1. Trang chủ
  2. » Luận Văn - Báo Cáo

Luận văn Thạc sĩ Khoa học: Nghiên cứu các đặc tính sinh học và tiềm năng ứng dụng của chủng vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum SP 1901 phân lập tại rừng Quốc gia Hoàng

71 218 1

Đang tải... (xem toàn văn)

Tài liệu hạn chế xem trước, để xem đầy đủ mời bạn chọn Tải xuống

THÔNG TIN TÀI LIỆU

Thông tin cơ bản

Định dạng
Số trang 71
Dung lượng 1,44 MB

Nội dung

Mục tiêu chính của luận văn: Tuyển chọn các chủng vi khuẩn thuộc nhóm B. subtilis phân lập tại rừng Quốc gia Hoàng Liên; sử dụng kỹ thuật phân tích trình tự đa gen để phân loại chính xác các chủng vi khuẩn nghiên cứu đến cấp độ loài và dưới loài.

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN ­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­ Phan Lạc Dũng NGHIÊN CỨU CÁC ĐẶC TÍNH SINH HỌC VÀ TIỀM NĂNG ỨNG  DỤNG CỦA CHỦNG VI KHUẨN BACILLUS   AMYLOLIQUEFACIENS  SUBSP. PLANTARUM SP 1901 PHÂN LẬP TẠI RỪNG QUỐC GIA  HỒNG LIÊN LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội ­ Năm 2013 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN ­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­ Phan Lạc Dũng NGHIÊN CỨU CÁC ĐẶC TÍNH SINH HỌC VÀ TIỀM NĂNG ỨNG  DỤNG CỦA CHỦNG VI KHUẨN BACILLUS   AMYLOLIQUEFACIENS  SUBSP. PLANTARUM SP 1901 PHÂN LẬP TẠI RỪNG QUỐC GIA  HỒNG LIÊN Chun ngành: Vi sinh vật học Mã số: 60 42 40 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC                                                             NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC TS. TRỊNH THÀNH TRUNG Hà Nội ­ Năm 2013 LỜI CẢM ƠN Trước tiên, tơi xin bày tỏ  lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Trịnh Thành Trung,   người đã dẫn dắt, chỉ bảo và tạo mọi điều kiện giúp đỡ tơi hồn thành luận văn   cao học này Tơi xin chân thành cảm  ơn các cán bộ, anh chị đang làm việc tại Viện Vi   sinh vật và Cơng nghệ Sinh học ­ Đại học Quốc gia Hà Nội đã giúp đỡ  tơi trong   q trình hồn thành luận văn Tơi xin chân thành cảm  ơn các thầy cơ giáo trong Bộ mơn Vi sinh vật học   nói riêng và Khoa Sinh học nói chung đã dạy dỗ tơi trong q trình học tập Cuối cùng, tơi xin chân thành cảm  ơn gia đình, bạn bè đã ln động viên,   giúp đỡ, hỗ trợ để tơi có thể hồn thành luận văn này Hà Nội, tháng 5 năm 2013 Học viên Phan Lạc Dũng MỤC LỤC   DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1. Khả năng sinh trưởng của chủng SP 1901 ở các nhiệt độ khác  33 Bảng 3.2. Khả năng đồng hoá các loại  đường………………………………… 34 Bảng 3.3. Khả năng lên men các loại  đường………………………………… 35 Bảng 3.4. Khả năng sinh enzyme ngoại bào theo phương pháp sử dụng kit  API ZYM………………………………….…………………………………… 37 Bảng 3.5. Tỷ lệ giữa hoạt độ xylanase (U/ml) và nồng độ protein (mg/ml)  của chủng SP 1901………………………………… ……………………………… 40 Bảng 3.6. Hoạt độ của xylanase sau các bước tinh  sạch……………………… 46 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Cấu trúc hóa học của xylan và các vị  trí tấn cơng của hệ  thống  enzyme xylanolytic………………………………….………………………… Hình 1.2. Cấu trúc hóa học của amylose và amylopectin…………………… 11 Hình   1.3.  Phản   ứng   thủy   phân   liên   kết   peptide     chuỗi  polypeptide……… Hình   2.1.  13 Đồ   thị   đường   chuẩn   theo   thang  BSA……………………………… 21 Hình 2.2. Đồ thị đường chuẩn theo thang xylose…………………………… 22 Hình 2.3. Đồ thị đường chuẩn theo thang glucose…………………………… 23 Hình   2.4.  24 Đồ   thị   đường   chuẩn   theo   thang   L­ tyrosine………………………… Hình 3.1.  Cây phát sinh chủng loại của 37 chủng vi khuẩn  Bacillus  phân  lập tại rừng Quốc gia Hồng Liên và 9 lồi thuộc nhóm vi khuẩn  B. subtilis  dựa     phân   tích   trình   tự   16S   rDNA………………………………… ………… 28 Hình 3.2.  Cây phát sinh chủng loại của các lồi vi khuẩn thuộc nhóm  B.  subtilis………………………………….…………………………………… 30 Hình   3.3.  Hình  thái  khuẩn  lạc   chủng   SP   1901  (a),   hình  thái  tế   bào  khi  nhuộm   gram   (b)     soi     (c)   ………………………………… …………………… 31 Hình 3.4  pH sinh trưởng tối  ưu (a). Khả  năng chịu muối NaCl (b). Khả    chịu   dịch     dày   (c)   Khả     chịu   muối   mật   (d)   …………………………… 31 Hình 3.5  Khả  năng sinh chất kích thích sinh trưởng IAA của chủng SP   1901   sau   24,   48     72   giờ………………………………… ……………………… 32 Hình 3.6. Khả  năng sinh IAA làm cho dung dịch chuyển từ màu vàng sang   đỏ  (a).  Ảnh hưởng của chủng SP 1901 lên khả  năng sinh trưởng của cây   ngô   sau   10   ngày   trồng   (b)   ………………………………… ………………………… 32 Hình 3.7. Vòng phân giải cơ chất của các enzyme ngoại bào. Amylase (a).  Cellulase (b). Phytase (c). Protease (d). Xylanase (e) ……………………… 36 Hình 3.8. Phản  ứng thử  nghiệm khả năng sinh enzyme trên thanh thử  API   ZYM………………………………….……………………………………… 37 Hình 3.9. Khả  năng sinh kháng sinh của chủng SP 1901 theo phương pháp   khuếch tán trên thạch. Đĩa thạch cấy sẵn vi khuẩn  E. coli  (a). Vi khuẩn  Shigella sp. (b). Vi khuẩn S. aureus (c) ………………………………………  38 Hình 3.10  Khả  năng sinh trưởng trên các mơi trường khác nhau (a, b) và  hoạt độ  xylanase ngoại bào (c, d) của chủng SP 1901 khi ni cấy trên 10  loại   mơi   trường         khác   nhau………………………………… ……………… 39 Hình 3.11  Hoạt độ  xylanase (U/ml) và nồng độ  protein (mg/ml) khi ni  39 cấy trên mơi trường có bổ sung CMC và glucose và mơi trường NA dịch thể        khác   nhau………………………………… ………………………… Hình   3.12  Hoạt   tính   amylase     protease     chủng   SP   1901     mơi  trường   có   bổ   sung   CMC     glucose     môi   trường   NA   dịch  thể…………………… 40 Hình 3.13. Hoạt độ xylanase và nồng độ protein ở các phân đoạn trong sắc  ký   trao   đổi   ion   gel   CM   Sepharose………………………………… …………… 41 Hình 3.14. Hoạt độ amylase và nồng độ  protein ở các phân đoạn trong sắc  ký   trao   đổi   ion   gel   DEAE   Sepharose………………………………… ………… 42 Hình 3.15. Hoạt độ protease và nồng độ  protein ở các phân đoạn trong sắc   ký   trao   đổi   ion   gel   CM   Sepharose………………………………… …………… 42 Hình 3.16. Hoạt độ xylanase ở các phân đoạn trong sắc ký lọc gel………… 43 Hình 3.17. Hoạt độ amylase ở các phân đoạn trong sắc ký lọc gel………… 44 Hình 3.18. Hoạt độ protease ở các phân đoạn trong sắc ký lọc gel………… 44 Hình 3.19. Điện di SDS­PAGE 2 mẫu xyl 29 và xyl 36…………………… 45 Hình   3.20.  Nhiệt   độ   hoạt   động   tối   ưu     xyl   29,   xyl   36,   amylase   và  protease từ   chủng     SP  1901…………………………………………………………… 46 Hình 3.21. Khả  năng bền nhiệt của xyl 29, xyl 36, amylase và protease từ  chủng SP 1901……………………………………………………………… 47 Hình 3.22. pH hoạt động tối  ưu của xyl 29, xyl 36, amylase và protease từ  chủng SP 1901……………………………………………………………… 48 Hình 3.23.  Khả  năng bền axít của xyl 29, xyl 36, amylase và protease từ  chủng SP 1901……………………………………………………………… 49 Hình 3.24.  Khả  năng bền ion kim loại và hóa chất của xyl 29, xyl 36,   amylase     protease   từ 1901…………………………………………………   chủng   SP  50 Hình 3.25. Bản chạy sắc ký lớp mỏng để phân tích sản phẩm thủy phân từ    chất   xylan     xylanase   1901…………………………………… CÁC KÝ HIỆU VIẾT TẮT BSA Bovine serum albumin CMC Carboxymethyl cellulose DNA Deoxyribonucleic axít DNS  Dinitrosalicylic IAA Indole­3­acetic axít PAGE Polyacrylamide gel electrophoresis PCR Polymerase chain reaction RNA Ribonucleic axít SDS Sodium dodecyl sulfate   chủng   SP  52 ĐẶT VẤN ĐỀ Ngày nay, việc ứng dụng vi sinh vật vào trong đời sống và sản xuất đã trở  nên rất phổ  biến. Con người đã và đang khai thác triệt để  nguồn tài ngun vi   sinh vật trong nhiều lĩnh vực khác nhau. Trong y học, nhờ có vi sinh vật mà con  người đã tổng hợp thành cơng nhiều loại chế  phẩm như  vacxin, kháng sinh,  hormone, vitamin giúp phòng ngừa và điều trị  nhiều loại bệnh cho con người   Trong nơng nghiệp, nhiều chế  phẩm sinh học có nguồn gốc từ  vi sinh vật đã   được sản xuất để diệt trừ sâu bệnh hại cây và làm phân bón vi sinh. Trong cơng   nghiệp thực phẩm, con người đã  ứng dụng vi sinh vật để  sản xuất ra các loại   protein, enzyme, chế phẩm probiotic và các loại thực phẩm lên men truyền thống.  Ngồi ra, vi sinh vật còn được ứng dụng vào trong xử lý rác thải hữu cơ và nước   thải trong sản xuất cơng nghiệp. Với khả năng chuyển hóa mạnh mẽ và sinh sản  nhanh chóng, vi sinh vật đóng một vai trò to lớn trong hệ  sinh thái tự  nhiên và  trong các hoạt động cải thiện chất lượng cuộc sống của con người Bacillus là một trong những vi sinh vật đầu tiên được phát hiện và mơ tả  trong giai đoạn đầu của tiến trình phát triển ngành vi sinh vật học ở cuối thế kỷ  19. Đây là một chi lớn với gần 200 lồi vi khuẩn hiếu khí, hình que và có khả  năng sinh nội bào tử. Chúng phân bố  rộng rãi trong các hệ  sinh thái tự  nhiên, từ  trên cạn đến dưới nước, từ nước ngọt đến nước mặn và từ  ven bờ đến đáy các   Đại Dương. Ngồi các lồi vi khuẩn gây bệnh cho con người như  B. anthracis và  B. cereus, nhiều lồi vi khuẩn thuộc chi Bacillus đặc biệt là nhóm B. subtilis có  tính  ứng dụng cao trong nhiều lĩnh vực  như  y dược  học, nơng nghiệp, cơng  nghiệp thực phẩm và xử  lý mơi trường. Do đó, các lồi thuộc chi  Bacillus đã và  đang ngày càng trở  thành những vi sinh vật quan trọng hàng đầu về  mặt  ứng   dụng.  Nhằm góp phần tìm hiểu thêm kiến thức về chi Bacillus nói chung và ứng  dụng của các lồi thuộc nhóm B. subtilis nói riêng, chúng tơi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu các đặc tính sinh học và tiềm năng ứng dụng của chủng   vi khuẩn  Bacillus amyloliquefaciens  subsp  plantarum  SP 1901 phân lập tại  rừng Quốc gia Hồng Liên” với 4 mục tiêu chính sau: (i) Tuyển chọn các chủng vi khuẩn thuộc nhóm B. subtilis phân lập tại rừng  Quốc gia Hồng Liên (ii) Sử  dụng kỹ  thuật phân tích trình tự  đa gen để  phân loại chính xác các  chủng vi khuẩn nghiên cứu đến cấp độ lồi và dưới lồi (iii) Tìm hiểu các đặc tính sinh học q của chủng vi khuẩn được lựa chọn (iv) Tách chiết, tinh sạch và đánh giá sơ  bộ  đặc tính các enzyme ngoại của  chủng vi khuẩn nghiên cứu 10 KẾT LUẬN Từ  bộ  giống vi khuẩn phân lập tại rừng Quốc gia Hồng Liên, duy nhất  chủng SP 1901 thuộc nhóm  B. subtilis  Chủng này là  B. amyloliquefaciens  subsp. plantarum.  Chủng SP 1901 sinh trưởng tốt nhất   pH 7, 40oC, đồng hóa 19/49 và lên  men 24/49 loại  đường,  sinh amylase, cellulase, xylanase, lipase,  protease,   phytase     6/20   loại   enzyme       thử   API   ZYM,   sinh   chất   kháng  khuẩn và IAA, mơi trường có 1,0­3,0% NaCl, mơi trường muối mật có 0,1%  Ox­bile và vẫn tồn tại sau khi bị xử lý trong dịch dạ dày nhân tạo Chủng này sinh 2 loại xylanase (40 kDa và 15 kDa), 1 loại amylase và 1 loại   protease.  Nhiệt độ hoạt động thích hợp của 2 loại xylanase là 55oC, amylase là 60oC  và protease là 55oC. 2 loại xylanase đều chịu nhiệt tốt   60 oC. Cả  2 loại  xylanase đều có pH tối  ưu là pH 5, amylase là pH 6 và protease là pH 7. 2   loại xylanase và amylase đều khá bền acid. Ion Ca 2+ tăng cường mạnh nhất  hoạt động của 2 loại xylanase và amylase, ion Cu2+  ức chế mạnh nhất hoạt  động cả 2 loại xylanase, ion Zn 2+ và Cu2+ ức chế mạnh nhất hoạt động của  amylase. ß­mercapto tăng cường còn ion Fe3+  ức chế mạnh nhất hoạt động  của protease 57 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Hồng Kim Anh (2007), Hóa Học Thực Phẩm, NXB Khoa học ­ Kỹ thuật Bùi Ái (2008), Cơng nghệ lên men ứng dụng trong cơng nghiệp thực phẩm,  NXB Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh Vũ Ngọc Bội (2005),  Nghiên cứu  ứng dụng protease từ  Bacillus subtilis   trong sản xuất bột đạm thủy phân từ  cá mối, Đại học Thủy sản Nha  Trang Tơ Minh Châu, Vương Thị  Việt Hoa, Vũ Thị  Lâm An, Lâm Thanh Hiền,  Nguyễn Thị Ngọc Diệp, Nguyễn Thúy Hương (2000), Vi Sinh Vật học   đại cương, Đại học Nơng lâm Thành phố Hồ Chí Minh Nguyễn   Trọng   Cẩn,   Nguyễn   Thị   Hiền,   Đỗ   Thị   Giang,   Trần   Thị  Luyến(1998),  Cơng nghệ  enzyme, NXB Nơng nghiệp Thành phố  Hồ  Chí Minh 58 PGS.TS. Ngun Thùy Châu  ̃ và cộng sự (2006), “Nghiên cưu áp dung cơng ́ ̣   nghệ  vi sinh hiện  đai đê san xt axít amin và enzyme t ̣ ̉ ̉ ́ ừ nguôn th ̀ ư ́ phâm nông nghi ̉ ệp và hai san  ̉ ̉ ở quy mô bán công nghiệp”, Báo cáo tông ̉   kêt đê tài Khoa hoc ­ Công ngh ́ ̀ ̣ ệ câp Nhà n ́ ước , Viện Nơng nghiệp và  Cơng nghệ sau thu hoach, Hà N ̣ ội Trương Thị  Hòa (1994), Nghiên cứu  ứng dụng protease trong sản xuất bia,  viện Cơng nghệ Thực phẩm Lê Thị  Loan (2002), Một số  đặc tính sinh hóa, miễn dịch và sinh học phân   tử  của các chủng Bacillus Du và NT trong sản xuất sinh phẩm , Viện  Vacxin cơ sở 2 Đà Lạt Nguyễn Sỹ  Lê Thanh, Quyền Đình Thi (2009), “Nhân dòng và phân tích   trình tự  gen mã hóa xylanase từ  A. niger DSM195”, Báo cáo Hội nghị   Cơng nghệ Sinh học tồn quốc, NXB Đại học Thái Ngun, 6, tr. 701­ 704 10 Đặng Thị  Thu, Lê Ngọc Tú, Tô Kim Anh, Phạm Thu Thủy, Nguyễn Xuân  Sâm (2004), Công nghệ Enzyme, NXB Khoa học và Kỹ thuật 11 Vu Thi Th ̃ ̣ ứ (1996),  Nghiên cưu đ ́ ặc điêm sinh hoc và kha năng  ̉ ̣ ̉ ưng dung ́ ̣   cua m ̉ ột sô ch ́ ủng vi khuân thu ̉ ộc chi  Bacillus,  Luận án tiến sỹ  Khoa  hoc Sinh hoc, Hà N ̣ ̣ ội 12 Trịnh Thành Trung, Nguyễn Thị  Thu Thủy, Nguyễn Mạnh Hùng, Đào Thị  Lương và Dương Văn Hợp (2011), “so sánh sự  đa dạng về  vi khuẩn  hiếu khí sinh nội bào tử tại rừng Quốc gia Hồng Liên và các vùng đất   canh tác nơng nghiệp lân cận”, Hội nghị Khoa học tồn Quốc về Sinh   thái và Tài ngun Vi sinh vật, 4, pp. 996­1003 13 Ngơ Văn Thu (2011), Bài Giảng Dược Liệu, 1, Đại học Dược Hà Nội 14 Nguyễn Đình Thương (2005),  Cơng nghệ  sản xuất kiểm tra cồn ethylen,  NXB Khoa học Kỹ thuật 15 Nguyễn Thị Thảo, Quyền Đình Thi (2006), “Ảnh hưởng của các yếu tố mơi  trường lên q trình sinh trưởng và sinh tổng hợp Protease của chủng  Serratia  sp. DT3”,  Tạp chí Sinh học, 2, NXB Khoa học Tự  nhiên và  Cơng nghê 59 Tiếng Anh 16 Alvarez F, Castro M, Principe A, Borioli G, Fischer S, Mori G & Jofre E  (2012), “The plant­associated  Bacillus amyloliquefaciens  strains MEP2  18 and ARP2 3 capable of producing the cyclic lipopeptides iturin or  surfactin and fengycin are effective in biocontrol of sclerotinia stem rot  disease”, Journal of Applied Microbiology, 112, pp. 159­174 17 Arguelles Arias A, Ongena M, Halimi B, Lara Y, Brans A, Joris B & Fickers  P   (2009),   “Bacillus   amyloliquefaciens  GA1   as   a   source   of   potent  antibiotics   and   other   secondary   metabolites   for   biocontrol   of   plant  pathogens”, Microbial Cell Factories, 8, pp. 63 18 Aris   Tri   Wahyudi  et   al.  (2011),   “Characterization   of  Bacillus  sp   strains  isolated from zhizosphere of soybean plants for their use as potentoal  plant growth for promoting Rhizobacteria”, Jounal of Microbiology and   Antimicrobials, 3, pp. 34­40 19 Bailey, M.J., Biely, P., and Poutanen, K. (1992),  “Interlaboratory testing of  methods  for assay of xylanase activity”, Journal of Biotechnology, 23,  pp. 257­270 20 Barredo   JL   (2005),   “Microbial   enzymes   and   biotransformations”,  Humana   Press Inc., pp. 151­180 21 Benitez LB, Velho RV, de Souza da Motta A, Segalin J & Brandelli A (2012),  “Antimicrobial   factor   from  Bacillus   amyloliquefaciens  inhibits  Paenibacillus   larvae,   the   causative   agent   of   American   foulbrood”,  Archives of Microbiology, 194, pp. 177­185 22 Borriss   R,   Chen   XH,   Rueckert   C,   et   al.  (2011),   “Relationship   of  Bacillus   amyloliquefaciens clades associated with strains DSM 7T and FZB42T:  a   proposal   for  Bacillus   amyloliquefaciens  subsp  amyloliquefaciens  subsp. nov. and Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum subsp. nov.  based   on   complete   genome   sequence   comparisons”,  International   Journal Systematic Evolutionary Microbiology, 61, pp. 1786­1801 23 Buchanan, J.R. and N.E. Gibbons. (1974), “Bergey’s manual of determinative  bacteriology”, The Williams and Wilkins Company, 8, Baltimore 60 24 Chun   J   &   Bae   KS   (2000),   “Phylogenetic   analysis   of  Bacillus   subtilis  and  related   taxa   based   on   partial  gyrA  gene   sequences”,  Antonie   Van   Leeuwenhoek, 78, pp. 123­127 25 Cao H, He S, Wei R, Diong M & Lu L (2011) “Bacillus amyloliquefaciens G1:  A   potential   antagonistic   bacterium   against   eel­Pathogenic   aeromonas  hydrophila”, Evid Based Complementary Alternative Medicine 26 Degefu   Y   (2003),  Cloning   and   characterization   of   xylanase   gene   from   phytopathogenetic fungi with a special reference to Helminthosporium   turcicum, the cause of the northern leaf blight of maize, University of  Helsinki, Poland 27 Fan B, Borriss R, Bleiss W & Wu X (2012), “Gram­positive rhizobacterium  Bacillus   amyloliquefaciens  FZB42   colonizes   three   types   of   plants   in  different patterns”, Journal of Microbiology, 50, pp. 38­44 28 Fu S, Sun J, Qian L & Li Z (2008), “Bacillus phytases: present scenario and  future perspectives”,  Applied Biochemistry and Biotechnology, 151, pp.  1­8 29 Gutierrez C. K. et al (2009), “Production of the phytohormone Indole­3­acetic  axít   by   estuarine   species   of   the   genus   vibrio”,  Applied   and  Environmental Microbiology, pp. 2253­2258 30 Idris E. E. et al. (2007), “Tryptophan­dependent  production of indole­3­acetic  axít   (IAA)   affects   level   of   plant   growth   promotion   by  Bacillus   amyloliquefaciens  FZB42”, Molecular  Plant­Microbe  Interactions, 20,  pp. 619­626 31 Jamaly et al. (2011), British Micobiology Research Journal, 1, 4, pp. 79­94 32 Jorquera  et al.   (2010), “identification of  β­propeller phytase­encoding genes   in culturable  Paenibacillus  and  Bacillus  spp. from the  zhizosphere of  pasture   plants   on   volcanic   soils”,  Federation   of   European   Microbiological societies, 75, pp. 163­172 33 Julio P., Andrew P. M  (2007),  Industrial enzymes: structure, function and   applications , University of Helsinki, Poland 61 34 Ken K. Y. W., Larry U. L. T, and John N.S. (1988), “Multiplicity of  β­1,4­ xylanase   in   microorganisms:   Functions   and   application”,  Microbiological reviews, pp. 305­317 35 Kurtzman,   C   P.,   and   C   J   Robnett. (1997),   “Identification   of   clinically  important ascomycetous yeasts based on nucleotide divergence in the 5′  end   of   the   large­subunit   (26S)   ribosomal   DNA   gene”, Journal   of  Clinical Microbiology, 35, pp. 1216­1223 36 Lazim et al. (2009), Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology, 36,  pp. 531­537 37 Lee H & Kim HY (2011), “Lantibiotics, class I bacteriocins from the genus  Bacillus”, Journal of Microbiology and Biotechnology, 21, pp. 229­235 38 Lee   Y   E.,   Pyung   O   L   (2004),   “Purification   and   characterization   of   two  thermostable   xylanases   from  Paenibacillus   sp.  DG­22”,  Journal   of   Microbiology and Biotechnology, 14, 5, pp. 1014 – 1021 39 Miller G.L. (1959),  “Use of dinitrosalicylic axít reagent for determination of  reducing sugar”, Analytical Chemistry, 31, 3, pp. 426­428 40 Mishra S. and Behara N.,  (2008), “Amylase  activity of a starch degrading  bacteria isolated from soil receiving kitchen wastes”, African Journal of   Biotechnology Vol. 7, 18, pp. 3326­3331 41 Nakamura LK, Roberts MS & Cohan FM (1999),  “Relationship of  Bacillus   subtilis  clades   associated   with   strains   168   and   W23:   a   proposal   for  Bacillus subtilis  subsp  subtilis  subsp. nov. and  Bacillus subtilis  subsp.  spizizenii subsp. nov.”, International Journal of Systematic Bacteriology,  49 (3), pp. 1211­1215 42 Priest   FG,   Goodfellow   M,   Shute   LA   &   Berkeley   RCW   (1987),   “Bacillus   amyloliquefaciens    sp   nov     norn     rev.”  International   Journal   of   Systematic Bacteriology, 37, pp. 69­71 43 Richard R.B., Murray P.D., (2009) Methods in enzymology, guide  to protein   purification, London NW1 7BY, UK 44 Rooney   AP,   Price   NP,   Ehrhardt   C,   Swezey   JL   &   Bannan   JD   (2009),  “Phylogeny   and   molecular   taxonomy   of   the  Bacillus   subtilis  species  complex and description of Bacillus subtilis subsp. inaquosorum subsp.  62 nov.”  International Journal of Systematic Bacteriology, 59, pp. 2429­ 2436 45 Sakiyama, Y., Nguyen, K. N. T., Nguyen, M. G., Miyadoh, S., Duong, V. H.  & Ando, K. (2009), “Kineosporia babensis sp. nov., isolated from plant  litter in Vietnam”,  International Journal of Systematic and Evolutionary   Microbiology, 59, pp. 550­554 46 Sansinenea E & Ortiz A (2011), “Secondary metabolites of soil Bacillus spp.”,  Biotechnol Lett, 33, pp. 1523­1538 47 Sanders   ME   (2008),  “Probiotics:   definition,   sources,   selection,   and   uses”,  Clinical Infectious Diseases, 46, Suppl 2, S58­61, discussion S144­151 48 Saxelin   M   (2008),  “Probiotic   formulations   and   applications,   the   current  probiotics   market,   and   changes   in   the   marketplace:   a   European  perspective”,  Clinical   Infectious   Diseases,  46,  Suppl   2,   S76­79,  discussion S144­151 49 Sapre M.P., Jha H. and Patil M.B. (2005), “Purification and characterization  of a thermoalkalophilic xylanase from  Bacillus sp.”,  World  Journal of  Microbiology & Biotechnology, 21, pp. 649 ­ 654 50 Sharmin   S.,   Hossain   M   T   and   Anwar   M   N.,(2005),   "Isolation   and  characterization   of   a   protease   producing   bacteria  Bacillus   amovivorus  and   optimization   of   some   factor   of   culture   conditions   for   protease  production", Journal of  biological sciences 5, 3, pp. 358­362 51 Subramaniyan   (2012),   “Isolation,   purification   and   characterisation   of   low  molecular   weight   xylanase   from   Bacillus   pumilus   SSP­34”,  Applied   Biochemistry and Biotechnology, 166, pp. 1831­1842 52 Sutyak KE, Wirawan RE, Aroutcheva AA & Chikindas ML (2008), “Isolation  of the  Bacillus subtilis  antimicrobial peptide subtilosin from the dairy  product­derived  Bacillus   amyloliquefaciens”,  Journal   of   Applied   Microbiology, 104, pp. 1067­1074 53 Tseng MJ  et al.  (2004), “Cloning and characterization of two thermostable  xylanases   from   an   alkaliphilic   Bacillus   firmus”,  Biochemistry   and  Biophysical Research Communications, 319, 3, pp. 1017­1025 63 54 Ufuk B., Sebnem Y., Ferda G., Aysegul E. (2001), “An endo­1,4­xylanase  from  Rhizopus oryzae: production, partial purification and biochemical  characterization”, Journal of Applied Sciences Research, 6, 9, pp. 1373­ 1378 55 Yao  AV,  Bochow  H,  Karimov  S,  Boturov  U,  Sanginboy S  &  Sharipov K  (2006), “Effect of FZB42  Bacillus subtilis  as a biofertilizer on cotton  yields in field tests”,  Archives of Phytopathology and Plant Protection,  39, pp. 323–328 56 Yin et al.,  Agric J. (2010),  Food Chemistry,  Institute of Food Technologists,  58, pp. 557–562 64 PHỤ LỤC A HĨA CHẤT DÙNG TRONG CÁC THÍ NGHIỆM Thuốc thử DNS Dinitrosalicylic axít ­ 1%; phenol ­ 0,2%; sodium sulfite ­ 0,05%; sodium  hydroxide ­ 1%; sodium tartrate ­ 20% Casein 2% Casein được pha trong NaOH 0,2 M, sau đó dùng HCl 1M để đưa pH về 7   rồi thêm H2O để nồng độ casein là 2% Copper sulfate reagent 100 mg CuSO4 .5H2O + 200 mg C4H4NaKO6 + 10 g Na2CO3 + 100 ml H2O Hỗn hợp WS1 WS1 = 100 ml Copper sulfate reagent + 100 ml SDS 5% + 200 ml NaOH  3,2% Hỗn hợp WS2 WS2 = 10 ml Folin­Ciocalteu’s Phenol reagent + 40 ml H2O Đệm chạy sắc ký trao đổi ion gel CM Sepharose Đệm acetate 50 mM pH 5,78 Đệm chạy sắc ký trao đổi ion gel DEAE Sepharose Đệm Tris­HCl 0,02 M pH 8 Thành phần bản gel chạy điện di SDS­PAGE Resolving gel: 3,35 ml H2O + 2,5 ml Tris­HCl 1,5M pH 8,8 + 0,1 ml SDS  10% + 4 ml acrylamide + 50 µl ammonium persulfate 10% + 5µl TEMED 65 Stacking gel: 3,05 ml H2O + 1,25 ml Tris­HCl 0,5 M pH 6,8 + 0,65 ml  acrylamide + 50 µl SDS 10% + 25 µl APS 10% + 5 µl TEMED Stock sample buffer 4,8 ml H2O + 1,2 ml Tris­HCl 0,5 M pH 6,8 + 2 ml SDS 10% + 1 ml glycerol  + 0,5 ml bromophenol 0,5% SDS reducing buffer 950 µl Stock sample buffer + 50 µl 2­mercaptoethanol Dung dịch Coomassie Brilliant Blue R­250 0,5 g Coomassie Brilliant Blue R­250 + 200 ml methanol + 50 ml acetic axít  + 250 ml H2O Dung mơi chạy sắc ký lớp mỏng n­butanol : H2O : pyridine : toluene = 10 : 6 : 6 : 1 Dung dịch nhuộm bản sắc ký lớp mỏng 5 ml n­butanol + 5 ml H2O + 0,325 g phthalic axít + 0,2 ml aniline Dung dịch Salkowski R1 FeCl3­12; H2SO4­429 (g hoặc ml/l) B CÁC LOẠI MỒI DÙNG TRONG LUẬN VĂN Cặp mồi dùng trong phản ứng khuếch đại đoạn 16S rDNA 27F: 5'­AGAGTTTGATCCTGGCTCAG­3' 1525R: 