Mục tiêu chính của luận văn: Tuyển chọn các chủng vi khuẩn thuộc nhóm B. subtilis phân lập tại rừng Quốc gia Hoàng Liên; sử dụng kỹ thuật phân tích trình tự đa gen để phân loại chính xác các chủng vi khuẩn nghiên cứu đến cấp độ loài và dưới loài.
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Phan Lạc Dũng NGHIÊN CỨU CÁC ĐẶC TÍNH SINH HỌC VÀ TIỀM NĂNG ỨNG DỤNG CỦA CHỦNG VI KHUẨN BACILLUS AMYLOLIQUEFACIENS SUBSP. PLANTARUM SP 1901 PHÂN LẬP TẠI RỪNG QUỐC GIA HỒNG LIÊN LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội Năm 2013 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Phan Lạc Dũng NGHIÊN CỨU CÁC ĐẶC TÍNH SINH HỌC VÀ TIỀM NĂNG ỨNG DỤNG CỦA CHỦNG VI KHUẨN BACILLUS AMYLOLIQUEFACIENS SUBSP. PLANTARUM SP 1901 PHÂN LẬP TẠI RỪNG QUỐC GIA HỒNG LIÊN Chun ngành: Vi sinh vật học Mã số: 60 42 40 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC TS. TRỊNH THÀNH TRUNG Hà Nội Năm 2013 LỜI CẢM ƠN Trước tiên, tơi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Trịnh Thành Trung, người đã dẫn dắt, chỉ bảo và tạo mọi điều kiện giúp đỡ tơi hồn thành luận văn cao học này Tơi xin chân thành cảm ơn các cán bộ, anh chị đang làm việc tại Viện Vi sinh vật và Cơng nghệ Sinh học Đại học Quốc gia Hà Nội đã giúp đỡ tơi trong q trình hồn thành luận văn Tơi xin chân thành cảm ơn các thầy cơ giáo trong Bộ mơn Vi sinh vật học nói riêng và Khoa Sinh học nói chung đã dạy dỗ tơi trong q trình học tập Cuối cùng, tơi xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè đã ln động viên, giúp đỡ, hỗ trợ để tơi có thể hồn thành luận văn này Hà Nội, tháng 5 năm 2013 Học viên Phan Lạc Dũng MỤC LỤC DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1. Khả năng sinh trưởng của chủng SP 1901 ở các nhiệt độ khác 33 Bảng 3.2. Khả năng đồng hoá các loại đường………………………………… 34 Bảng 3.3. Khả năng lên men các loại đường………………………………… 35 Bảng 3.4. Khả năng sinh enzyme ngoại bào theo phương pháp sử dụng kit API ZYM………………………………….…………………………………… 37 Bảng 3.5. Tỷ lệ giữa hoạt độ xylanase (U/ml) và nồng độ protein (mg/ml) của chủng SP 1901………………………………… ……………………………… 40 Bảng 3.6. Hoạt độ của xylanase sau các bước tinh sạch……………………… 46 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Cấu trúc hóa học của xylan và các vị trí tấn cơng của hệ thống enzyme xylanolytic………………………………….………………………… Hình 1.2. Cấu trúc hóa học của amylose và amylopectin…………………… 11 Hình 1.3. Phản ứng thủy phân liên kết peptide chuỗi polypeptide……… Hình 2.1. 13 Đồ thị đường chuẩn theo thang BSA……………………………… 21 Hình 2.2. Đồ thị đường chuẩn theo thang xylose…………………………… 22 Hình 2.3. Đồ thị đường chuẩn theo thang glucose…………………………… 23 Hình 2.4. 24 Đồ thị đường chuẩn theo thang L tyrosine………………………… Hình 3.1. Cây phát sinh chủng loại của 37 chủng vi khuẩn Bacillus phân lập tại rừng Quốc gia Hồng Liên và 9 lồi thuộc nhóm vi khuẩn B. subtilis dựa phân tích trình tự 16S rDNA………………………………… ………… 28 Hình 3.2. Cây phát sinh chủng loại của các lồi vi khuẩn thuộc nhóm B. subtilis………………………………….…………………………………… 30 Hình 3.3. Hình thái khuẩn lạc chủng SP 1901 (a), hình thái tế bào khi nhuộm gram (b) soi (c) ………………………………… …………………… 31 Hình 3.4 pH sinh trưởng tối ưu (a). Khả năng chịu muối NaCl (b). Khả chịu dịch dày (c) Khả chịu muối mật (d) …………………………… 31 Hình 3.5 Khả năng sinh chất kích thích sinh trưởng IAA của chủng SP 1901 sau 24, 48 72 giờ………………………………… ……………………… 32 Hình 3.6. Khả năng sinh IAA làm cho dung dịch chuyển từ màu vàng sang đỏ (a). Ảnh hưởng của chủng SP 1901 lên khả năng sinh trưởng của cây ngô sau 10 ngày trồng (b) ………………………………… ………………………… 32 Hình 3.7. Vòng phân giải cơ chất của các enzyme ngoại bào. Amylase (a). Cellulase (b). Phytase (c). Protease (d). Xylanase (e) ……………………… 36 Hình 3.8. Phản ứng thử nghiệm khả năng sinh enzyme trên thanh thử API ZYM………………………………….……………………………………… 37 Hình 3.9. Khả năng sinh kháng sinh của chủng SP 1901 theo phương pháp khuếch tán trên thạch. Đĩa thạch cấy sẵn vi khuẩn E. coli (a). Vi khuẩn Shigella sp. (b). Vi khuẩn S. aureus (c) ……………………………………… 38 Hình 3.10 Khả năng sinh trưởng trên các mơi trường khác nhau (a, b) và hoạt độ xylanase ngoại bào (c, d) của chủng SP 1901 khi ni cấy trên 10 loại mơi trường khác nhau………………………………… ……………… 39 Hình 3.11 Hoạt độ xylanase (U/ml) và nồng độ protein (mg/ml) khi ni 39 cấy trên mơi trường có bổ sung CMC và glucose và mơi trường NA dịch thể khác nhau………………………………… ………………………… Hình 3.12 Hoạt tính amylase protease chủng SP 1901 mơi trường có bổ sung CMC glucose môi trường NA dịch thể…………………… 40 Hình 3.13. Hoạt độ xylanase và nồng độ protein ở các phân đoạn trong sắc ký trao đổi ion gel CM Sepharose………………………………… …………… 41 Hình 3.14. Hoạt độ amylase và nồng độ protein ở các phân đoạn trong sắc ký trao đổi ion gel DEAE Sepharose………………………………… ………… 42 Hình 3.15. Hoạt độ protease và nồng độ protein ở các phân đoạn trong sắc ký trao đổi ion gel CM Sepharose………………………………… …………… 42 Hình 3.16. Hoạt độ xylanase ở các phân đoạn trong sắc ký lọc gel………… 43 Hình 3.17. Hoạt độ amylase ở các phân đoạn trong sắc ký lọc gel………… 44 Hình 3.18. Hoạt độ protease ở các phân đoạn trong sắc ký lọc gel………… 44 Hình 3.19. Điện di SDSPAGE 2 mẫu xyl 29 và xyl 36…………………… 45 Hình 3.20. Nhiệt độ hoạt động tối ưu xyl 29, xyl 36, amylase và protease từ chủng SP 1901…………………………………………………………… 46 Hình 3.21. Khả năng bền nhiệt của xyl 29, xyl 36, amylase và protease từ chủng SP 1901……………………………………………………………… 47 Hình 3.22. pH hoạt động tối ưu của xyl 29, xyl 36, amylase và protease từ chủng SP 1901……………………………………………………………… 48 Hình 3.23. Khả năng bền axít của xyl 29, xyl 36, amylase và protease từ chủng SP 1901……………………………………………………………… 49 Hình 3.24. Khả năng bền ion kim loại và hóa chất của xyl 29, xyl 36, amylase protease từ 1901………………………………………………… chủng SP 50 Hình 3.25. Bản chạy sắc ký lớp mỏng để phân tích sản phẩm thủy phân từ chất xylan xylanase 1901…………………………………… CÁC KÝ HIỆU VIẾT TẮT BSA Bovine serum albumin CMC Carboxymethyl cellulose DNA Deoxyribonucleic axít DNS Dinitrosalicylic IAA Indole3acetic axít PAGE Polyacrylamide gel electrophoresis PCR Polymerase chain reaction RNA Ribonucleic axít SDS Sodium dodecyl sulfate chủng SP 52 ĐẶT VẤN ĐỀ Ngày nay, việc ứng dụng vi sinh vật vào trong đời sống và sản xuất đã trở nên rất phổ biến. Con người đã và đang khai thác triệt để nguồn tài ngun vi sinh vật trong nhiều lĩnh vực khác nhau. Trong y học, nhờ có vi sinh vật mà con người đã tổng hợp thành cơng nhiều loại chế phẩm như vacxin, kháng sinh, hormone, vitamin giúp phòng ngừa và điều trị nhiều loại bệnh cho con người Trong nơng nghiệp, nhiều chế phẩm sinh học có nguồn gốc từ vi sinh vật đã được sản xuất để diệt trừ sâu bệnh hại cây và làm phân bón vi sinh. Trong cơng nghiệp thực phẩm, con người đã ứng dụng vi sinh vật để sản xuất ra các loại protein, enzyme, chế phẩm probiotic và các loại thực phẩm lên men truyền thống. Ngồi ra, vi sinh vật còn được ứng dụng vào trong xử lý rác thải hữu cơ và nước thải trong sản xuất cơng nghiệp. Với khả năng chuyển hóa mạnh mẽ và sinh sản nhanh chóng, vi sinh vật đóng một vai trò to lớn trong hệ sinh thái tự nhiên và trong các hoạt động cải thiện chất lượng cuộc sống của con người Bacillus là một trong những vi sinh vật đầu tiên được phát hiện và mơ tả trong giai đoạn đầu của tiến trình phát triển ngành vi sinh vật học ở cuối thế kỷ 19. Đây là một chi lớn với gần 200 lồi vi khuẩn hiếu khí, hình que và có khả năng sinh nội bào tử. Chúng phân bố rộng rãi trong các hệ sinh thái tự nhiên, từ trên cạn đến dưới nước, từ nước ngọt đến nước mặn và từ ven bờ đến đáy các Đại Dương. Ngồi các lồi vi khuẩn gây bệnh cho con người như B. anthracis và B. cereus, nhiều lồi vi khuẩn thuộc chi Bacillus đặc biệt là nhóm B. subtilis có tính ứng dụng cao trong nhiều lĩnh vực như y dược học, nơng nghiệp, cơng nghiệp thực phẩm và xử lý mơi trường. Do đó, các lồi thuộc chi Bacillus đã và đang ngày càng trở thành những vi sinh vật quan trọng hàng đầu về mặt ứng dụng. Nhằm góp phần tìm hiểu thêm kiến thức về chi Bacillus nói chung và ứng dụng của các lồi thuộc nhóm B. subtilis nói riêng, chúng tơi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu các đặc tính sinh học và tiềm năng ứng dụng của chủng vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens subsp plantarum SP 1901 phân lập tại rừng Quốc gia Hồng Liên” với 4 mục tiêu chính sau: (i) Tuyển chọn các chủng vi khuẩn thuộc nhóm B. subtilis phân lập tại rừng Quốc gia Hồng Liên (ii) Sử dụng kỹ thuật phân tích trình tự đa gen để phân loại chính xác các chủng vi khuẩn nghiên cứu đến cấp độ lồi và dưới lồi (iii) Tìm hiểu các đặc tính sinh học q của chủng vi khuẩn được lựa chọn (iv) Tách chiết, tinh sạch và đánh giá sơ bộ đặc tính các enzyme ngoại của chủng vi khuẩn nghiên cứu 10 KẾT LUẬN Từ bộ giống vi khuẩn phân lập tại rừng Quốc gia Hồng Liên, duy nhất chủng SP 1901 thuộc nhóm B. subtilis Chủng này là B. amyloliquefaciens subsp. plantarum. Chủng SP 1901 sinh trưởng tốt nhất pH 7, 40oC, đồng hóa 19/49 và lên men 24/49 loại đường, sinh amylase, cellulase, xylanase, lipase, protease, phytase 6/20 loại enzyme thử API ZYM, sinh chất kháng khuẩn và IAA, mơi trường có 1,03,0% NaCl, mơi trường muối mật có 0,1% Oxbile và vẫn tồn tại sau khi bị xử lý trong dịch dạ dày nhân tạo Chủng này sinh 2 loại xylanase (40 kDa và 15 kDa), 1 loại amylase và 1 loại protease. Nhiệt độ hoạt động thích hợp của 2 loại xylanase là 55oC, amylase là 60oC và protease là 55oC. 2 loại xylanase đều chịu nhiệt tốt 60 oC. Cả 2 loại xylanase đều có pH tối ưu là pH 5, amylase là pH 6 và protease là pH 7. 2 loại xylanase và amylase đều khá bền acid. Ion Ca 2+ tăng cường mạnh nhất hoạt động của 2 loại xylanase và amylase, ion Cu2+ ức chế mạnh nhất hoạt động cả 2 loại xylanase, ion Zn 2+ và Cu2+ ức chế mạnh nhất hoạt động của amylase. ßmercapto tăng cường còn ion Fe3+ ức chế mạnh nhất hoạt động của protease 57 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Hồng Kim Anh (2007), Hóa Học Thực Phẩm, NXB Khoa học Kỹ thuật Bùi Ái (2008), Cơng nghệ lên men ứng dụng trong cơng nghiệp thực phẩm, NXB Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh Vũ Ngọc Bội (2005), Nghiên cứu ứng dụng protease từ Bacillus subtilis trong sản xuất bột đạm thủy phân từ cá mối, Đại học Thủy sản Nha Trang Tơ Minh Châu, Vương Thị Việt Hoa, Vũ Thị Lâm An, Lâm Thanh Hiền, Nguyễn Thị Ngọc Diệp, Nguyễn Thúy Hương (2000), Vi Sinh Vật học đại cương, Đại học Nơng lâm Thành phố Hồ Chí Minh Nguyễn Trọng Cẩn, Nguyễn Thị Hiền, Đỗ Thị Giang, Trần Thị Luyến(1998), Cơng nghệ enzyme, NXB Nơng nghiệp Thành phố Hồ Chí Minh 58 PGS.TS. Ngun Thùy Châu ̃ và cộng sự (2006), “Nghiên cưu áp dung cơng ́ ̣ nghệ vi sinh hiện đai đê san xt axít amin và enzyme t ̣ ̉ ̉ ́ ừ nguôn th ̀ ư ́ phâm nông nghi ̉ ệp và hai san ̉ ̉ ở quy mô bán công nghiệp”, Báo cáo tông ̉ kêt đê tài Khoa hoc Công ngh ́ ̀ ̣ ệ câp Nhà n ́ ước , Viện Nơng nghiệp và Cơng nghệ sau thu hoach, Hà N ̣ ội Trương Thị Hòa (1994), Nghiên cứu ứng dụng protease trong sản xuất bia, viện Cơng nghệ Thực phẩm Lê Thị Loan (2002), Một số đặc tính sinh hóa, miễn dịch và sinh học phân tử của các chủng Bacillus Du và NT trong sản xuất sinh phẩm , Viện Vacxin cơ sở 2 Đà Lạt Nguyễn Sỹ Lê Thanh, Quyền Đình Thi (2009), “Nhân dòng và phân tích trình tự gen mã hóa xylanase từ A. niger DSM195”, Báo cáo Hội nghị Cơng nghệ Sinh học tồn quốc, NXB Đại học Thái Ngun, 6, tr. 701 704 10 Đặng Thị Thu, Lê Ngọc Tú, Tô Kim Anh, Phạm Thu Thủy, Nguyễn Xuân Sâm (2004), Công nghệ Enzyme, NXB Khoa học và Kỹ thuật 11 Vu Thi Th ̃ ̣ ứ (1996), Nghiên cưu đ ́ ặc điêm sinh hoc và kha năng ̉ ̣ ̉ ưng dung ́ ̣ cua m ̉ ột sô ch ́ ủng vi khuân thu ̉ ộc chi Bacillus, Luận án tiến sỹ Khoa hoc Sinh hoc, Hà N ̣ ̣ ội 12 Trịnh Thành Trung, Nguyễn Thị Thu Thủy, Nguyễn Mạnh Hùng, Đào Thị Lương và Dương Văn Hợp (2011), “so sánh sự đa dạng về vi khuẩn hiếu khí sinh nội bào tử tại rừng Quốc gia Hồng Liên và các vùng đất canh tác nơng nghiệp lân cận”, Hội nghị Khoa học tồn Quốc về Sinh thái và Tài ngun Vi sinh vật, 4, pp. 9961003 13 Ngơ Văn Thu (2011), Bài Giảng Dược Liệu, 1, Đại học Dược Hà Nội 14 Nguyễn Đình Thương (2005), Cơng nghệ sản xuất kiểm tra cồn ethylen, NXB Khoa học Kỹ thuật 15 Nguyễn Thị Thảo, Quyền Đình Thi (2006), “Ảnh hưởng của các yếu tố mơi trường lên q trình sinh trưởng và sinh tổng hợp Protease của chủng Serratia sp. DT3”, Tạp chí Sinh học, 2, NXB Khoa học Tự nhiên và Cơng nghê 59 Tiếng Anh 16 Alvarez F, Castro M, Principe A, Borioli G, Fischer S, Mori G & Jofre E (2012), “The plantassociated Bacillus amyloliquefaciens strains MEP2 18 and ARP2 3 capable of producing the cyclic lipopeptides iturin or surfactin and fengycin are effective in biocontrol of sclerotinia stem rot disease”, Journal of Applied Microbiology, 112, pp. 159174 17 Arguelles Arias A, Ongena M, Halimi B, Lara Y, Brans A, Joris B & Fickers P (2009), “Bacillus amyloliquefaciens GA1 as a source of potent antibiotics and other secondary metabolites for biocontrol of plant pathogens”, Microbial Cell Factories, 8, pp. 63 18 Aris Tri Wahyudi et al. (2011), “Characterization of Bacillus sp strains isolated from zhizosphere of soybean plants for their use as potentoal plant growth for promoting Rhizobacteria”, Jounal of Microbiology and Antimicrobials, 3, pp. 3440 19 Bailey, M.J., Biely, P., and Poutanen, K. (1992), “Interlaboratory testing of methods for assay of xylanase activity”, Journal of Biotechnology, 23, pp. 257270 20 Barredo JL (2005), “Microbial enzymes and biotransformations”, Humana Press Inc., pp. 151180 21 Benitez LB, Velho RV, de Souza da Motta A, Segalin J & Brandelli A (2012), “Antimicrobial factor from Bacillus amyloliquefaciens inhibits Paenibacillus larvae, the causative agent of American foulbrood”, Archives of Microbiology, 194, pp. 177185 22 Borriss R, Chen XH, Rueckert C, et al. (2011), “Relationship of Bacillus amyloliquefaciens clades associated with strains DSM 7T and FZB42T: a proposal for Bacillus amyloliquefaciens subsp amyloliquefaciens subsp. nov. and Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum subsp. nov. based on complete genome sequence comparisons”, International Journal Systematic Evolutionary Microbiology, 61, pp. 17861801 23 Buchanan, J.R. and N.E. Gibbons. (1974), “Bergey’s manual of determinative bacteriology”, The Williams and Wilkins Company, 8, Baltimore 60 24 Chun J & Bae KS (2000), “Phylogenetic analysis of Bacillus subtilis and related taxa based on partial gyrA gene sequences”, Antonie Van Leeuwenhoek, 78, pp. 123127 25 Cao H, He S, Wei R, Diong M & Lu L (2011) “Bacillus amyloliquefaciens G1: A potential antagonistic bacterium against eelPathogenic aeromonas hydrophila”, Evid Based Complementary Alternative Medicine 26 Degefu Y (2003), Cloning and characterization of xylanase gene from phytopathogenetic fungi with a special reference to Helminthosporium turcicum, the cause of the northern leaf blight of maize, University of Helsinki, Poland 27 Fan B, Borriss R, Bleiss W & Wu X (2012), “Grampositive rhizobacterium Bacillus amyloliquefaciens FZB42 colonizes three types of plants in different patterns”, Journal of Microbiology, 50, pp. 3844 28 Fu S, Sun J, Qian L & Li Z (2008), “Bacillus phytases: present scenario and future perspectives”, Applied Biochemistry and Biotechnology, 151, pp. 18 29 Gutierrez C. K. et al (2009), “Production of the phytohormone Indole3acetic axít by estuarine species of the genus vibrio”, Applied and Environmental Microbiology, pp. 22532258 30 Idris E. E. et al. (2007), “Tryptophandependent production of indole3acetic axít (IAA) affects level of plant growth promotion by Bacillus amyloliquefaciens FZB42”, Molecular PlantMicrobe Interactions, 20, pp. 619626 31 Jamaly et al. (2011), British Micobiology Research Journal, 1, 4, pp. 7994 32 Jorquera et al. (2010), “identification of βpropeller phytaseencoding genes in culturable Paenibacillus and Bacillus spp. from the zhizosphere of pasture plants on volcanic soils”, Federation of European Microbiological societies, 75, pp. 163172 33 Julio P., Andrew P. M (2007), Industrial enzymes: structure, function and applications , University of Helsinki, Poland 61 34 Ken K. Y. W., Larry U. L. T, and John N.S. (1988), “Multiplicity of β1,4 xylanase in microorganisms: Functions and application”, Microbiological reviews, pp. 305317 35 Kurtzman, C P., and C J Robnett. (1997), “Identification of clinically important ascomycetous yeasts based on nucleotide divergence in the 5′ end of the largesubunit (26S) ribosomal DNA gene”, Journal of Clinical Microbiology, 35, pp. 12161223 36 Lazim et al. (2009), Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology, 36, pp. 531537 37 Lee H & Kim HY (2011), “Lantibiotics, class I bacteriocins from the genus Bacillus”, Journal of Microbiology and Biotechnology, 21, pp. 229235 38 Lee Y E., Pyung O L (2004), “Purification and characterization of two thermostable xylanases from Paenibacillus sp. DG22”, Journal of Microbiology and Biotechnology, 14, 5, pp. 1014 – 1021 39 Miller G.L. (1959), “Use of dinitrosalicylic axít reagent for determination of reducing sugar”, Analytical Chemistry, 31, 3, pp. 426428 40 Mishra S. and Behara N., (2008), “Amylase activity of a starch degrading bacteria isolated from soil receiving kitchen wastes”, African Journal of Biotechnology Vol. 7, 18, pp. 33263331 41 Nakamura LK, Roberts MS & Cohan FM (1999), “Relationship of Bacillus subtilis clades associated with strains 168 and W23: a proposal for Bacillus subtilis subsp subtilis subsp. nov. and Bacillus subtilis subsp. spizizenii subsp. nov.”, International Journal of Systematic Bacteriology, 49 (3), pp. 12111215 42 Priest FG, Goodfellow M, Shute LA & Berkeley RCW (1987), “Bacillus amyloliquefaciens sp nov norn rev.” International Journal of Systematic Bacteriology, 37, pp. 6971 43 Richard R.B., Murray P.D., (2009) Methods in enzymology, guide to protein purification, London NW1 7BY, UK 44 Rooney AP, Price NP, Ehrhardt C, Swezey JL & Bannan JD (2009), “Phylogeny and molecular taxonomy of the Bacillus subtilis species complex and description of Bacillus subtilis subsp. inaquosorum subsp. 62 nov.” International Journal of Systematic Bacteriology, 59, pp. 2429 2436 45 Sakiyama, Y., Nguyen, K. N. T., Nguyen, M. G., Miyadoh, S., Duong, V. H. & Ando, K. (2009), “Kineosporia babensis sp. nov., isolated from plant litter in Vietnam”, International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 59, pp. 550554 46 Sansinenea E & Ortiz A (2011), “Secondary metabolites of soil Bacillus spp.”, Biotechnol Lett, 33, pp. 15231538 47 Sanders ME (2008), “Probiotics: definition, sources, selection, and uses”, Clinical Infectious Diseases, 46, Suppl 2, S5861, discussion S144151 48 Saxelin M (2008), “Probiotic formulations and applications, the current probiotics market, and changes in the marketplace: a European perspective”, Clinical Infectious Diseases, 46, Suppl 2, S7679, discussion S144151 49 Sapre M.P., Jha H. and Patil M.B. (2005), “Purification and characterization of a thermoalkalophilic xylanase from Bacillus sp.”, World Journal of Microbiology & Biotechnology, 21, pp. 649 654 50 Sharmin S., Hossain M T and Anwar M N.,(2005), "Isolation and characterization of a protease producing bacteria Bacillus amovivorus and optimization of some factor of culture conditions for protease production", Journal of biological sciences 5, 3, pp. 358362 51 Subramaniyan (2012), “Isolation, purification and characterisation of low molecular weight xylanase from Bacillus pumilus SSP34”, Applied Biochemistry and Biotechnology, 166, pp. 18311842 52 Sutyak KE, Wirawan RE, Aroutcheva AA & Chikindas ML (2008), “Isolation of the Bacillus subtilis antimicrobial peptide subtilosin from the dairy productderived Bacillus amyloliquefaciens”, Journal of Applied Microbiology, 104, pp. 10671074 53 Tseng MJ et al. (2004), “Cloning and characterization of two thermostable xylanases from an alkaliphilic Bacillus firmus”, Biochemistry and Biophysical Research Communications, 319, 3, pp. 10171025 63 54 Ufuk B., Sebnem Y., Ferda G., Aysegul E. (2001), “An endo1,4xylanase from Rhizopus oryzae: production, partial purification and biochemical characterization”, Journal of Applied Sciences Research, 6, 9, pp. 1373 1378 55 Yao AV, Bochow H, Karimov S, Boturov U, Sanginboy S & Sharipov K (2006), “Effect of FZB42 Bacillus subtilis as a biofertilizer on cotton yields in field tests”, Archives of Phytopathology and Plant Protection, 39, pp. 323–328 56 Yin et al., Agric J. (2010), Food Chemistry, Institute of Food Technologists, 58, pp. 557–562 64 PHỤ LỤC A HĨA CHẤT DÙNG TRONG CÁC THÍ NGHIỆM Thuốc thử DNS Dinitrosalicylic axít 1%; phenol 0,2%; sodium sulfite 0,05%; sodium hydroxide 1%; sodium tartrate 20% Casein 2% Casein được pha trong NaOH 0,2 M, sau đó dùng HCl 1M để đưa pH về 7 rồi thêm H2O để nồng độ casein là 2% Copper sulfate reagent 100 mg CuSO4 .5H2O + 200 mg C4H4NaKO6 + 10 g Na2CO3 + 100 ml H2O Hỗn hợp WS1 WS1 = 100 ml Copper sulfate reagent + 100 ml SDS 5% + 200 ml NaOH 3,2% Hỗn hợp WS2 WS2 = 10 ml FolinCiocalteu’s Phenol reagent + 40 ml H2O Đệm chạy sắc ký trao đổi ion gel CM Sepharose Đệm acetate 50 mM pH 5,78 Đệm chạy sắc ký trao đổi ion gel DEAE Sepharose Đệm TrisHCl 0,02 M pH 8 Thành phần bản gel chạy điện di SDSPAGE Resolving gel: 3,35 ml H2O + 2,5 ml TrisHCl 1,5M pH 8,8 + 0,1 ml SDS 10% + 4 ml acrylamide + 50 µl ammonium persulfate 10% + 5µl TEMED 65 Stacking gel: 3,05 ml H2O + 1,25 ml TrisHCl 0,5 M pH 6,8 + 0,65 ml acrylamide + 50 µl SDS 10% + 25 µl APS 10% + 5 µl TEMED Stock sample buffer 4,8 ml H2O + 1,2 ml TrisHCl 0,5 M pH 6,8 + 2 ml SDS 10% + 1 ml glycerol + 0,5 ml bromophenol 0,5% SDS reducing buffer 950 µl Stock sample buffer + 50 µl 2mercaptoethanol Dung dịch Coomassie Brilliant Blue R250 0,5 g Coomassie Brilliant Blue R250 + 200 ml methanol + 50 ml acetic axít + 250 ml H2O Dung mơi chạy sắc ký lớp mỏng nbutanol : H2O : pyridine : toluene = 10 : 6 : 6 : 1 Dung dịch nhuộm bản sắc ký lớp mỏng 5 ml nbutanol + 5 ml H2O + 0,325 g phthalic axít + 0,2 ml aniline Dung dịch Salkowski R1 FeCl312; H2SO4429 (g hoặc ml/l) B CÁC LOẠI MỒI DÙNG TRONG LUẬN VĂN Cặp mồi dùng trong phản ứng khuếch đại đoạn 16S rDNA 27F: 5'AGAGTTTGATCCTGGCTCAG3' 1525R: 5'AAAGGAGGTGATCCAGCC3' Các mồi dùng trong phản ứng cho đọc trình tự đoạn 16S rDNA 66 27F: 5'AGAGTTTGATCCTGGCTCAG3' 1525R: 5'AAAGGAGGTGATCCAGCC3' 780F: 5'GAATTGATACCCTGGTAG3 350R: 5'CTGCTGCCTCCCGTAG3' 1100F: 5'GCAACGAGCGCAACCC3' 920R: 5'GTCAATTCCTTTGAGTTT3' Các mồi dùng phương pháp phân tích trình tự đa gen gyrA 42F: 5'CAGTCAGGAAATGCGTACGTCCTT3' gyrA 1066R: 5'CAAGGTAATGCTCCAGGCATTGCT3' rpoB 2292F: 5'GACGTGGGATGGCTACAACT3' rpoB 3354R: 5'ATTGTCGCCTTTAACGATGG3' purH 70F: 5'ACAGAGCTTGGCGTTGAAGT3' purH 1013R: 5'GCTTCTTGGCTGAATGAAGG3' polC 1505F: 5'TTGTCGCTCAYAATGCAAGC3' polC 2337R: 5'YTCAAGCATTTCRTCTGTCG3' groEL 550F: 5'GAGCTTGAAGTKGTTGAAGG3' groEL 1497R: 5'TGAGCGTGTWACTTTTGTWG3' DANH SÁCH BẢNG C Bảng 1. Các enzyme ngoại bào, môi trường khuếch tán và thuốc thử tương ứng Enzyme Môi trường Thuốc thử Amylase NA + 0,1% tinh bột tan Lugo CMCase NA + 0,1% CMC Lugo Xylanase NA + 0,1% xylan Đỏ Congo Lipase NA + 0,1% tributyrin Không cần thuốc thử Protease NA + 0,1% casein Axít acetic 2% Phytase NA + 0,1% natri phytate Jorquera và cộng sự (2010) Bảng 2. Các loại mơi trường dùng nghiên cứu Stt 67 Loại mơi trường Mơi trường khống + 0.5% Dglucose + 0.5% cơ chất tinh bột tan Mơi trường khống + 0.5% Dglucose + 0.5% cơ chất casein Mơi trường khống + 0.5% Dglucose + 0.5% cơ chất CMC Mơi trường khống + 0.5% Dglucose + 0.5% cơ chất xylan Mơi trường khống + 0.5% Dglucose + 0.5% cơ chất chitin Mơi trường khống + 0.5% Dglucose + 0.5% cơ chất tributyrin Mơi trường khống + 0.5% Dglucose + 0.5% cơ chất pectin Mơi trường khống + 0.5% Dglucose + 0.5% cơ chất tổng hợp Mơi trường NA dịch thể 10 Mơi trường khống + 1% Dglucose Bảng 3. Nồng độ bão hòa của ammonim sulfate [44] 68 69 Bảng 4. Các loại đệm dùng trong thí nghiệm xác định đặc tính enzyme Đệm citrate phosphate Dung dịch A: Citrate axít 0,1 M Dung dịch B: Sodium phosphate 0,2 M A (ml) B (ml) Nước (ml) pH 3,98 1,02 3,07 1,93 2,43 2,57 5 1,79 3,21 0,65 4,36 Đệm TrisHCl Dung dịch C: TrisHCl 0,2 M Dung dịch D: HCl 0,2 M C (ml) D (ml) Nước (ml) pH 2,5 1,34 6,16 2,5 0,25 7,25 Bảng 5. Các ion kim loại và hóa chất dùng trong thí nghiệm xác định đặc tính enzyme Stt Ion kim loại Hóa chất KLPT mg/10 ml (200 mM) Na+ NaCl 58,5 117 K+ KCl 74,5 149 Mg2+ MgCl2 95 190 Mn2+ MnSO4.H2O 169 338 Ca2+ CaCl2 111 222 Cu2+ CuSO4 160 320 Fe2+ FeSO4.7H2O 278 556 Fe3+ FeCl3.6H2O 270 540 Zn2+ ZnSO4.7H2O 287,5 575 10 EDTA 292 584 11 SDS 288 576 70 12 71 ßmecaptoethanol 78 156 ...ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Phan Lạc Dũng NGHIÊN CỨU CÁC ĐẶC TÍNH SINH HỌC VÀ TIỀM NĂNG ỨNG DỤNG CỦA CHỦNG VI KHUẨN BACILLUS AMYLOLIQUEFACIENS ... Nhằm góp phần tìm hiểu thêm kiến thức về chi Bacillus nói chung và ứng dụng của các lồi thuộc nhóm B. subtilis nói riêng, chúng tơi tiến hành đề tài: Nghiên cứu các đặc tính sinh học và tiềm năng ứng dụng của chủng vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens ... DỤNG CỦA CHỦNG VI KHUẨN BACILLUS AMYLOLIQUEFACIENS SUBSP. PLANTARUM SP 1901 PHÂN LẬP TẠI RỪNG QUỐC GIA HỒNG LIÊN Chun ngành: Vi sinh vật học Mã số: 60 42 40 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC