Nghiên cứu các đặc điểm sinh học và khả năng sinh tổng hợp enzym endolysin có hoạt lực diệt vi khuẩn staphylococcus aureus của dòng thực khuẩn thể NA6

VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC - KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Đề tài: NGHIÊN CỨU CÁC ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC VÀ KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP ENZYM ENDOLYSIN CÓ HOẠT LỰC DIỆT VI KHUẨN STAPHYLOCOCCUS AUREUS CỦA DÒNG THỰC KHUẨN THỂ NA6” Người hướng dẫn : ThS Nguyễn Thị Hồng Hải Sinh viên thực : Nguyễn Thị Dung Lớp : CNSH 13-02 Hà Nội - 2017 Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội LỜI CẢM ƠN Để hồn thành khóa luận này, tơi xin tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến ThS Nguyễn Thị Hồng Hải, tồn thể cán Bộ mơn Vi sinh – Viện Di truyền Nơng nghiệp tận tình hướng dẫn thời gian thực tập Bộ môn giúp đỡ tơi hồn thành khóa luận tốt nghiệp Tơi xin chân thành cảm ơn quý Thầy, Cô khoa Công Nghệ sinh học, Viện Đại Học Mở Hà Nội tận tình truyền đạt kiến thức năm học tập Với vốn kiến thức tiếp thu q trình học khơng tảng cho q trình nghiên cứu khóa luận mà hành trang q báu để tơi bước vào đời cách vững tự tin Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình bạn bè, người cạnh tôi, động viên giúp đỡ suốt thời gian qua Cuối tơi kính chúc q Thầy, Cơ dồi sức khỏe thành công nghiệp cao quý Đồng kính chúc Cơ, Chú, Anh, Chị Bộ mơn Vi sinh – Viện Di truyền Nông nghiệp dồi sức khỏe, đạt nhiều thành công tốt đẹp công việc Hà Nội, ngày 10 tháng năm 2017 Sinh viên Nguyễn Thị Dung Sinh viên: Nguyễn Thị Dung Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội MỤC LỤC LỜI MỞ ĐẦU PHẦN I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1.Khái quát chung tình hình ngộ độc thực phẩm 1.1.1 Tình hình ngộ độc thực phẩm giới 1.1.2 Tình hình ngộ độc thực phẩm Việt Nam 1.2 Vi sinh vật gây bệnh Staphylococcus aureus 1.2.1 Giới thiệu Staphylococcus 1.2.2 Staphylococcus aureus 1.2.2.1 Hình thái, đặc điểm sinh hóa 1.2.2.2 Điều kiện tăng trưởng phân bố 11 1.2.2.3 Tính kháng thuốc kháng sinh 12 1.2.2.4 Các yếu tố độc lực Staphylococcus aureus 13 1.2.2.5 Các yếu tố chống lại tự vệ tế bào chủ 14 1.2.2.6 Khả gây bệnh 15 1.2.2.7 Ngộ độc thực phