Nghiên cứu các đặc tính sinh học và tiềm năng ứng dụng của chủng vi khuẩn bacillus amyloliquefaciens subsp plantarum SP 1901 phân lập tại rừng quốc gia hoàng liên

Trong công nghiệp thực phẩm, con người đã ứng dụng vi sinh vật để sản xuất ra các loại protein, enzyme, chế phẩm probiotic và các loại thực phẩm lên men truyền thống.. Với khả năng chuyể

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-Phan Lạc Dũng

NGHIÊN CỨU CÁC ĐẶC TÍNH SINH HỌC VÀ TIỀM NĂNG ỨNG

DỤNG CỦA CHỦNG VI KHUẨN BACILLUS AMYLOLIQUEFACIENS SUBSP PLANTARUM SP 1901 PHÂN LẬP TẠI RỪNG QUỐC GIA

HOÀNG LIÊN

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội - Năm 2013 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-Phan Lạc Dũng

NGHIÊN CỨU CÁC ĐẶC TÍNH SINH HỌC VÀ TIỀM NĂNG ỨNG

DỤNG CỦA CHỦNG VI KHUẨN BACILLUS AMYLOLIQUEFACIENS SUBSP PLANTARUM SP 1901 PHÂN LẬP TẠI RỪNG QUỐC GIA

HOÀNG LIÊN

Chuyên ngành: Vi sinh vật học

Mã số: 60 42 40

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC

Tôi xin chân thành cảm ơn các cán bộ, anh chị đang làm việc tại Viện Vi sinh vật và Công nghệ Sinh học - Đại học Quốc gia Hà Nội đã giúp đỡ tôi trong quá trình hoàn thành luận văn.

Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo trong Bộ môn Vi sinh vật học nói riêng và Khoa Sinh học nói chung đã dạy dỗ tôi trong quá trình học tập.

Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè đã luôn động viên, giúp đỡ, hỗ trợ để tôi có thể hoàn thành luận văn này.

1.1 VI KHUẨN BACILLUS AMYLOLIQUEFACIENS 31.1.1 Tổng quan về Bacillus amyloliquefaciens 3

1.1.4 Đặc điểm sinh học và phân bố trong tự nhiên 51.2 ỨNG DỤNG CỦA BACILLUS AMYLOLIQUEFACIENS 5

1.2.1 Sản xuất enzyme công nghiệp 51.2.2 Sản xuất chất kháng sinh 61.2.3 Sản xuất phân bón vi sinh 61.2.4 Sản xuất chế phẩm probiotics 71.3 MỘT SỐ ENZYME CÔNG NGHIỆP QUAN TRỌNG 7

2.3.1 Nuôi cấy giống khởi động 162.3.2 Phân tích trình tự đa gen 162.3.3 Đặc điểm sinh học của chủng vi khuẩn nghiên cứu 182.3.4 Lựa chọn môi trường và thời gian nuôi cấy thích hợp cho khả năng

2.3.5 Phương pháp xác định protein 212.3.6 Phương pháp xác định hoạt độ enzyme ngoại bào 212.3.7 Tách chiết và tinh sạch enzyme ngoại bào 252.3.8 Xác định đặc tính enzyme ngoại bào 27CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 283.1 LỰA CHỌN CHỦNG VI KHUẨN NGHIÊN CỨU 28

3.1.2 Cây phân loại dựa trên trình tự 16S rDNA 283.1.3 Cây phân loại dựa trên trình tự đa gen 29

3.2 ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA CHỦNG SP 1901 30

3.2.2 Đặc điểm sinh học của chủng SP 1901 313.3 TÁCH CHIẾT VÀ TINH SẠCH ENZYME NGOẠI BÀO 383.3.1 Lựa chọn môi trường và thời gian nuôi cấy thích hợp 383.3.2 Tinh sạch enzyme ngoại bào bằng phương pháp sắc ký trao đổi ion 413.3.3 Tinh sạch enzyme bằng phương pháp sắc ký lọc gel 433.3.4 Xác định trọng lượng phân tử xylanase bằng điện di SDS-PAGE 443.3.5 Hiệu quả tinh sạch xylanase từ chủng SP 1901 45

Bảng 3.2 Khả năng đồng hoá các loại đường………. 34

Bảng 3.3 Khả năng lên men các loại đường……… 35

Bảng 3.4 Khả năng sinh enzyme ngoại bào theo phương pháp sử dụng kit API

DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Cấu trúc hóa học của xylan và các vị trí tấn công của hệ thống

Hình 1.2 Cấu trúc hóa học của amylose và amylopectin………. 11

Hình 1.3 Phản ứng thủy phân liên kết peptide của chuỗi polypeptide……… 13

Hình 2.1 Đồ thị đường chuẩn theo thang BSA………. 21

Hình 2.2 Đồ thị đường chuẩn theo thang xylose……… 22

Hình 2.3 Đồ thị đường chuẩn theo thang glucose……… 23

Hình 2.4 Đồ thị đường chuẩn theo thang L-tyrosine……… 24

Hình 3.1 Cây phát sinh chủng loại của 37 chủng vi khuẩn Bacillus phân lập tại rừng Quốc gia Hoàng Liên và 9 loài thuộc nhóm vi khuẩn B subtilis dựa trên phân tích trình tự 16S rDNA……….………… 28

Hình 3.2 Cây phát sinh chủng loại của các loài vi khuẩn thuộc nhóm B subtilis……….……… 30

Hình 3.3 Hình thái khuẩn lạc chủng SP 1901 (a), hình thái tế bào khi nhuộm gram (b) và soi nổi (c) ……….……… 31

Hình 3.4 pH sinh trưởng tối ưu (a) Khả năng chịu muối NaCl (b) Khả năng chịu dịch dạ dày (c) Khả năng chịu muối mật (d) ……… 31

Hình 3.5 Khả năng sinh chất kích thích sinh trưởng IAA của chủng SP 1901 sau 24, 48 và 72 giờ……….……… 32

Hình 3.6 Khả năng sinh IAA làm cho dung dịch chuyển từ màu vàng sang đỏ (a) Ảnh hưởng của chủng SP 1901 lên khả năng sinh trưởng của cây ngô sau 10 ngày trồng (b) ……….……… 32

Hình 3.7 Vòng phân giải cơ chất của các enzyme ngoại bào Amylase (a) Cellulase (b) Phytase (c) Protease (d) Xylanase (e) ……… 36

Hình 3.8 Phản ứng thử nghiệm khả năng sinh enzyme trên thanh thử API ZYM……….……… 37

Hình 3.9 Khả năng sinh kháng sinh của chủng SP 1901 theo phương pháp khuếch tán trên thạch Đĩa thạch cấy sẵn vi khuẩn E coli (a) Vi khuẩn Shigella sp (b) Vi khuẩn S aureus (c) ……… 38

Hình 3.10 Khả năng sinh trưởng trên các môi trường khác nhau (a, b) và hoạt độ xylanase ngoại bào (c, d) của chủng SP 1901 khi nuôi cấy trên 10 loại môi trường ở các giờ khác nhau……….……… 39

Hình 3.11 Hoạt độ xylanase (U/ml) và nồng độ protein (mg/ml) khi nuôi cấy trên môi trường có bổ sung CMC và glucose và môi trường NA dịch thể tại các giờ khác nhau……….……… 39

Hình 3.12 Hoạt tính amylase và protease của chủng SP 1901 trên môi trường có bổ sung CMC và glucose và môi trường NA dịch thể……… 40

Hình 3.13 Hoạt độ xylanase và nồng độ protein ở các phân đoạn trong sắc ký

Hình 3.14 Hoạt độ amylase và nồng độ protein ở các phân đoạn trong sắc ký

trao đổi ion gel DEAE Sepharose……….………… 42

Hình 3.15 Hoạt độ protease và nồng độ protein ở các phân đoạn trong sắc ký

Hình 3.16 Hoạt độ xylanase ở các phân đoạn trong sắc ký lọc gel………… 43

Hình 3.17 Hoạt độ amylase ở các phân đoạn trong sắc ký lọc gel………… 44

Hình 3.18 Hoạt độ protease ở các phân đoạn trong sắc ký lọc gel………… 44

Hình 3.19 Điện di SDS-PAGE 2 mẫu xyl 29 và xyl 36……… 45

Hình 3.20 Nhiệt độ hoạt động tối ưu của xyl 29, xyl 36, amylase và protease từ

Hình 3.25 Bản chạy sắc ký lớp mỏng để phân tích sản phẩm thủy phân từ cơ

chất xylan bởi xylanase của chủng SP 1901……… 52

CÁC KÝ HIỆU VIẾT TẮT

BSA Bovine serum albumin

CMC Carboxymethyl cellulose

DNA Deoxyribonucleic axít

DNS Dinitrosalicylic

IAA Indole-3-acetic axít

PAGE Polyacrylamide gel electrophoresisPCR Polymerase chain reaction

RNA Ribonucleic axít

SDS Sodium dodecyl sulfate

ĐẶT VẤN ĐỀ

Ngày nay, việc ứng dụng vi sinh vật vào trong đời sống và sản xuất đã trở nên rất phổ biến Con người đã và đang khai thác triệt để nguồn tài nguyên vi sinh vật trong nhiều lĩnh vực khác nhau Trong y học, nhờ có vi sinh vật mà con người

đã tổng hợp thành công nhiều loại chế phẩm như vacxin, kháng sinh, hormone, vitamin giúp phòng ngừa và điều trị nhiều loại bệnh cho con người Trong nông nghiệp, nhiều chế phẩm sinh học có nguồn gốc từ vi sinh vật đã được sản xuất để diệt trừ sâu bệnh hại cây và làm phân bón vi sinh Trong công nghiệp thực phẩm, con người đã ứng dụng vi sinh vật để sản xuất ra các loại protein, enzyme, chế phẩm probiotic và các loại thực phẩm lên men truyền thống Ngoài ra, vi sinh vật còn được ứng dụng vào trong xử lý rác thải hữu cơ và nước thải trong sản xuất công nghiệp Với khả năng chuyển hóa mạnh mẽ và sinh sản nhanh chóng, vi sinh vật đóng một vai trò to lớn trong hệ sinh thái tự nhiên và trong các hoạt động cải thiện chất lượng cuộc sống của con người

Bacillus là một trong những vi sinh vật đầu tiên được phát hiện và mô tả

trong giai đoạn đầu của tiến trình phát triển ngành vi sinh vật học ở cuối thế kỷ 19 Đây là một chi lớn với gần 200 loài vi khuẩn hiếu khí, hình que và có khả năng sinh nội bào tử Chúng phân bố rộng rãi trong các hệ sinh thái tự nhiên, từ trên cạn đến dưới nước, từ nước ngọt đến nước mặn và từ ven bờ đến đáy các Đại Dương Ngoài

các loài vi khuẩn gây bệnh cho con người như B anthracis và B cereus, nhiều loài

vi khuẩn thuộc chi Bacillus đặc biệt là nhóm B subtilis có tính ứng dụng cao trong

nhiều lĩnh vực như y dược học, nông nghiệp, công nghiệp thực phẩm và xử lý môi

trường Do đó, các loài thuộc chi Bacillus đã và đang ngày càng trở thành những vi

sinh vật quan trọng hàng đầu về mặt ứng dụng

Nhằm góp phần tìm hiểu thêm kiến thức về chi Bacillus nói chung và ứng dụng của các loài thuộc nhóm B subtilis nói riêng, chúng tôi tiến hành đề tài:

“Nghiên cứu các đặc tính sinh học và tiềm năng ứng dụng của chủng vi

khuẩn Bacillus amyloliquefaciens subsp plantarum SP 1901 phân lập tại rừng

Quốc gia Hoàng Liên” với 4 mục tiêu chính sau:

(i) Tuyển chọn các chủng vi khuẩn thuộc nhóm B subtilis phân lập tại rừng

Quốc gia Hoàng Liên

(ii) Sử dụng kỹ thuật phân tích trình tự đa gen để phân loại chính xác các chủng

vi khuẩn nghiên cứu đến cấp độ loài và dưới loài

(iii) Tìm hiểu các đặc tính sinh học quý của chủng vi khuẩn được lựa chọn.

(iv) Tách chiết, tinh sạch và đánh giá sơ bộ đặc tính các enzyme ngoại của chủng vi khuẩn nghiên cứu

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1 VI KHUẨN BACILLUS AMYLOLIQUEFACIENS

1. Tổng quan về Bacillus amyloliquefaciens

Bacillus amyloliquefaciens là một loài vi khuẩn thuộc nhóm Bacillus subtilis [45] B subtilis được Christion Erenberg phát hiện lần đầu tiên vào năm 1835, tên của loài vi khuẩn này lúc bấy giờ là “Vibrio subtilis” Năm 1872, nhà sinh học người Đức Ferdinand Cohn đã đặt tên cho loài vi khuẩn này là Bacillus subtilis Trong thế chiến thứ hai, tổ chức y học Nazi (Đức) đã dùng B subtilis để phòng bệnh lị cho các binh lính chiến đấu ở Bắc Phi Từ đó đến nay, B subtilis đã được nghiên cứu và sử dụng rộng rãi trên Thế giới Thuật ngữ “Subtilis therapy” (điều trị bằng subtilis) ra đời từ đó và B subtilis ngày càng được sử dụng rộng rãi để phòng

ngừa và điều trị các loại bệnh về rối loạn đường tiêu hóa, các chứng viêm ruột,

viêm đại tràng và tiêu chảy Hiện nay, B subtilis đã được chứng minh có tiềm năng

to lớn trong nhiều lĩnh như chăn nuôi, công nghiệp, xử lý môi trường [8]

Vi khuẩn B subtilis có mặt ở hầu hết các loại môi trường tự nhiên Phần lớn

cư trú trong đất, rơm rạ và cỏ khô nên được gọi là “trực khuẩn cỏ khô” Ngoài ra,

chúng còn có mặt trong các nguyên liệu sản xuất như bột mì (trong bột mì B subtilis chiếm 75-79% vi khuẩn tạo bào tử), bột gạo và trong các thực phẩm như

mắm, tương và chao [12]

B subtilis có vai trò to lớn trong việc giữ ổn định hệ vi sinh vật đường ruột

bằng cơ chế cạnh tranh sinh tồn và khả năng gây ức chế các vi khuẩn gây bệnh khác

do tác dụng của những sản phẩm ngoại bào của nó Công trình nghiên cứu của

Work và cộng sự năm 1959 đã cho thấy B subtilis có hệ thống enzyme tương đối hoàn chỉnh, có khả năng thủy phân carbohydrate và protein Ngoài ra, B subtilis

còn có khả năng tổng hợp một số chất kháng sinh như bacitracin, bacilysin, bacillomicin, bacillopectin, mycobacillin, subtilin và prolimicin Những chất này có tác dụng ức chế sinh trưởng hoặc tiêu diệt một số vi sinh vật khác Chúng tác dụng lên cả vi khuẩn gram âm, gram dương và nấm gây bệnh [9]

Nhóm B subtilis gồm ít nhất 9 loài vi khuẩn là B amyloliquefaciens, B atrophaeus, B axarquiensis, B malacitensis, B mojavensis, B sonorensis, B tequilensis, B vallismortis và B velezensis Kết quả phân tích trình tự đoạn gen 16S

rRNA cho thấy mức độ tương đồng giữa chúng rất cao (> 99%) Bên cạnh đó,

phương pháp phân loại truyền thống dựa trên hình dạng khuẩn lạc, hình thái tế bào

và bào tử cũng như các đặc điểm sinh hóa không có khả năng phân tách các loài

này Vì vậy, 9 loài vi khuẩn trên thường được gọi theo một thuật ngữ chung là nhóm vi khuẩn B subtilis [45].

Gần đây, bên cạnh việc phân tích trình tự gen 16S rRNA các nhà khoa học

đã sử dụng phương pháp phân tích trình tự đa gen trong việc phân loại vi khuẩn đến

cấp độ loài và dưới loài [25] Đặc biệt trong nhóm B subtilis, bằng phương pháp

phân tích trình tự đa gen và xây dựng cây phát sinh chủng loại, nhiều loài trong

nhóm này đã được phân tách thành các loài phụ như B subtilis được phân thành B subtilis subsp subtilis, B subtilis subsp spizizenii và B subtilis subsp inaquosorum; B amyloliquefaciens được phân thành B amyloliquefaciens subsp amyloliquefaciens và B amyloliquefaciens subsp plantarum [42].

Phân loại các loài trong nhóm B subtilis nói chung và B amyloliquefaciens

nói riêng đòi hỏi phải có sự tổ hợp của nhiều phương pháp phân loại hiện đại Hiện nay ở Việt Nam hầu như chưa có bất cứ một nghiên cứu nào công bố chính xác một loài vi khuẩn phân lập trong hệ sinh thái tự nhiên đến cấp độ dưới loài dựa trên việc phân tích trình tự đa gen

2 Lịch sử phát hiện

B amyloliquefaciens được Fukomoto phát hiện vào năm 1943 nhờ khả năng

sinh α-amylase và protease Tại thời điểm đó, loài vi khuẩn này chưa được xếp loại trong bảng Danh pháp Vi khuẩn Cho đến năm 1975, theo điều 24a và 28a trong Bộ

luật Quốc tế về Danh pháp Vi khuẩn thì cái tên B amyloliquefaciens mới được công

bố [43]

Thời gian đầu, loài vi khuẩn này được xem là dòng khác của B subtilis hay loài phụ B subtilis subsp amyoliquefaciens B amyloliquefaciens mang rất nhiều đặc điểm tương đồng với các loài B subtilis, B licheniformis và B pumilus Bằng

các phương pháp phân loại thông thường rất khó để phân biệt giữa chúng Đến năm

1987, B amyloliquefaciens mới được tách ra thành một loài riêng dựa vào kết quả lai DNA lần lượt là 23, 15 và 5% so với các loài B subtilis, B licheniformis và B pumilus [43].

Từ đó đến nay, nhiều chủng B amyloliquefaciens phân lập từ các hệ sinh

thái khác nhau ở các vùng địa lý khác nhau đã được công bố Năm 2010, Borriss và cộng sự đã chứng minh sự khác biệt về chỉ số lai DNA, chỉ số so sánh hệ gen bằng

kỹ thuật microarray, tính tương đồng của toàn bộ hệ genome và phổ các chất hoạt

tính lipopeptide và polypeptide giữa một nhóm B amyloliquefaciens DSM7 không

có khả năng và một nhóm B amyloliquefaciens FZB42 có khả năng sống nội cộng sinh rễ cây thực vật Dựa vào kết quả thu được, Borriss đã đề xuất tách B amyloliquefaciens thành 2 nhóm loài phụ là B amyloliquefaciens subsp plantarum (có khả năng sống nội cộng sinh rễ cây thực vật) và B amyloliquefaciens subsp amyloliquefaciens (không có khả năng sống nội cộng sinh rễ cây thực vật) [23].

Loài: Bacillus amyloliquefaciens

4 Đặc điểm sinh học và phân bố trong tự nhiên

B amyloliquefaciens thường có mặt trong các mẫu đất tự nhiên Đây là loài

vi khuẩn hiếu khí, hình que, Gram dương, sinh nội bào tử, có khả năng di động và

kích thước tế bào 3,0-4,0 × 0,7-1,5 µm Đặc biệt, có một số chủng vi khuẩn B amyloliquefaciens có khả năng sống nội cộng sinh rễ cây thực vật [23].

2 ỨNG DỤNG CỦA BACILLUS AMYLOLIQUEFACIENS

5 Sản xuất enzyme công nghiệp

Loài vi khuẩn này được biết đến từ rất sớm nhờ khả năng sản sinh các loại

enzyme ngoại bào đa dạng Từ những năm 1943, B amyloliquefaciens đã được sử

dụng để sản xuất 2 loại enzyme công nghiệp là α-amylase và protease [43] Enzyme

từ B amyloliquefaciens như amylase, xylanase, cellulase, protease và lipase có

nhiều đặc tính quý như khả năng hoạt động tốt trong dải pH rộng và khả năng bền

nhiệt Do đó, enzyme từ B amyloliquefaciens đã được ứng dụng nhiều trong công

nghiệp chế biến thực phẩm, công nghiệp dệt may, công nghiệp giấy và công nghiệp sản xuất chất tẩy rửa [21]

Bên cạnh đó, nhóm B amyloliquefaciens sống nội cộng sinh rễ cây thực vật

có khả năng sinh phytase đã được công bố và gen mã hóa phytase của chúng đã

được biểu hiện thành công trên chủng B subtilis MU331 [31] Phytase là enzyme phân giải phytate khó tan trong các loại rau, củ và quả thành myo-inositol và các

dạng phosphate hòa tan dễ hấp thụ trong hệ tiêu hóa động vật Vì vậy, phytase đã được bổ sung vào thức ăn chăn nuôi nhằm nâng cao hiệu quả sử dụng thức ăn cho nhóm động vật dạ dầy đơn và làm giảm nguy cơ ô nhiễm môi trường do hàm lượng phosphate dư thừa thải ra môi trường nước [29]

6 Sản xuất chất kháng sinh

Các loài thuộc nhóm B subtilis đã được biết đến nhờ khả năng sinh các chất

kháng sinh kháng vi khuẩn và nấm gây bệnh hoặc sản sinh các sản phẩm trao đổi bậc hai khác như chất kháng virus, chất kháng ung thư và chất ức chế miễn dịch

[47] Chất kháng sinh từ Bacillus có bản chất là các peptide được tổng hợp qua

ribosome (còn gọi là bacteriocin hoặc lantibiotics) Lantibiotics có phổ kháng khuẩn hẹp và thường ứng dụng trong bảo quản thực phẩm Nhiều chất kháng sinh có bản

chất peptide tổng hợp không qua ribosome cũng đã được công bố từ loài B amyloliquefaciens như bacylicin, lipopeptide (surfactin, fengycin, iturin và

bacillomycin) và polyketide (difficidin, bacillaene và macrolactin) [18] [38] Bacylicin là chất dipeptide được tạo nên từ L-analine và một amino axít hiếm L-

anticapsin Bacylicin có khả năng ức chế vi khuẩn Erwinia amylovora gây bệnh

cháy lá trên táo và lê Surfactin hoạt động như chất tẩy rửa trên màng tế bào Chất này có tính kháng khuẩn, kháng virus và kháng viêm Iturin, fengycin và bacillomycin là các lipopeptide vòng có tính kháng nấm gây bệnh cây Nghiên cứu

gần đây cho thấy, một số chất peptide giống iturin từ B amyloliquefaciens có khả năng diệt Paenibacillus larvae gây bệnh trên ong mật [22] Difficin là chất kháng

sinh phổ rộng, chất này ức chế quá trình tổng hợp protein và có khả năng ức chế

Erwinia amylovora Bacillaene cũng là một chất ức chế tổng hợp protein ở tế bào

prokaryotes Macrolactin là một chất kháng khuẩn Gram dương

7 Sản xuất phân bón vi sinh

Một số chủng B amyloliquefaciens sống nội cộng sinh trên rễ cây thực vật

có khả năng sinh chất kích thích sinh trưởng Indole-3-acetic axít (IAA) Chất này sẽ tác động tích cực đến những quá trình sinh lý của thực vật như quang hướng động, địa hướng động, ưu thế chồi ngọn và sự tượng rễ Yao và cộng sự (2012) đã thử

nghiệm bổ sung chế phẩm chứa vi khuẩn B amyloliquefaciens FZB24 lên cây bông

Kết quả cho thấy, sản lượng bông thu hoạch được tăng 30% so với đối chứng bổ sung đạm NPK [56] Trong nghiên cứu Idris và cộng sự (2007), tác giả đã thử khả

năng sinh chất kích thích sinh trưởng indole-3-acetic axít của chủng vi khuẩn B amyloliquefaciens FZB42 lên bèo tấm Kết quả cho thấy, trọng lượng tươi của bèo tấm khi thu hoạch có sự gia tăng đáng kể so với đối chứng Loài vi khuẩn B amyloliquefaciens đã được chứng minh có tiềm năng ứng dụng trong sản xuất phân

bón vi sinh nhờ khả năng sinh các chất kháng nấm và chất kích thích sinh trưởng thực vật [31]

8 Sản xuất chế phẩm probiotics

B amyloliquefaciens là những vi sinh vật an toàn (Generally recognized as

safe; GRAS) và có thể dùng như probiotics để bổ sung vào thức ăn hoặc nước uống nhằm cân bằng hệ vi sinh đường ruột, qua đó ngăn ngừa và phòng chống các bệnh tiêu chảy thường gặp Ngoài ra, vi sinh vật trong probiotics còn tăng cường khả năng chuyển hóa lactose, điều hòa hệ thống miễn dịch và tăng cường sức khỏe con

người [48] [49] Nhiều bằng chứng cho thấy B amyloliquefaciens đã được sử dụng

Xylan là một polysaccharide không đồng nhất, bao gồm các gốc D-xylose liên kết với nhau bằng liên kết β-1,4-xylanosidic giữa đường xylopyranose với acetyl, arabinosyl và glucuronisyl [39]

Hình 1.1 Cấu trúc hóa học của xylan và các vị trí tấn công của hệ thống enzyme

xylanolytic [34]

Thực vật trên cạn có xylan là chuỗi D-xylosyl được nối với nhau bằng liên kết β-1,4, trong khi tảo biển tổng hợp xylan với một cấu trúc hóa học khác gồm các monomer D-xylose nối với nhau bằng liên kết β-1,3 Thông thường, xylan chiếm khoảng 15-30% trọng lượng khô của cây hạt kín và khoảng 7-15% của cây hạt trần Đặc biệt trong cây lá rộng, xylan chiếm tới 35% tổng trọng lượng khô của chúng [35]

Do xylan có cấu trúc không đồng nhất, để thủy phân cấu trúc này cần phải có

hệ thống enzyme xylanolytic Tất cả các enzyme trong hệ thống này tác động tương

hỗ với nhau để phân giải xylan thành các phân tử đường [34]

1.3.1.2 Nguồn sản sinh xylanase

Xylanase được sinh tổng hợp bởi nấm, vi khuẩn, xạ khuẩn và động vật nguyên sinh Trong các loài vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp xylanase, nấm, vi khuẩn và xạ khuẩn là các nhóm quan trọng nhất [57]

Các loại xylanase được sinh ra bởi vi khuẩn và nấm sợi ưa kiềm có khả năng chịu nhiệt tốt hơn và do đó chúng được ứng dụng rộng rãi và cho hiệu quả cao hơn trong công nghiệp [39]

1.3.1.3 Đặc tính hoạt động của xylanase

Axít glutamic là axít amin quyết định sự hoạt động của xylanase [10] Sự thủy phân xylan đòi hỏi sự hỗ trợ hoạt động của các thành phần trong hệ thống

enzyme xylanolytic (hình 1.1.).

Vai trò của các enzyme chính trong hệ thống enzyme xylanolytic cụ thể như

• β-1,4-endo-xylanase và ferulic axít esterase

Enzyme β-1,4-endo-xylanase và ferulic axít esterase là hai enzyme có vai trò chủ đạo trong quá trình thủy phân mạch chính của xylan Trong đó, β -1,4-endo-

xylanase tấn công vào liên kết xylosidic của mạch chính còn ferulic axít esterase tấn

công các liên kết xylosyl còn lại và giải phóng ra các xylooligosaccharide Hai enzyme này là thành phần chính của hệ enzyme xylanolytic do các vi sinh vật sinh

ra, chẳng hạn như các loài thuộc Trichoderma, Aspergillus, Schizophyllum, Bacillus, Clostridium và Streptomyces [55].

Ferulic axít esterase là enzyme ngoại bào exoglycosidase thủy phân các oligosaccharide ngắn và xylobiose thành đường xylose [57] Trong số các cơ chất,

xylobiose thường là cơ chất tốt nhất [39] Hầu hết các ferulic axít esterase được

nghiên cứu cho đến nay đều bị ức chế ngược bởi xylose, một sản phẩm thủy phân của chúng

• α-L-Arabinofuranosidase

α-L-Arabinofuranosidase có khả năng thủy phân cả hai liên kết 1,3 và L-arabinofuranosyl trong arabinoxylan giải phóng arabinose Khi giải phóng arabinose, mạch chính xylan không bị thủy phân và không tạo ra xylooligosaccharide [55]

1,5-α-• α-D-Glucuronidase

α-D-Glucuronidase phân giải liên kết α-1,2 giữa axít glucuronic và gốc xylose trong phân tử glucuronoxylan Tính đặc hiệu của α-glucuronidase là khác nhau phụ thuộc vào nguồn gốc của enzyme [39]

• Acetyl xylan esterase

Acetyl xylan esterase là enzyme có thể cắt đứt liên kết giữa các nhóm acetyl với 2 hoặc 3 vị trí của gốc xylose và góp phần đóng vai trò thủy phân xylan trong tự nhiên [34] Enzyme này thường được sinh ra từ một số loài vi khuẩn và nấm

1.3.1.4 Ứng dụng của enzyme xylanase

Xylanase được ứng dụng trong sản xuất nước hoa quả và làm trong rượu Hơn nữa, xylanase còn có thể hoạt động trong điều kiện nhiệt độ cao (khoảng 60-70oC) nên có thể ngăn chặn được sự nhiễm vi sinh vật khi chế biến nước hoa quả ở

nhiệt độ cao [27].

Xylanase còn được ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm như trong công nghệ sản xuất bánh nướng, hỗ trợ quá trình đường hóa lignocellulose (một polysaccharide khó phân hủy trong thành tế bào thực vật) Xylanase còn được sử dụng để loại lignin khỏi bột giấy

Trong công nghiệp sản xuất giấy và vải sợi, xylanase tham gia vào quá trình tách xylan và lignin để thu cellulose một cách nhanh chóng và dễ dàng Xylanase giúp tẩy màu và làm mềm sợi lanh và sợi gai [11]

Xylan là chất xơ khó phân hủy trong thực vật và là chất khó tiêu trong thức

ăn chăn nuôi Vì thế việc bổ sung xylanase vào khẩu phần ăn của gia súc và gia cầm

sẽ giúp chúng dễ tiêu hóa và dễ hấp thụ thức ăn, đồng thời góp phần làm giảm ô nhiễm môi trường

10 α-amylase

1.3.2.1 Cấu tạo tinh bột và glycogen

Cơ chất tác dụng của amylase và tinh bột và glycogen Tinh bột là nhóm carbohydrate ở thực vật Chúng có chủ yếu ở trong các loại củ và hạt như khoai lang, khoai tây, sắn, củ mì và các loại hạt ngũ cốc Tinh bột từ mọi nguồn khác nhau đều có cấu tạo từ 20-30% amylose và 70-80% amylopectin

Amylose được cấu tạo từ 200-1.000 phân tử D-glucose nối với nhau bởi liên kết α-1,4-glucoside tạo thành một mạch dài không phân nhánh Amylopectin được cấu tạo từ 600-6.000 phân tử D-glucose nối với nhau bởi liên kết α-1,4-glucoside và α-1,6-glucoside tạo thành mạch có nhiều nhánh

Hình 1.2 Cấu trúc hóa học của amylose và amylopectin [14].

Glycogen được ví như tinh bột của động vật Glycogen có cấu tạo giống với tinh bột nhưng mức độ phân nhánh mạnh hơn Cấu tạo của chúng gồm các phân tử glucose nối với nhau bằng liên kết α-1,4-glucoside Ở các vị trí phân nhánh glucose nối với nhau băng liên kết α-1,4-glucoside Glycogen có ở động vật và người, chúng tập trung chủ yếu ở gan

1.3.2.2 Nguồn sản sinh α-amylase

Amylase là hệ enzyme rất phổ biến ở nhiều sinh vật Vi khuẩn và nấm sợi là những nhóm sinh amylase chính Amylase của vi khuẩn có ưu điểm chịu nhiệt tốt hơn của nấm sợi, chúng có thể hoạt động ở nhiệt độ 85-95oC [34]

Các enzyme này thuộc nhóm enzyme thủy phân Có 6 loại amylase được xếp vào 2 nhóm: endoamylase và exoamylase Endoamylase gồm α-amylase và nhóm enzyme khử nhánh Exoamylasse gồm có β-amylase và glucoamylase

1.3.2.3 Đặc tính hoạt động của α-amylase

Đây là một enzyme kim loại, nếu không có sự hiện diện của ion canxi trong phân tử enzyme thì chúng sẽ không hoạt động được α-amylase có khả năng phân cắt các liên kết α-1,4-glucoside nằm ở phía bên trong phân tử cơ chất một cách ngẫu

nhiên không theo một trật tự nào cả α-amylase không chỉ thủy phân hồ tinh bột mà chúng còn có khả năng thủy phân cả hạt tinh bột nguyên thủy.

Quá trình thủy phân tinh bột bở α-amylase là quá trình xảy ra qua nhiều giai đoạn: dextrin hóa  đường hóa  phân cắt polyglucose tạo polyglucose collagen

 sản phẩm thủy phân gồm maltotetrose, maltotriose và maltose

Ở giai đoạn đầu (giai đoạn dextrin hóa): chỉ một số phân tử cơ chất bị thủy phân tạo thành một lượng lớn dextrin phân tử thấp (α-dextrin), độ nhớt của hồ tinh bột giảm nhanh (các amylose và amylopectin đều bị dịch hóa nhanh)

Sang giai đoạn 2 (giai đoạn đường hóa): các dextrin phân tử thấp tạo thành bị thủy phân tiếp tục tạo ra các tetra-trimaltose không cho màu với iodine Các chất này bị thủy phân rất chậm bởi α-amylase cho tới disaccharide và monosaccharide Dưới tác dụng của α-amylase, amylose bị phân giải khá nhanh thành oligosaccharide gồm 6-7 gốc glucose

Sau đó các polyglucose này bị phân cắt tiếp tục tạo nên các mạch polyglucose collagen cứ ngắn dần và bị phân giải chậm đến maltotetrose, maltotriose và maltose

Sau phản ứng, sản phẩm thủy phân của amylose chứa 13% glucose và 87% maltose Tác dụng của α-amylase lên amylopectin cũng xảy ra tương tự nhưng vì không phân cắt được liên kết α-1,6-glycoside ở chỗ mạch nhánh trong phân tử amylopectin nên dù có chịu tác dụng lâu thì sản phẩm cuối cùng ngoài các đường nói trên còn có dextrin phân tử thấp và isomaltose [1]

1.3.2.4 Ứng dụng của α-amylase

Với khả năng thủy phân tinh bột nên α-amylase đã được con người sử dụng

từ rất sớm Trong công nghiệp thực phẩm, người ta thường bổ sung α-amylase vào bột chế biến trong quá trình sản xuất bánh kẹo Hoạt động của α-amylase sẽ làm tăng lượng đường khử, lượng đường khử này sẽ tham gia vào các phản ứng oxy hóa khử Kết quả của quá trình đó sẽ tạo cho bánh kẹo có mùi vị và màu hấp dẫn [2]

Cả α-amylase và β-amylase đều được sử dụng trong sản xuất bánh mì Các loại enzyme này tham gia thủy phân tinh bột thành đường, nhờ đó nấm men

Saccharomyces cerevisiae sẽ dễ dàng chuyển hóa chúng thành cồn và CO2, làm

tăng thể tích, tạo ra màu sắc và mùi vị tốt cho bánh [2]

Trong sản xuất bia, các nhà sản xuất thường sử dụng α-amylase có trong mầm đại mạch để thủy phân tinh bột có sẵn trong đó Cồn công nghiệp được sản

xuất bằng phương pháp lên men Cồn được lên men từ nguyên liệu chứa đường hoặc từ nguyên liệu chứa carbohydrate Trong đó, α-amylase đóng vai trò chuyển hóa tinh bột để tạo thành dextrin [15].

11 Protease

Protease là nhóm các enzyme có khả năng phân giải các liên kết peptide trong phân tử protein tạo thành các đơn vị nhỏ như các đoạn peptide hay các phân

tử amino axít [5]

Hình 1.3 Phản ứng thủy phân liên kết peptide của chuỗi polypeptide [34].

1.3.3.1 Nguồn sản sinh protease

Protease được sản xuất chủ yếu từ 3 nguồn chính là động vật, thực vật và vi sinh vật Trong đó, nguồn enzyme từ vi sinh vật là phong phú nhất và là nguồn nguyên liệu thích hợp nhất để sản xuất enzyme ở quy mô công nghiệp [16] Ngày nay, hướng sản xuất enzyme từ vi sinh vật đang dần thay thế enzyme từ động vật và thực vật bởi: tốc độ sinh sản của vi sinh vật nhanh, enzyme được tách chiết từ vi sinh vật có hoạt tính cao và vi sinh vật là giới sinh vật phù hợp cho sản xuất theo quy mô công nghiệp Các đối tượng vi sinh vật thường được dùng để tách chiết protease là nấm mốc, vi khuẩn và xạ khuẩn

1.3.3.2 Phân loại protease

Protease được xếp vào nhóm enzyme thủy phân Tuy nhiên, do sự đa dạng

về đặc tính hoạt động và cấu trúc nên protease còn được phân loại theo nhiều cách khác nhau dựa vào pH hoạt động tối ưu hay vị trí hoạt động trong tế bào [51]

• Dựa vào pH hoạt động tối ưu : protease được phân thành protease axít, protease trung tính và protease kiềm tương ứng với pH tối ưu < 7, = 7 và >7

• Dựa vào vị trí phân bố trong tế bào : protease bao gồm protease nội bào và ngoại bào (enzyme được tiết ra bên ngoài tế bào) Trong giới hạn luận văn này chúng tôi tập trung nghiên cứu các protease ngoại bào

• Theo vị trí xúc tác : protease được chia thành hai nhóm: exopeptidase và endopeptidase Exopeptidase là những enzyme có khả năng phân cắt từ hai

đầu tận cùng của chuỗi polypeptide Endopeptidase là những enzyme có khả năng phân cắt liên kết peptid nằm phía trong phân tử protein [44].