5'­AAAGGAGGTGATCCAGCC­3' Các mồi dùng trong phản ứng cho đọc trình tự đoạn 16S rDNA 66 27F:        5'­AGAGTTTGATCCTGGCTCAG­3' 1525R:    5'­AAAGGAGGTGATCCAGCC­3' 780F:       5'­GAATTGATACCCTGGTAG­3 350R:       5'­CTGCTGCCTCCCGTAG­3' 1100F:     5'­GCAACGAGCGCAACCC­3' 920R:      5'­GTCAATTCCTTTGAGTTT­3' Các mồi dùng phương pháp phân tích trình tự đa gen gyrA ­ 42F: 5'­CAGTCAGGAAATGCGTACGTCCTT­3' gyrA ­ 1066R: 5'­CAAGGTAATGCTCCAGGCATTGCT­3' rpoB ­ 2292F:  5'­GACGTGGGATGGCTACAACT­3' rpoB ­ 3354R:  5'­ATTGTCGCCTTTAACGATGG­3' purH ­ 70F:  5'­ACAGAGCTTGGCGTTGAAGT­3' purH ­ 1013R:  5'­GCTTCTTGGCTGAATGAAGG­3' polC ­ 1505F:  5'­TTGTCGCTCAYAATGCAAGC­3' polC ­ 2337R:  5'­YTCAAGCATTTCRTCTGTCG­3' groEL ­ 550F:  5'­GAGCTTGAAGTKGTTGAAGG­3' groEL ­ 1497R:  5'­TGAGCGTGTWACTTTTGTWG­3' DANH SÁCH BẢNG C Bảng 1.  Các enzyme ngoại bào, môi trường khuếch tán và thuốc thử  tương  ứng Enzyme Môi trường Thuốc thử Amylase NA + 0,1% tinh bột tan Lugo CMCase NA + 0,1% CMC Lugo Xylanase NA + 0,1% xylan Đỏ Congo Lipase NA + 0,1% tributyrin Không cần thuốc thử Protease NA + 0,1% casein Axít acetic 2% Phytase NA + 0,1% natri phytate Jorquera và cộng sự (2010) Bảng 2. Các loại mơi trường dùng nghiên cứu Stt 67 Loại mơi trường Mơi trường khống + 0.5% D­glucose + 0.5% cơ chất tinh bột  tan Mơi trường khống + 0.5% D­glucose + 0.5% cơ chất casein Mơi trường khống + 0.5% D­glucose + 0.5% cơ chất CMC Mơi trường khống + 0.5% D­glucose + 0.5% cơ chất xylan Mơi trường khống + 0.5% D­glucose + 0.5% cơ chất chitin Mơi trường khống + 0.5% D­glucose + 0.5% cơ chất tributyrin Mơi trường khống + 0.5% D­glucose + 0.5% cơ chất pectin Mơi trường khống + 0.5% D­glucose + 0.5% cơ chất tổng hợp Mơi trường NA dịch thể 10 Mơi trường khống + 1% D­glucose Bảng 3. Nồng độ bão hòa của ammonim sulfate [44] 68 69 Bảng 4. Các loại đệm dùng trong thí nghiệm xác định đặc tính enzyme Đệm citrate phosphate Dung dịch A: Citrate axít 0,1 M Dung dịch B: Sodium phosphate 0,2 M A (ml) B (ml) Nước (ml) pH 3,98 1,02 3,07 1,93 2,43 2,57 5 1,79 3,21 0,65 4,36 Đệm Tris­HCl Dung dịch C: Tris­HCl 0,2 M Dung dịch D: HCl 0,2 M C (ml) D (ml) Nước (ml) pH 2,5 1,34 6,16 2,5 0,25 7,25 Bảng 5. Các ion kim loại và hóa chất dùng trong thí nghiệm xác định đặc tính  enzyme Stt Ion kim loại Hóa chất KLPT mg/10 ml (200 mM) Na+ NaCl 58,5 117 K+ KCl 74,5 149 Mg2+ MgCl2 95 190 Mn2+ MnSO4.H2O 169 338 Ca2+ CaCl2 111 222 Cu2+ CuSO4 160 320 Fe2+ FeSO4.7H2O 278 556 Fe3+ FeCl3.6H2O 270 540 Zn2+ ZnSO4.7H2O 287,5 575 10 EDTA 292 584 11 SDS 288 576 70 12 71 ß­mecaptoethanol 78 156 ...ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN ­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­ Phan Lạc Dũng NGHIÊN CỨU CÁC ĐẶC TÍNH SINH HỌC VÀ TIỀM NĂNG ỨNG DỤNG CỦA CHỦNG VI KHUẨN BACILLUS   AMYLOLIQUEFACIENS ... Nhằm góp phần tìm hiểu thêm kiến thức về chi Bacillus nói chung và ứng dụng của các lồi thuộc nhóm B. subtilis nói riêng, chúng tơi tiến hành đề tài: Nghiên cứu các đặc tính sinh học và tiềm năng ứng dụng của chủng   vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens ... DỤNG CỦA CHỦNG VI KHUẨN BACILLUS   AMYLOLIQUEFACIENS SUBSP. PLANTARUM SP 1901 PHÂN LẬP TẠI RỪNG QUỐC GIA HỒNG LIÊN Chun ngành: Vi sinh vật học Mã số: 60 42 40 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC                                                             NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC

Ngày đăng: 17/01/2020, 04:06

TỪ KHÓA LIÊN QUAN

TÀI LIỆU CÙNG NGƯỜI DÙNG

TÀI LIỆU LIÊN QUAN

w