs của vi khuẩn 11 Hình 3: Phương pháp xác định VKNS phân hủy AHLs 13 Hình 4: Hình thái khuẩn lạc của chủng vi khuẩn gây bệnh P2.6.1 trên môi trường YPDA sau 24 giờ nuôi cấy ở 28oC 17 Hình 5: Triệu chứng bệnh sau khi tái nhiễm chủng P.2.6.1 trên khoai tây sau 24h 18 Hình 6: Khả năng sản sinh AHLs chuỗi ngắn của chủng vi khuẩn gây bệnh P.2.6.1 19 Hình 7: Các chủng VKNS có khả năng phân hủy AHLs chuỗi ngắn 21 Hình 8: Sản phảm PCR nhân đoạn gen 16S rRNA của các chủng VKNS 22 DANH MỤC BẢNG Bảng 1: Độc tính của các chủng vi khuẩn phân lập được từ củ khoai tây bị bệnh thối nhũn 17 Bảng 2: Khả năng sản sinh AHLs của các chủng vi khuẩn gây bệnh 19 Bảng 3: Các chủng VKNS có khả năng phân hủy AHLs 20 Bảng 4: Hiệu lực phòng trừ bệnh thối nhũn của chủng VKNS 1.6 21 MỤC LỤC DANH MỤC BẢNG 3 MỤC LỤC 4 I. LÝ DO CHỌN ĐỀ TÀI 4 II. TỔNG QUAN VẤN ĐỀ 5 1. Mục tiêu nghiên cứu 5 2. Đối tượng nghiên cứu 6 3. Phương pháp và cơ chế 6 4. Các giai đoạn tiến hành 7 5. Tính mới, tính thời sự của đề tài 7 6. Ý nghĩa thực tiến của đề tài 7 III. QUÁ TRÌNH NGHIÊN CỨU VÀ KẾT QUẢ 7 3.1. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu 7 3.1.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu 7 3.1.2. Đối tượng nghiên cứu 7 3.1.3. Môi trường dùng trong nghiên cứu 8 3.1.4. Dụng cụ, thiết bị 8 3.2. Phương pháp nghiên cứu 8 3.2.1. Phương pháp nghiên cứu vi khuẩn gây bệnh thối nhũn khoai tây Ecc 8 3.2.2. Phân lập các chủng VKNS từ củ khoai tây 11 3.2.3. Tuyển chọn các chủng VKNS có khả năng phân hủy AHLs trong điều kiện in vitro và in vivo 12 3.2.4. Đánh giá khả năng ức chế sự phát triển của vị khuẩn gây bệnh thối nhũn và triệu chứng bệnh trên lát cắt củ khoai tây của VKNS 13 3.2.5. Phân loại vi khuẩn VKNS và đánh giá mức độ an toàn sinh học của các chủng VKNS 15 3.2.6. Đánh giá khả năng tồn tại của các chủng VKNS bên trong mô cây chủ 16 3.2.7. Quy trình xử lý VKNS để phòng trừ bệnh hiệu quả (đang tiến hành) 17 3.3. Kết quả nghiên cứu 17 3.3.1. Phân lập, tuyển chọn các chủng vi khuẩn gây bệnh thối nhũn từ củ khoai tây 17 3.3.2. Đánh giá độc tính của tác nhân gây bệnh trên cũ khoai tây trong phòng thí nghiệm 17 3.3.3. Khả năng sản sinh AHLs của các chủng vi khuẩn gây bệnh 18 3.3.4. Phân lập và tuyển chọn các chủng vi khuẩn nội sinh từ củ khoai tây 19 3.3.5. Tuyển chọn các chủng vi khuẩn nội sinh có khả năng phân hủy AHLs in vitro và in vivo 20 3.3.6. Đánh giá khả năng ức chế bệnh thối nhũn trên lát cắt củ khoai tây của chủng VKNS 1.6 21 3.3.7. Phân loại và đánh giá mức độ an toàn sinh học của chủng vi khuẩn nội sinh 1.6. .22 3.3.8. Khả năng tồn tại của chủng vi khuẩn nội sinh 1.6 trong mô cây chủ 23 IV. KẾT LUẬN 24 V. TÀI LIỆU THAM KHẢO 25 I. Tài liệu tham khảo tiếng Việt 25 II. Tài liệu tham khảo tiếng Anh 25 I. LÝ DO CHỌN ĐỀ TÀI Cây khoai tây có tên khoa học là Solanum tuberosum, thuộc họ Solanaceae. Ngày nay, khoai tây trở thành cây lương thực quan trọng, trên khắp thế giới từ khoai tây người ta đã chế biến ra hàng trăm món ăn khác nhau, thơm ngon, rẻ tiền, rất bổ dưỡng vì trong khoai tây có chứa các vitamin, khoáng chất và phân loại của chất phytichemical như carotenoids và phenol tự nhiên Một củ khoai tây còn vỏ có kích thước trung bình 150g, cung cấp 27 mg vitamin C (45% giá trị hàng ngày), 620 mg kali (18%), 0.2 mg vitamin B6 (10%) và một lượng rất nhỏ thiamin, riboflavin, folate, niacin, magie, photpho, sắt, kẽm… Nghiên cứu còn cho thấy khoai tây không chỉ là lương thực, mà còn là dược phẩm, có tính chất chữa bệnh. GS.Venket Rao khoa dinh dưỡng Trường đại học Y Toronto, Canada cho hay, trong khoai tây có nhiều chất chống ôxy hóa. Nó có khả năng ngăn ngừa quá trình lão hóa, hạn chế sự phát triển của ung thư, kích thích tiêu hóa và chữa viêm tuyến dịch vị và một số bệnh khác. Những nghiên cứu gần đây còn cho thấy khoai tây rất giàu sterol, giúp tăng cường khả năng miễn dịch cho cơ thể. Tuy nhiên, người nông dân đang phải đối mặt với tình trạng gây hại của sâu, bệnh trên khoai tây, đặc biệt là bệnh thối nhũn khoai tây do vi khuẩn Erwinia carotovora subsp. carotovora gây ra. Hiện nay, biện pháp phòng trừ bệnh chủ yếu là dựa vào các phương pháp truyền thống và sử dụng thuốc trừ sâu hóa học. Tuy nhiên, các biện pháp này đều không có hiệu quả cao và đặc biệt việc sử dụng thuốc hóa học bảo vệ thực vật đã gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến chất lượng nông sản, sức khỏe và môi trường sống của con người. Vì vậy, đề xuất một biện pháp phòng trừ hiệu quả và thân thiện với môi trường trở thành vấn đề cấp bách hiện nay. Vi khuẩn gây bệnh E. carotovora subsp. carotovora sử dụng quorum sensing (QS) như một cơ chế trao đổi thông tin giữa các tế bào và phụ thuộc mật độ quần thể. Trong cơ chế này, N-acyl-L-homoserine lactones (AHLs) đóng vai trò như các chất tự cảm ứng (autoinducer) và cũng là các phân tử tín hiệu có mặt trong hầu hết các vi khuẩn gây bệnh Gram âm. Theo các nghiên cứu gần đây, một nhóm vi khuẩn có khả năng phân hủy AHLs qua cơ chế quorum quenching (QQ) đã được sử dụng trong phòng trừ sinh học bệnh thực vật. Do vậy, nhóm tác giả tiến hành thực hiện đề tài nghiên cứu: "Ứng dụng vi khuẩn nội sinh phân hủy N-acyl-L-homoserine lactones (AHLs) trong phòng trừ bệnh thối nhũn khoai tây". II. TỔNG QUAN VẤN ĐỀ 1. Mục tiêu nghiên cứu - Phân lập và định danh các chủng vi khuẩn nội sinh phân hủy AHLs có khả năng ức chế sự phát triển của vi khuẩn thối nhũn từ khoai tây với hiệu quả cao và ổn định. - Thử nghiệm các chủng vi khuẩn nội sinh để phòng trừ bệnh thối nhũn khoai tây do vi khuẩn Ecc gây ra trên khoai tây - Tìm ra quy trình xử lý VKNS để phòng trừ bệnh hiệu quả. 2. Đối tượng nghiên cứu - Mẫu củ khoai tây bị bệnh thối nhũn. - Mẫu củ khoai tây sạch bệnh. - Các chủng vi khuẩn gây bệnh sản sinh AHLs: Erwinia cartovora subsp. carotovora (Ecc) gây bệnh thối nhũn khoai tây - Chủng vi khuẩn chỉ thị Chromobacterium violaceum CV026 có khả năng phản ứng với các phân tử AHLs và hình thành sắc tố màu tím (violacein). 3. Phương pháp và cơ chế * Phương pháp nghiên cứu - Phân lập VKNS và vi khuẩn gây bệnh theo phương pháp khử trùng bề mặt tiêu chuẩn. - Phân loại VKNS và vi khuẩn gây bệnh dựa trên xác định các đặc tính sinh lý sinh hóa và giải trình tự gen 16S rRNA. - Tuyển chọn các chủng có khả năng phân hủy AHLs in vitro và in vivo theo phương pháp đồng nuôi cấy với reporter strains Chromobacterium violaceum CV026. - Đánh giá độ an toàn sinh học của các chủng VKNS dựa trên cơ sở dữ liệu của DSMZ. * Cơ chế Đề tài tập trung khai thác tiềm năng của vi khuẩn nội sinh ức chế sự phát triển của vi khuẩn gây bệnh thối nhũn, làm rõ cơ chế tương tác giữa vi khuẩn nội sinh và vi khuẩn gây bệnh thông qua phá hủy mạng lưới QS. Vấn đề này không chỉ có ý nghĩa khoa học đối với một loại bệnh nhất định trên cây trồng mà còn giúp tạo cơ sở để nghiên cứu điều trị các bệnh trên người do vi khuẩn phụ thuộc tín hiệu QS gây ra 4. Các giai đoạn tiến hành Bước 1: Phân lập các chủng vi khuẩn gây bệnh thối nhũn Ecc Bước 2: Phân lập các chủng VKNS từ củ khoai tây. Bước 3: Tuyển chọn các chủng VKNS có khả năng phân hủy AHLs trong điều kiện in vitro và in vivo Bước 4: Đánh giá khả năng ức chế sự phát triển của vi khuẩn gây bệnh thối nhũn và triệu chứng bệnh trên lát cắt củ khoai tây của VKNS Bước 5: Phân loại, đánh giá mức độ an toàn sinh học của các chủng VKNS Bước 6: Đánh giá khả năng tồn tại của các chủng VKNS bên trong mô cây chủ Bước 7: Quy trình xử lý VKNS để phòng trừ bệnh hiệu quả (đang tiến hành) 5. Tính mới, tính thời sự của đề tài Ở Việt Nam: Hiện chưa có nghiên cứu nào vè cơ chế gây bệnh của vi khuẩn gây bệnh thối nhũn cũng như sử dụng các chủng vi khuẩn nội sinh đối kháng để phân hủy AHLs của vi khuẩn gây bệnh trong phòng trừ bệnh thối nhũn do vi khuản gây hại cây trồng Trên thế giới: Đã có nhiều nghiên cứu theo hướng này. Hầu hết các nghiên cứu đều sử dụng vi khuẩn đã được phân lập từ đất hoặc vi khuẩn biểu mô. Do vậy điểm mới của đè tài này là sử dụng các chủng vi khuẩn nội sinh 6. Ý nghĩa thực tiến của đề tài Ứng dụng vi khuẩn nội sinh phòng trừ bệnh thối nhũn khoai tây góp phần tạo ra sản phẩm nông sản an toàn, làm giảm sử dụng thuốc hóa học giúp bảo vệ môi trường, sức khỏe con người và tăng thu nhập cho người nông dân. Trên cơ sở đó có thể mở rộng ứng dụng để phòng trừ bệnh trên nhiều loài cây trồng khác nhau. III. QUÁ TRÌNH NGHIÊN CỨU VÀ KẾT QUẢ 3.1. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu 3.1.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu - Thời gian: Từ tháng 05/2014 đến nay - Địa điểm: Bộ môn Bệnh Học Phân Tử - Viện Di Truyền Nông Nghiệp 3.1.2. Đối tượng nghiên cứu - Mẫu củ khoai tây bị bệnh thối nhũn. - Mẫu củ khoai tây sạch bệnh. - Các chủng vi khuẩn gây bệnh sản sinh AHLs: Erwinia cartovora subsp. carotovora (Ecc) gây bệnh thối nhũn khoai tây - Chủng vi khuẩn chỉ thị Chromobacterium violaceum CV026 có khả năng phản ứng với các phân tử AHLs và hình thành sắc tố màu tím (violacein). 3.1.3. Môi trường dùng trong nghiên cứu + Môi trường YPDA dùng trong phân lập và nuôi cấy vi khuẩn: Cao nấm men 1,5 g; Peptone 0,3 g; Glucose 1,5 g; Nước cất 1000 ml; Agar 20 g; pH 7,2; Khử trùng 121 o C trong 15 phút + Môi trường LB dùng trong nuôi cấy, thử khả năng phân hủy AHLs: Tryptone 10g; Cao nấm men 5g; NaCl 5g; Nước cất 1000 ml; Agar 20; pH 7,2; Kkhử trùng 121ºC trong 15 phút + Sữa gầy (skimmed milk) dùng trong bảo quản các chủng vi khuẩn: 10% skim milk; 0,05 % L-Glutamic Acid; khử trùng 121ºC trong 15 phút 3.1.4. Dụng cụ, thiết bị Các thiết bị và máy móc của Bộ môn Bệnh học Phân tử, Viện Di truyền Nông nghiệp, bao gồm một số thiết bị chính như: tủ cấy an toàn sinh học NUAIRE (Mỹ), nồi khử trùng OMRON (Nhật Bản), máy ly tâm lạnh UNIVERSAL (Mỹ), cân điện tử AND (Anh), lò vi sóng, máy chụp ảnh gel, máy đo pH HORIBA (Nhật Bản), máy PCR, tủ lạnh giữ giống VESTROST (Đan Mạch), tủ nuôi cấy JEIOTECH (Hàn Quốc), bể điện di MUPID (Nhật Bản), tủ sấy LENTON (Anh), máy khuấy từ FISHER (Mỹ)… Dụng cụ: đĩa Petri, Pipette các loại, ống Fancol, ống nghiệm, ống eppendorf, ống đong, đèn cồn, bình tam giác (50, 100, 250 ml), bình Schott, que cấy… 3.2. Phương pháp nghiên cứu 3.2.1. Phương pháp nghiên cứu vi khuẩn gây bệnh thối nhũn khoai tây Ecc 3.2.1.1. Điều tra và thu thập mẫu bệnh - Mẫu khoai tây bị bệnh thối nhũn được thu thập từ các chợ đầu mối trên địa bàn Hà Nội và trên các cánh đồng trồng khoai tây khu vực Thường Tín, Đông Anh, Sóc Sơn. - Các mẫu bệnh được thu dựa trên triệu chứng thối nhũn điển hình: mô bệnh bị thối, có màu kem đến màu nâu, ướt, nhũn. Quá trình thối bắt đầu trên bề mặt củ và ăn sâu vào bên trong. Ranh giới giữa mô bệnh và khỏe rõ ràng bởi đường viền tối màu hoặc đen (Hình 1). Thường thối nhũn không có mùi trong giai đoạn đầu phân hủy, nhưng khi có sự xâm nhiễm thứ cấp có mùi rất khó chịu. Hình 1: Mẫu khoai tây bị bệnh thối nhũn Mẫu bệnh thu thập được để riêng biệt trong túi báo, bảo quản ở nhiệt độ 4 o C cho đến khi phân lập vi khuẩn gây bệnh. 3.2.1.2. Phân lập vi khuẩn gây bệnh Phân lập vi khuẩn gây bệnh được tiến hành theo phương pháp của Furuya và cộng sự (2002) theo các bước sau: - Rửa mẫu dưới vòi nước và sau đó xịt cồn 70% trên toàn mẫu. - Cắt những miếng nhỏ (1x1cm) giữa vùng bị bệnh và vùng không bị bệnh trên 3 điểm khác nhau của mẫu bệnh, sau đó đặt vào đĩa Petri đã khử trùng. - Nhỏ 1ml nước cất đã khử trùng vào sau đó nghiền nát để lấy dịch gốc. Chuẩn bị 6 ống eppendorf 1.5ml, mỗi ống chứa 900µl nước cất khử trùng. - Hút 100µl dịch gốc nhỏ vào ống 1 trộn đều, tiếp tục hút 100µl dịch từ ống 1 nhỏ sang ống 2 và làm lần lượt cho đến ống thứ 6 để được các nồng độ pha loãng. - Lấy 100µl từ các ống eppendorf với 6 nồng độ đã được pha loãng nhỏ lần lượt vào các đĩa môi trường YPDA và trang đều trên bề mặt đĩa. - Để mẫu trong tủ 28 o C, sau 24 giờ kiểm tra khuẩn lạc. Mô tả đặc điểm của các khuẩn lạc trên đĩa, sau đó chuyển cấy vào môi trường YPDA mới. - Bảo quản các chủng vi khuẩn đã phân lập được trong sữa tách béo 10% ở -20 o C để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo. 3.2.1.3. Đánh giá độc tính của tác nhân gây bệnh trên củ khoai tây trong phòng thí nghiệm Độc tính của các tác nhân gây bệnh được đánh giá trong phòng thí nghiệm bằng phương pháp lây nhiễm trực tiếp lên lát cắt củ khoai tây (Nguyễn Thanh Hà và cs., 2013) theo các bước sau: - Củ khoai tây được rửa sạch dưới vòi nước chảy. Xịt cồn 70% lên bề mặt của củ. Sau đó, củ khoai tây được cắt thành những lát có chiều dầy khoảng 1cm và đặt trong đĩa petri. - Dùng đầu tăm nhọn đã khử trùng lấy nguồn khuẩn nhiễm đã được cấy trên YPDA sau 24 giờ, đâm đều xung quanh lát cắt khoai tây, mỗi lần lấy nguồn khuẩn nhiễm sử dụng cho 2-3 lỗ châm. - Đối chứng dương được sử dụng là chủng vi khuẩn Erwinia carotovora subsp. carotovora ATCC175713 T (Ecc), gây bệnh thối nhũn điển hình. Đối chứng âm được sử dụng với nước cất khử trùng. - Mẫu khoai tây sau khi nhiễm được đặt trên giấy thấm ẩm trong đĩa Petri và ủ ở 28 o C. Quan sát triệu chứng và mức độ biểu hiện bệnh sau 24h, 48h. Mỗi chủng vi khuẩn được lây nhiễm trên 3 lát cắt. Thí nghiệm được lặp lại 3 lần. 3.2.1.4. Xác định khả năng sản sinh AHLs Khả năng sản sinh AHLs của vi khuẩn gây bệnh được tiến hành theo phương pháp đồng nuôi cấy của Molina và cộng sự (2003) (Hình 2) với một số thay đổi như sau: - Chủng vi khuẩn chỉ thị CV026 và Ecc được cấy trên môi trường LB và YPDA tương ứng và ủ ở 28 o C trong 48 giờ. - Các chủng vi khuẩn nghiên cứu được cấy trên môi trường YPDA và ủ ở 28 o C trong 24 giờ. - Các chủng vi khuẩn được cấy vạch thành một đường trên môi trường LB, kèm sát bên phải là chủng vi khuẩn chỉ thị CV026 cũng được cấy vạch thành một đường, tạo thành 2 đường cấy song song. - Đối chứng dương gồm hai chủng Ecc và CV026 cấy sát nhau. Đối chứng âm là chủng Ecc và chủng CV026 được cấy riêng biệt. - Mẫu được để trong tủ 28 o C. Thí nghiệm được làm nhắc lại 3 lần và kết [...]... đối chứng P2.6.1 Chủng 1.6 có ý nghĩa trong phòng trừ bệnh thối nhũn trên khoai tây do chủng vi khuẩn gây bệnh P2.6.1 cụ thể: chủng vi khuẩn nội sinh này làm giảm trọng lượng mô thối nhiễm bệnh từ 75 - 90% so với công thức đối chứng không xử lý vi khuẩn nội sinh (ở cả 3 phương pháp lây nhiễm) (Bảng 4) 3.3.7 Phân loại và đánh giá mức độ an toàn sinh học của chủng vi khuẩn nội sinh 1.6 3.3.7.1 Phân loại... chủng vi khuẩn có hiệu lực cao trong phòng trừ bệnh thối nhũn khoai tây là những chủng nội sinh thực vật Kết quả thí nghiệm được đánh giá sau 1 tuần bảo quản củ khoai tây nhiễm VKNS ở nhiệt độ phòng Chủng vi khuẩn nội sinh 1.6 có hoạt lực phòng trừ bệnh cao, với khả năng xâm nhập, tồn tại và phát triển trong mô cây chủ với mật độ khá cao, cụ thể với mật độ tế bào vi khuẩn nội sinh đạt 4,6x10 4cfu/g sinh. .. là chủng vi khuẩn nội sinh rất có triển vọng trong phòng trừ bệnh thối nhũn khoai tây và là nguyên vật liệu để sản xuất chế phẩm sinh học phục vụ sản xuất nông nghiệp IV KẾT LUẬN Từ những kết quả nghiên cứu trên, chúng tôi đưa ra một số kết luận sau: - Từ 10 mẫu khoai tây bị bệnh thối nhũn điển hình, đã phân lập được 98 chủng vi khuẩn có hình thái khuẩn lạc đa dạng Trong số 98 chủng vi khuẩn phân lập... thối nhũn củ khoai tây của chủng 1.6 được tiến hành sử dụng chủng vi khuẩn gây bệnh P2.6.1 Đây là chủng gây bệnh có độc tính mạnh đã phân lập, tuyển chọn từ mẫu khoai nhiễm bệnh thu thập được Thí nghiệm cũng được tiến hành bởi 3 phương pháp lây nhiễm: - Phương pháp 1: Lây nhiễm đồng thời vi khuẩn nội sinh và vi khuẩn gây bệnh - Phương pháp 2: Lây nhiễm vi khuẩn nội sinh trước 24h sau đó lây nhiễm vi. .. chủng có khả năng sản sinh AHLs Trong số 6 chủng vi khuẩn này, có 2 chủng P.2.5.1 và P.2.6.1 sản sinh AHLs và có khả năng gây bệnh thối nhũn trên lát cắt củ khoai tây - Từ 25 mẫu củ khoai tây sạch bệnh đã phân lập được 100 chủng VKNS Trong số đó, đã tuyển chọn được duy nhất chủng VKNS 1 6 có khả năng phân hủy AHLs chuỗi ngắn và có khả năng phòng trừ bệnh thối nhũn trên lát cắt củ khoai tây với hiệu quả... - Đối chứng âm: củ khoai tây được ngâm trong 500ml nước cất vô trùng trong 30 phút - Thí nghiệm: củ khoai tây được ngâm trong 500ml dịch khuẩn nội sinh trong 30 phút; Mỗi chủng nội sinh sử dụng 3 củ khoai tây, đặt trong rổ nhựa lưới và giữ ở nhiệt độ phòng 3.2.6.4 Đánh giá kết quả thí nghiệm - Mỗi củ khoai tây được khử trùng bề mặt bằng cồn 70% trong 3 phút và rửa 3 lần với nước cất vô trùng trong box... sản sinh AHLs yếu ( - ) : Không có khả năng sản sinh AHLs Hình 6: Khả năng sản sinh AHLs chuỗi ngắn của chủng vi khuẩn gây bệnh P.2.6.1 3.3.4 Phân lập và tuyển chọn các chủng vi khuẩn nội sinh từ củ khoai tây Từ 25 mẫu củ khoai tây sạch bệnh được thu thập từ các chợ đầu mối trên địa bàn Hà Nội và một số vùng trồng khoai tây ở Thường Tín, Đông Anh, chúng tôi đã phân lập, tuyển chọn được 100 chủng vi khuẩn. .. mẫu trong tủ 280C, sau 48h kiểm tra và đếm số lượng khuẩn lạc 3.2.7 Quy trình xử lý VKNS để phòng trừ bệnh hiệu quả (đang tiến hành) 3.3 Kết quả nghiên cứu 3.3.1 Phân lập, tuyển chọn các chủng vi khuẩn gây bệnh thối nhũn từ củ khoai tây Từ 10 mẫu khoai tây bị bệnh thối nhũn điển hình được thu thập từ các chợ đầu mối trên địa bàn Hà Nội và các vùng trồng khoai tây ở Thường Tín, Đông Anh, Sóc Sơn, phân. .. vạch cấy của chủng vi khuẩn chỉ thị không màu (màu của khuẩn lạc vi khuẩn) (Hình 3) Hình 3: Phương pháp xác định VKNS phân hủy AHLs 3.2.4 Đánh giá khả năng ức chế sự phát triển của vị khuẩn gây bệnh thối nhũn và triệu chứng bệnh trên lát cắt củ khoai tây của VKNS 3.2.4.1 Chuẩn bị lát cắt củ khoai tây - Rửa củ khoai tây dưới vòi nước chảy cho hết bùn đất và để ráo nước - Cắt lát khoai tây và khoan một... và cấp độ an toàn sinh học phù hợp kỹ thuật xét nghiệm thì chủng vi khuẩn nội sinh 1.6 được đánh giá thuộc nhóm nguy cơ 1, có nghĩa là vi khuẩn không có khả năng gây bệnh cho người 3.3.8 Khả năng tồn tại của chủng vi khuẩn nội sinh 1.6 trong mô cây chủ Vi khuẩn nội sinh đối kháng có mối quan hệ mật thiết với cây chủ, chúng có khả năng tồn tại với mật độ cao trong mô của củ khoai tây Mục tiêu của nghiên . nghiên cứu: " ;Ứng dụng vi khuẩn nội sinh phân hủy N-acyl-L-homoserine lactones (AHLs) trong phòng trừ bệnh thối nhũn khoai tây& quot;. II. TỔNG QUAN VẤN ĐỀ 1. Mục tiêu nghiên cứu - Phân lập và định. chủng vi khuẩn nội sinh phân hủy AHLs có khả năng ức chế sự phát triển của vi khuẩn thối nhũn từ khoai tây với hiệu quả cao và ổn định. - Thử nghiệm các chủng vi khuẩn nội sinh để phòng trừ bệnh thối. tài Ở Vi t Nam: Hiện chưa có nghiên cứu nào vè cơ chế gây bệnh của vi khuẩn gây bệnh thối nhũn cũng như sử dụng các chủng vi khuẩn nội sinh đối kháng để phân hủy AHLs của vi khuẩn gây bệnh trong phòng