1.3.3.3 Ứng dụng của protease

Trong công nghiệp chế biến thủy sản, đồ hộp và đồ đông lạnh, protease được dùng làm mềm thịt nhờ khả năng thủy phân một phần protein có trong thịt Hoàn toàn có thể sử dụng enzyme này trong sản xuất bột đạm thủy phân [3]

Trong công nghệ chế biến sữa, protease tham gia vào quá trình thủy phân protein trong sữa tạo thành các sản phẩm như pepton, axít amin Protease có mặt tự nhiên trong sữa và chúng không bị phân hủy hoàn toàn khi thanh trùng ở nhiệt độ 76-78oC Trương Thị Hòa và cộng sự (1994) đã thử nghiệm sử dụng protease được

tách chiết từ Aspergillus oryzae để thủy phân protein trong hạt ngũ cốc, tạo điều

kiện xử lý bia tốt hơn [7]

Trong công nghiệp thuộc da, trước khi bị xử lý da thường bị cứng do có nhiều collagen Protease được sử dụng làm mềm da nhờ khả năng thủy phân collagen Quá trình đó đã loại bỏ khỏi da các chất nhớt và làm cho da có độ mềm dẻo nhất định

Ngoài ra, protease còn được phối hợp với amylase tạo thành hỗn hợp enzyme được bổ sung vào thức ăn gia súc làm tăng khả năng tiêu hóa cao, có ý nghĩa lớn trong chăn nuôi gia súc và gia cầm

CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

• Máy ly tâm lạnh Centrifuge C30P (Satorius Group, Đức)

• Máy đo quang phổ UV 1600(Thermo, Mỹ)

• Máy lắc ổn nhiệt (B.Braun, Mỹ)

• Kính hiển vi (Olympus, Nhật)

• Máy ly tâm 6K15 (Sigma, Đức)

• Máy ly tâm Centrifuge 5417R (Eppendorf, Đức)

• Bộ chạy điện di đứng cho protein (Biorad, Mỹ)

• Máy lọc tiếp tuyến 17525-001 (Sartorius Stedim, Mỹ)

• Môi trường hoạt hóa : Môi trường NA (g/l): pepton-5; cao thịt-3; thạch-16

• Môi trường nuôi giống khởi động : Môi trường NA dịch thể (như môi trường

NA nhưng không có thạch)

• Môi trường nuôi cấy : Môi trường khoáng (g/l): CaCl2-0,5; NH4NO3-5; KCl-0,5; MgSO4.7H2O-0,25; FeSO4.7H2O-0,01; MnSO4.H2O-0,01; KH2PO4-1 [33] có bổ sung một trong số các nguồn carbon: D-glucose, tinh bột tan, casein, CMC, xylan, chitin, tributyrin và pectin

3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3 Nuôi cấy giống khởi động

Để nuôi cấy khởi động chủng giống, các chủng vi khuẩn được nuôi cấy qua đêm trên môi trường NA dịch thể ở nhiệt độ 37oC trong 24 giờ

4 Phân tích trình tự đa gen

2.3.2.1 Tách chiết DNA của vi khuẩn

Phương pháp tách chiết DNA của vi khuẩn được thực hiện theo Sakiyama và cộng sự (2009) [46] Vi khuẩn đuợc nuôi trên môi trường dịch thể với thời gian thích hợp Sau đó hút 1,5 ml dịch vào ống eppendorf và ly tâm ở 15.000 v/p trong

15 phút để lấy sinh khối tế bào Hòa sinh khối tế bào trong 100 µl TAE Thêm 0,4

mg lysozyme rồi trộn đều, ủ ở 37oC trong 1 giờ

Thêm 100 µl SDS 10% (w/v), trộn đều 2-3 phút, ủ ở 37oC trong 30 phút Thêm một thể tích tương đương phenol : chloroform : isoamyl alcohol, trộn đều Ly tâm 15.000 v/p trong 15 phút Chuyển lớp dịch phía trên sang ống eppendorf khác

Bổ sung 8 µl RNAse 3 mg/ml, trộn đều, ủ ở 37oC trong 30 phút Thêm 12 µl proteinase K (5 mg/ml), trộn đều, ủ ở 56oC trong 15 phút Tiếp tục thêm 1/10 thể tích natri acetate 3M và 1 ml ethanol 100% rồi trộn đều Đặt hỗn hợp trong đá 30 phút

Ly tâm hỗn hợp 15.000 v/p trong 15 phút Hút bỏ lớp dịch trên, rửa phần tủa bằng ethanol 70% Làm khô phần tủa bằng máy cô quay chân không Hoà tan tủa trong 50-100 µl nước MQ hoặc đệm TAE

2.3.2.2 Phản ứng khuếch đại DNA

Thành phần phản ứng khuếch đại DNA bao gồm 10 µl đệm PCR 10x, 10 µl dNTP 2 mM, 2 µl mồi xuôi, 2 µl mồi ngược, 2 µl tag polymerase, 1-2 µl DNA khuôn và bổ sung H2O đến thể tích tổng là 25 µl

Trình tự cặp mồi đã sử dụng (xem phụ lục B).

Chu trình nhiệt của của phản ứng này bao gồm 30 chu kỳ, mỗi chu kỳ gồm 3 bước: (i) gây biến tính DNA bằng cách đun hỗn hợp ở 95oC trong 30 giây, (ii) sau

đó gắn mồi bằng cách hạ nhiệt độ xuống 56oC trong 15 giây, (iii) tiếp theo để DNA polymerase kéo dài chuỗi thì nhiệt độ tiếp tục được nâng lên 72oC trong 1 phút.

2.3.2.3 Tinh sạch sản phẩm PCR

Sử dụng bộ kit QIAgen (Đức) theo chỉ dẫn của nhà sản xuất Các bước được thực hiện như sau: đầu tiên, bổ sung dung dịch PBI vào mẫu theo thể tích 5:1 và trộn đều, chuyển hỗn hợp mẫu vào cột rồi ly tâm 10.000 v/p trong 1 phút sau đó đổ

bỏ lớp dịch phía dưới cột

Bổ sung 750 µl đệm PE lên cột Ly tâm cột 10.000 v/p trong 1 phút sau đó

đổ bỏ dịch dưới cột Cột được ly tâm tiếp 10.000 v/p trong 1 phút Chuyển cột sang ống eppendorf mới sau đó thêm 30 µl nước Hỗn hợp được để ở nhiệt độ phòng trong 5 phút sau đó đem ly tâm 10.000 v/p trong 1 phút Phần dịch phía dưới được thu lại

2.3.2.4 Phản ứng khuếch đại DNA cho đọc trình tự

Thành phần phản ứng PCR gồm 8 µl termix, 1 µl mồi, 1 µl DNA khuôn (nồng độ 40-60 µg/ml) và bổ sung H2O đến thể tích tổng là 25 µl

Phản ứng PCR khuếch đại 6 đoạn gen gyrase subunit A (gyrA), RNA polymerase subunit B (rpoB), phosphoribosylaminoimidazolecarbox-amide formyltransferase (purH), DNA polymerase III subunit alpha (polC), 60 kDa heat- shock protein groEL (groEL) và 16S rRNA được thực hiện với các cặp mồi mô tả

theo Rooney và cộng sự (2009 (xem phụ lục B) [45].

Một chu trình nhiệt ở bước này gồm 25 chu kỳ, mỗi chu kỳ gồm 3 bước: (i) gây biến tính DNA ở 96oC trong 10 giây, (ii) sau đó gắn mồi bằng cách hạ nhiệt độ xuống 50oC, (iii) kéo dài chuỗi bằng cách tăng nhiệt độ lên 60oC trong 4 phút

2.3.2.5 Tinh sạch sản phẩm PCR cho đọc trình tự

Chuyển 20 µl sản phẩm PCR sang ống eppendorf sạch Thêm 5 µl EDTA

125 mM và 60 µl ethanol 100% vào ống, để khoảng 15 phút ở nhiệt độ phòng Sau

đó hỗn hợp được ly tâm tốc độ 15.000 v/p trong 15phút

Loại bỏ dịch, thêm 60 µl ethanol 70% để rửa, ly tâm 15.000 v/p trong 10 phút sau đó làm khô Thêm 10 µl HiDi Formamide rồi đặt trong bể đun sôi ở 96oC

trong 2 phút sau đó ngâm ngay mẫu vào nước đá lạnh trong 5 phút Chuyển toàn bộ mẫu vào giếng trong khay dùng cho đọc trình tự.

Sử dụng kit Bigdye® terminator v3.1 (Applied Biosystems, Mỹ) theo hướng dẫn của nhà sản xuất để giải trình tự DNA Trình tự DNA của các gen được đọc trên máy giải trình tự 3100 Avant Genetic Analyzer sử dụng POP - 6 polymer Sắc

đồ trình tự được kiểm tra và chỉnh sửa trên phần mềm Chromas Lite ver 2.1 Trình

tự mồi xuôi và mồi ngược được kết nối bằng phần mềm Clone Manager ver 8.0

2.3.2.6 Phân tích trình tự và xây dựng cây phát sinh chủng loại

Trình tự của các gen được sắp xếp thẳng hàng theo phương pháp của Kurtman và Robnett (1997) [36], sử dụng phần mềm CLUSTAL W ver 1.83 của Thompson và đồng tác giả (1994) Các trình tự tham khảo dùng trong nghiên cứu cây phát sinh chủng loại được lấy từ dữ liệu của DDBJ (http://www.ddbj.nig.ac.jp), EMBL (http://www.embl.org) và GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank) Cây phát sinh được xây dựng theo Kimura (1980) sử dụng phương pháp của Saitou

và Nei (1987)

5 Đặc điểm sinh học của chủng vi khuẩn nghiên cứu

2.3.3.1 Nhiệt độ sinh trưởng thích hợp

Chủng vi khuẩn được cấy zíc zắc vào các ống nghiệm có chứa môi trường

NA thạch nghiêng, sau đó đặt các ống nghiệm này vào các máy ổn nhiệt ở dải nhiệt

độ từ 15-70oC Quan sát khả năng mọc sau 24 và 48 giờ

2.3.3.3 Thử khả năng đồng hóa các nguồn đường

Khả năng đồng hóa các loại đường khác nhau được thử nghiệm trên thanh thử API 50 CH (Biomerieux, Pháp) theo hướng dẫn của nhà sản xuất Kết quả dương tính được ghi nhận sau 24 và 48 giờ ủ ở 37oC khi vi khuẩn có khả năng sinh trưởng và tạo thành một lớp huyền phù trong ống đường thí nghiệm

2.3.3.4 Thử khả năng lên men các nguồn đường

Khả năng lên men các loại đường khác nhau được thử nghiệm theo hướng dẫn của kit API 50 CHB (Biomerieux, Pháp) Trước khi tiến hành ủ ở 37oC, nhỏ dung dịch khoáng dầu lên các ống để tạo điều kiện kỵ khí cho vi khuẩn lên men Kết quả lên men đường được đọc sau 24 và 48 giờ Phản ứng dương tính khi các ống thử nghiệm chuyển từ màu đỏ sang vàng do vi khuẩn lên men đường và sản sinh axít hữu cơ làm thay đổi pH của môi trường.

2.3.3.5 Xác định khả năng sinh enzyme ngoại bào theo phương pháp thử trên bản thạch cơ chất

Cấy zíc zắc chủng vi khuẩn thuần trên môi trường NA có chứa 0,1% cơ chất tinh bột tan, CMC, xylan, tributyrin, casein và natri phytate Sau 4 ngày nuôi cấy ở nhiệt độ 37oC, hoạt tính của các loại enzyme được thử với các loại thuốc thử tương

ứng (xem phụ lục C).

2.3.3.6 Xác định khả năng sinh enzyme ngoại bào theo kit API ZYM

Theo hướng dẫn của nhà sản xuất (Biomerieux, Pháp), hoạt tính enzyme được xác định dựa trên sự thay đổi màu sau khi ủ ở 37oC trong 4 giờ 30 phút

2.3.3.7 Khả năng sinh kháng sinh theo phương pháp khuếch tán trên thạch

Chủng vi khuẩn được cấy vạch trên môi trường thạch TSA, sau 30 giờ nuôi cấy ở 28oC, thỏi thạch nuôi cấy vi khuẩn được đục bằng ống kim loại và được

chuyển sang môi trường NA đã cấy sẵn các vi khuẩn kiểm định là Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella sp., Shigella sp và môi trường Czapeck đã cấy sẵn nấm kiểm định là Fusarium oxysporum Hoạt tính

kháng sinh được xác định dựa trên sự xuất hiện vòng ức chế xung quanh thỏi thạch

2.3.3.8 Khả năng sinh chất kích thích sinh trưởng indole-3-acetic axít

Khả năng sinh chất kích thích sinh trưởng indole-3-acetic axít (IAA) được xác định theo phương pháp của Gutierrez (2009) [30] 25 ml môi trường NA dịch thể có bổ sung L-tryptophan (Merck, Đức) ở nồng độ 5 mM được dùng để nuôi cấy chủng vi khuẩn ở 37oC và 160 v/p Cứ sau 24 giờ hút ra 1,5 ml dịch nuôi cấy vi khuẩn đem ly tâm ở 8.000 v/p trong10 phút để loại bỏ tế bào 1 ml dịch sau ly tâm được trộn đều với 1 ml dung dịch Salkowski R1 sau đó đem ủ hỗn hợp dịch trong tối 30 phút Hoạt tính IAA được xác định bằng cách đo OD dịch hỗn hợp ở bước sóng 535 nm

Ngoài ra, khả năng kích thích sinh trưởng của chủng SP 1901 được thử nghiệm trong quá trình sinh trưởng của cây ngô Ngô giống được ươm mầm đồng loạt sau 3-4 ngày rồi chọn những cây giống có chiều cao bằng nhau Bổ sung 0,2; 0,4; 0,8 và 1 ml môi trường nuôi cấy chủng SP 1901 có chứa L-tryptophan vào phần gốc của cây giống Quan sát quá trình sinh trưởng của cây ngô và so sánh chiều cao với đối chứng.

2.3.3.9 Khả năng sống sót trong môi trường dịch dạ dày nhân tạo

Hút 6 ml dịch nuôi cấy giống khởi động chủng vi khuẩn nghiên cứu vào ống

15 ml, tiến hành ly tâm ở 4.000 v/p trong 10 phút, loại bỏ dịch Hoàn trở lại với 3

ml NaCl 0,9% rồi trộn đều sau đó hút mỗi 0,5 ml vào trong 2 bình tam giác có chứa

25 ml môi trường dịch dạ dày nhân tạo gồm: NaCl (125 mmol/l), KCl (7 mmol/l), NaHCO3 (45 mmol/l) và pepsin (3 g/l) Dịch dạ dày nhân tạo đã được điều chỉnh về

pH 2 và 3 bằng HCl 1 M Hỗn hợp được ủ trong 3 giờ ở 37oC Dịch sau khi ủ được pha loãng ở nồng độ 10-2 và được cấy đều lên đĩa thạch NA Sau 24 giờ nuôi cấy vi sinh vật ở 37oC, đếm số khuẩn lạc mọc trên bề mặt thạch và so sánh với đối chứng [32]

2.3.3.10 Khả năng chịu muối mật

Hút mỗi 100 µl dịch nuôi cấy giống khởi động chủng vi khuẩn nghiên cứu vào các bình tam giác, mỗi bình chứa 25 ml môi trường NA dịch thể có bổ sung ox-bile (Sigma, Đức) với nồng độ lần lượt là 0,1%; 0,3%; 0,5% và 0,7% Sau 24 giờ nuôi cấy ở 37oC tiến hành đo OD dịch nuôi cấy ở bước sóng 600 nm để so sánh khả năng chịu muối mật ở các nồng độ khác nhau

2.3.3.11 Khả năng chịu muối

Hút ra mỗi 100 µl vào các bình tam giác có chứa 25 ml môi trường NA dịch thể có bổ sung NaCl (Merck, Đức) với nồng độ lần lượt là 1%, 3%, 5%, 7% và 9% Sau 24 giờ nuôi cấy ở 37oC tiến hành đo OD dịch nuôi cấy ở bước sóng 600 nm để

so sánh khả năng chịu muối ở các nồng độ khác nhau

6 Lựa chọn môi trường và thời gian nuôi cấy thích hợp cho khả năng sinh

enzyme ngoại bào cao

Chủng vi khuẩn nghiên cứu được cấy trên đĩa Petri có chứa môi trường NA

Dùng que bông đã khử trùng gạt lấy phần sinh khối tế bào và hòa vào dung dịch nước muối sinh lý Sau đó điều chỉnh để OD ở bước sóng 600 nm của tế bào về 1 (≈

1 × 109 CFU/ml) Hút ra 0,5 ml dịch tế bào này vào 10 bình tam giác 250 ml chứa

100 ml các loại môi trường khác nhau (xem phụ lục C) rồi tiến hành nuôi cấy lắc

160 v/p ở 37oC Cứ sau 10, 24, 34, 48, 58, 72, 82, 96 giờ hút ở mỗi bình ra 5 ml dịch nuôi cấy và tiến hành đo OD ở bước sóng 600 nm để xác định mật độ tế bào đồng thời xác định hoạt độ một số enzyme ngoại bào bằng phương pháp định tính

và định lượng Dựa vào kết quả thu được, lựa chọn môi trường và thời gian nuôi cấy thích hợp cho khả năng sinh enzyme ngoại bào cao

7 Phương pháp xác định protein

Chuẩn bị dải pha loãng dung dịch Bovine serum albumin (BSA – Sigma, Đức) ở các nồng độ 50; 100; 200; 300; 400 và 500 (µg/ml) Hút 1 ml dịch có chứa BSA ở các nồng độ trên tiến hành phản ứng Lowry (xem mục 2.2.6.3.)

Từ kết quả trên, ta dựng được đồ thị đường chuẩn độ hấp phụ theo nồng độ BSA và xây dựng công thức:

y = 0,001x – 0,014Trong đó y là độ hấp phụ (OD750), x là nồng độ BSA (µg/ml)

8 Phương pháp xác định hoạt độ enzyme ngoại bào

2.3.6.1 Phương pháp xác định hoạt độ xylanase

Hoạt độ của xylanase được xác định theo phương pháp DNS của Miller (1959) và Bailey (1992) [20] [40]

• Hóa chất : Thuốc thử DNS (xem phụ lục A), cơ chất xylan 1% pha trong

Hình 2.1 Đồ thị đường chuẩn theo

thang BSA (µg/ml)

đệm Tris-HCl 0,05 M pH 7.

• Cách tiến hành : Hỗn hợp phản ứng gồm 50 µl enzyme + 150 µl xylan 1% được ủ ở 50oC trong 10 phút Sau 10 phút, bổ sung 600 µl DNS để dừng phản ứng Hỗn hợp được ngâm 5 phút trong bể đun sôi, sau đó vớt ra ngâm 5 phút trong nước

đá Mẫu blank được bổ sung DNS ngay từ đầu để bất hoạt enzyme, sau đó thêm cơ chất xylan 1% và tiến hành như trên Bổ sung 4,2 ml nước cất, đo OD ở bước sóng

500 nm

• Dựng đường chuẩn : Sấy khô đường xylose (Merck, Đức) trong 5 giờ ở 80oC Làm dải pha loãng dung dịch xylose trong H2O ở các nồng độ 0,2; 0,4; 0,6; 0,8; 1,0; 1,2; 1,4; 1,6; 1,8 và 2,0 (mg/ml) Hòa 200 μl mỗi dung dịch đường ở dãy pha loãng trên với 600 μl dung dịch DNS, ngâm 5 phút trong bể đun sôi, sau đó vớt

ra ngâm 5 phút trong nước đá để làm bền màu Bổ sung 4,2 ml nước cất, đo độ hấp phụ ở bước sóng 500 nm (blank bằng mẫu có chứa xylose 0 mg/l) Với mỗi nồng độ lặp lại 2 lần và lấy giá trị trung bình

Từ kết quả trên, ta dựng được đồ thị đường chuẩn độ hấp phụ theo nồng độ đường xylose và xây dựng công thức:

y = 1,161x – 0,114Trong đó y là độ hấp phụ (OD500), x là nồng độ xylose (mg/ml)

• Xác định hoạt độ của xylanase : Một

đơn vị hoạt độ của xylanase là lượng enzyme cần thiết để giải phóng 1 μmol/phút đường xylose dưới điều kiện của thí nghiệm Hoạt độ của enzyme được xác định theo công thức:

Hình 2.2 Đồ thị đường chuẩn theo

thang xylose (mg/ml)

x × 1.000 × 20Hoạt độ U = ———————

150 × 10

Trong đó: x là lượng đường khử tính theo đường chuẩn, x × 1.000 là lượng đường khử theo đường chuẩn đổi ra µg, 20 là hoạt độ xylanase tính theo 1 ml dịch thử, 150 là khối lượng phân tử của xylose và 10 là thời gian (phút) ủ của phản ứng

2.3.6.2 Phương pháp xác định hoạt độ amylase

Hoạt độ của amylase được xác định theo phương pháp trong nghiên cứu của Mishra và Behara (2008) [41]

• Hóa chất : Thuốc thử DNS (xem phụ lục A), dung dịch tinh bột tan 1% pha

trong Tris-HCl 0,1 M pH 7

• Cách tiến hành : Hồ hóa dịch tinh bột tan bằng cách ủ ở 100oC trong 30 phút Hỗn hợp phản ứng gồm 100 µl enzyme + 100 µl cơ chất tinh bột tan 1% được ủ ở 50oC trong 30 phút Dừng phản ứng bằng cách bổ sung 600 µl DNS sau đó đưa vào

bể đun sôi trong 10 phút rồi làm lạnh nhanh Mẫu blank được thêm 600 µl DNS ngay từ đầu để bất hoạt enzyme Hút 4,2 ml nước cất vào hỗn hợp phản ứng, đo OD

ở bước sóng 575

• Dựng đường chuẩn glucose : Sấy khô đường glucose (Merck, Đức) ở 105oC trong 2 giờ Làm dải pha loãng dung dịch glucose trong nước ở các nồng độ 0,2; 0,4; 0,6; 0,8; 1,0; 1,2; 1,4; 1,6; 1,8 và 2,0 (mg/ml) Hòa 200 μl mỗi dung dịch đường

ở dãy pha loãng trên với 600 μl dung dịch DNS, đun sôi trong 10 phút sau đó làm lạnh nhanh bằng nước đá Bổ sung 4,2 ml nước cất, đo độ hấp phụ ở bước sóng 575

nm (blank bằng mẫu có chứa glucose 0 mg/l) Với mỗi nồng độ lặp lại 2 lần và lấy giá trị trung bình

Từ kết quả trên, ta dựng được đồ thị đường chuẩn độ hấp phụ theo nồng độ đường glucose và xây dựng công thức:

y = 0,476x – 0,019Trong đó y là độ hấp phụ (OD575); x là nồng độ glucose (mg/ml)

• Xác định hoạt độ amylase : Một đơn vị hoạt độ của amylase là lượng enzyme cần thiết để giải phóng 1 μmol/phút đường glucose dưới điều kiện của thí nghiệm Hoạt độ của enzyme được xác định theo công thức:

x × 1000 × 10Hoạt độ U = ———————

180 × 30

Trong đó: x là lượng đường khử tính theo đường chuẩ,; x × 1.000 là lượng đường khử theo đường chuẩn đổi ra µg, 10 là hoạt độ xylanase tính theo 1 ml dịch thử, 180 là khối lượng phân tử của xylose và 30 là thời gian (phút) phản ứng

2.3.6.3 Phương pháp xác định hoạt độ protease

Hoạt độ của protease được xác định theo phương pháp trong nghiên cứu của Lazim (2009) [37]

• Hóa chất : Casein 2%, Tris-HCl 0,1 M pH 7, TCA 2%, Copper sulfate

reagent, WS1, và WS2 (xem phụ lục A).

• Cách tiến hành : Nhỏ 25 µl enzyme cần định lượng vào ống nghiệm thủy tinh Thêm tiếp 250 µl casein 2% và 475 µl Tris-HCl 0,1 M pH 7 Hỗn hợp phản ứng được ủ ở 55oC trong 15 phút Sau đó bổ sung 500 µl TCA 2% để dừng phản ứng Mẫu blank được thêm 500 µl TCA 2% ngay từ trước khi ủ để bất hoạt enzyme

Lắc đều, ly tâm hỗn hợp phản ứng ở 10.000 v/p trong 10 phút, nhiệt độ thường Hút 1 ml dịch trong sau ly tâm thực hiện phản ứng Lowry [44] Theo đó, 1

ml dịch trong sau ly tâm phản ứng với 1ml WS1, lắc đều, ủ ở nhiệt độ phòng trong

10 phút Sau đó bổ sung 500 µl WS2 vào hỗn hợp phản ứng trên, lắc đều Sau 30

Hình 2.3 Đồ thị đường chuẩn theo thang glucose (mg/ml)

phút tiến hành đo OD ở bước sóng 750 nm.

• Dựng đường chuẩn L-tyrosine : Làm dải pha loãng dung dịch L-tyrosine (Merck, Đức) trong HCl 0,1 M ở các nồng độ 10, 20, 40, 60, 80 và 100 (µg/ml) Hút 1 ml dịch có chứa L-tyrosine ở các nồng độ trên thực hiện phản ứng Lowry

Từ kết quả trên, ta dựng được đồ thị đường chuẩn độ hấp phụ theo nồng độ L-tyrosine và xây dựng công thức:

y = 0,017x + 0,004Trong đó y là độ hấp phụ (OD750); x là nồng độ L-tyrosine (µg/ml)

• Xác định hoạt độ của protease : Một đơn vị hoạt độ của protease là lượng enzyme cần thiết để giải phóng 1 μg/phút L-tyrosine dưới điều kiện của thí nghiệm Hoạt độ của enzyme được xác định theo công thức:

x × 40Hoạt độ U = ————

15Trong đó: x là lượng L-tyrosine tính theo đường chuẩn, 40 là hoạt độ protease tính theo 1 ml dịch thử và 15 là thời gian (phút) phản ứng

9 Tách chiết và tinh sạch enzyme ngoại bào

2.3.7.1 Cô đặc dịch nuôi cấy bằng hệ thống lọc tiếp tuyến

Chủng vi khuẩn nghiên cứu được nuôi cấy trên 1 lít môi trường với nhiệt độ,

pH và thời gian thích hợp, sau đó ly tâm dịch ở 6.000 v/p trong 15 phút để loại bỏ tế bào Dịch sau ly tâm được cô đặc bằng hệ thống lọc tiếp tuyến với màng lọc 300

Hình 2.4 Đồ thị đường chuẩn theo

thang L-tyrosine (µg/ml)

kDa và 10 kDa để loại bỏ những hợp chất có khối lượng phân tử nằm ngoài 2 khoảng trên.

2.3.7.2 Tủa enzyme bằng muối ammonium sulfate

Đầu tiên, dịch có chứa enzyme bị tủa ammonium sulfate ((NH4)2SO4) ở nồng độ bão hòa 30%, sau đó hỗn hợp được ngâm trong đá 30 phút, ly tâm ở 9.500 v/p trong 15 phút ở 4oC

Hút phần dịch trong sang ống nghiệm khác, tiếp tục bổ sung từ từ

(NH4)2SO4 đến khi đạt nồng độ 80% (xem phụ lục C) Hỗn hợp được ủ và ly tâm

như trên Loại bỏ dịch, phần tủa được hòa tan bằng 1 ml đệm dùng chạy sắc ký trao đổi ion

2.3.7.3 Sắc ký trao đổi ion

Cột được cân bằng với đệm (xem phụ lục A) và điều chỉnh tốc độ dòng là 3

ml/phút trước khi đưa mẫu lên Dùng pipet đưa mẫu lên cột 20 phân đoạn đầu (thể tích mỗi phân đoạn là 5 ml) rửa cột bằng đệm 20 phân đoạn sau thôi cột bằng gradient NaCl (từ 0 đến 1 M) nhằm đẩy những enzyme bám cột trôi ra ngoài Tiến hành định tính và định lượng các enzyme ngoại bào của 40 phân đoạn Phân đoạn nào có hoạt độ enzyme cao được bảo quản để dùng trong các thí nghiệm tiếp theo

2.3.7.4 Sắc ký lọc gel

Phần dịch thu được sau khi chạy sắc ký trao đổi ion tiếp tục được tủa bằng muối ammonium sulfate Hòa tan tủa trong 1 ml đệm phosphate 50 mM pH 7 có bổ sung NaCl nồng độ 0,15 M dùng để chạy sắc ký lọc gel với cột Hiload 16/60, thể tích cột là 120 ml Điều chỉnh tốc độ dòng chảy của cột sắc ký lọc gel là 1 ml/phút, dùng pipet đưa dịch chứa enzyme lên cột, thu 40 phân đoạn (thể tích mỗi phân đoạn

là 3 ml) Tiến hành định tính và định lượng nhanh các enzyme ngoài bào ở 40 phân đoạn Cuối cùng, để xác định trọng lượng phân tử cũng như đánh giá mức độ tinh sạch của enzyme, chúng tôi tiến hành chạy điện di protein trên gel polyacrylamide SDS-PAGE

Sau khi đổ lớp resolving gel ta bổ sung ngay một lớp nước lên trên và chờ 30 phút để gel đông Sau đó loại bỏ lớp nước và đổ tiếp lớp stacking gel lên trên, gắn lược và chờ tiếp 30 phút nữa Đặt bản gel vào buồng điện di và nạp mẫu

Mẫu enzyme được trộn đều với SDS reducing buffer (xem phụ lục A) với tỷ

lệ thể tích là 1:4 Xử lý mẫu ở 94oC trong 4 phút sau đó tra mẫu vào giếng và để ổn định trong 5 phút trước khi chạy Chạy điện di với hiệu điện thế là 110 V trong 1 giờ 45 phút

Sau khi chạy điện di xong, tiến hành nhuộm bản gel SDS-PAGE như sau: nhuộm gel trong bể nhuộm với 100 ml dung dịch Coomassie Brilliant Blue R-250

trong 30 phút Sau đó, bản gel được ngâm 1 giờ trong dung dịch Destain (xem phụ lục A) rồi được rửa bằng nước Quan sát các băng, so sánh với thang chuẩn

(marker) và chụp ảnh

10 Xác định đặc tính enzyme ngoại bào

Dịch enzyme ngoại bào thu được sau khi chạy sắc ký lọc gel được sử dụng cho các thí nghiệm nghiên cứu đặc tính enzyme

2.3.8.1 Nhiệt độ thích hợp cho hoạt động của enzyme

Hỗn hợp phản ứng gồm enzyme và cơ chất dùng trong các phương pháp định lượng được ủ ở các nhiệt độ khác nhau từ 30-70oC rồi giữ lạnh Sau khi ủ xong đồng thời bất hoạt enzyme Tiến hành xác định hoạt độ và so sánh

2.3.8.2 Khả năng bền nhiệt của enzyme

Dịch enzyme được xử lý tại các nhiệt độ 60, 70 và 80 oC trong khoảng thời gian 10, 20 và 30 phút Sau đó thực hiện các phản ứng định lượng để xác định hoạt độ

2.3.8.3 pH thích hợp cho hoạt động của enzyme

Cơ chất được hòa tan bằng các loại đệm có giá trị pH khác nhau từ 3-9 (xem

phụ lục C) sau đó dùng cơ chất này để thực hiện các phản ứng định lượng enzyme.

2.3.8.4 Thử khả năng bền axít

Enzyme bị xử lý với citrate phosphate pH 3 trong 20, 40, 60, 80, 100 và 120 phút, sau đó bổ sung sodium phosphate 0,2 M để đưa về pH 7 rồi bổ sung cơ chất

và tiến hành phản ứng định lượng

2.3.8.5 Ảnh hưởng của các ion kim loại và hóa chất đến hoạt độ của enzyme

Hỗn hợp phản ứng định lượng được bổ sung các ion kim loại (bảng 4.9 phần phụ lục) sao cho đạt nồng độ 2, 5 và 10 mM Sau đó tiến hành các phản ứng

định lượng enzyme

2.3.8.6 Sắc ký lớp mỏng

225 µl cơ chất xylan 1% (pha trong Tris-HCl 0,05 M pH 7) được ủ với 225

µl xylanase ở 50oC trong các khoảng thời gian khác nhau Sản phẩm thủy phân sau

đó được chấm lên bản chạy sắc ký lớp mỏng 20 × 20 cm TLC Cellulose Plastic

(Merck, Đức) và chạy trên dung môi (xem phụ lục A) Sau đó tiến hành nhuộm bản sắc ký bằng dung dịch hỗn hợp phthalic axít và aniline (xem phụ lục A) 12 µl hỗn

hợp gồm D-xylose (X1), xylobiose (X2), xylotriose (X3) và xylotetraose (X4) (nồng độ từng loại trong hỗn hợp là 1 mg/ml) được chấm lên bản chạy sắc ký dùng làm chất chuẩn

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

1 LỰA CHỌN CHỦNG VI KHUẨN NGHIÊN CỨU

1 Tuyển chọn chủng

Dựa vào màu sắc, kích thước và hình thái bề mặt khuẩn lạc, 63 chủng vi khuẩn đã được lựa chọn và phân loại dựa trên phương pháp phân tích trình tự gen 16S rRNA (Trung và cs, 2011) Dựa trên cơ sở dữ liệu Eztaxon-e cập nhật đến ngày

16/05/2012, 41 chủng trong số này được phân loại vào chi Bacillus.

2 Cây phân loại dựa trên trình tự 16S rDNA

Để lựa chọn các chủng thuộc nhóm B subtilis, chúng tôi tiến hành xây dựng

cây phát sinh chủng loại dựa vào trình tự gen 16S rRNA cùng với 9 loài trong nhóm

B subtilis (Vos et al., 2009) Kết quả cho thấy, duy nhất chủng SP 1901 có quan hệ

gần gũi với các loài trong nhóm B subtilis (hình 3.1.)

Hình 3.1 Cây phát sinh chủng loại của 37 chủng vi khuẩn Bacillus phân lập tại

rừng Quốc gia Hoàng Liên và 9 loài thuộc nhóm vi khuẩn B subtilis dựa trên phân

tích trình tự 16S rDNA Vòng tròn chỉ vị trí phân loại của chủng SP 1901

3 Cây phân loại dựa trên trình tự đa gen

Phân loại các loài trong nhóm B subtilis nói chung và B amyloliquefaciens

nói riêng đòi hỏi phải có sự tổ hợp của nhiều phương pháp phân loại hiện đại Dựa vào kỹ thuật phân tích trình tự đa gen Multilocus Sequence Analysis (MLSA), Rooney và cộng sự (2009) đã phát hiện một nhóm loài nằm tách biệt với các loài

trong nhóm B subtilis subsp subtilis và B subtilis subsp spizizenii trên cây phân loại xây dựng từ 6 trình tự gen gyrA, rpoB, purH, polC, groEL và 16S rRNA [45]

Trên cơ sở phân tích dữ liệu khối phổ MALDI - TOF và thành phần axit béo

(FAME), ông đã đề xuất một nhóm loài mới đó là loài phụ B subtilis subsp inaquosorum Mặc dù nghiên cứu của Borriss và cộng sự (2010) không đề xuất kỹ

thuật phân tích trình tự đa gen nhưng trên cây phân loại 6 gen của Rooney và cộng

sự đã chỉ rõ sự tách biệt giữa 2 nhóm B amyloliquefaciens DSM 7 và B amyloliquefaciens FZB42 Vì vậy, khi phân tích cây phát sinh chủng loại trên nhóm

vi khuẩn B subtilis phân lập từ thực phẩm lên men tại Nhật Bản, Kobo và cộng sự

(2011) đã ứng dụng phân tích trình tự 6 gen và đã phân tách rõ ràng các chủng dưới

loài B amyloliquefaciens.

Tra cứu trình tự tương đồng đoạn 16S rDNA của chủng SP 1901 trên cơ sở

dữ liệu ngân hàng gen NCBI không đưa ra kết quả phân loại chính xác đến loài

nhưng trên cơ sở dữ liệu EzTaxon đã phân loại chủng SP 1901 đến loài B amyloliquefaciens subsp plantarum Để xác minh kết quả trên, chúng tôi tiến hành phân tích trình tự 5 gen khác là gyrA, rpoB, purH, polC và groEL kết hợp với trình

tự gen 16S rRNA để tiến hành xây dựng cây phân loại cho chủng SP 1901 cùng với

các loài trong nhóm B subtilis đã công bố [45] [23] Kết quả phân tích cho thấy chủng SP 1901 được xếp vào nhóm loài B amyloliquefaciens subsp plantarum và phân tách hoàn toàn với nhóm loài B amyloliquefaciens subsp amyloliquefaciens

cũng như những loài trong nhóm B subtilis (hình 3.2.)

Với kết quả thu được chúng tôi kết luận chủng SP 1901 là loài B amyloliquefaciens subsp plantarum.

Hình 3.2 Cây phát sinh chủng loại của các loài vi khuẩn thuộc nhóm B subtilis

Cây được xây dựng dựa trên đoạn 5.547 bp kết nối từ 6 gen gyrA, rpoB, purH, polC, groEL và 16S rRNA.

Trình tự 6 gen này đã được đăng tải trên ngân hàng gen NCBI với mã hiệu trình tự lần lượt là JX403999, JX404000, JX404001, JX404002, JX404003 và JX404004

2 ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA CHỦNG SP 1901

4 Đặc điểm hình thái

Chủng B amyloliquefaciens subsp plantarum SP 1901 là vi khuẩn hiếu khí,

hình que, kích thước tế bào (3,2-3,9) × (0,9-1,0) µm, đứng riêng rẽ hoặc xếp đôi Chủng SP 1901 có khả năng sinh nội bào tử hình trụ, thường nằm lệch về một phía

tế bào nhưng không làm biến dạng hình que đặc trưng của chúng Trên môi trường nuôi cấy NA, khuẩn lạc dạng tròn, có màu trắng sữa Bề mặt khuẩn lạc khô, lồi và sần sùi, mép khuẩn lạc có dạng hình răng cưa Khuẩn lạc bám chắc vào thạch sau 2 ngày nuôi cấy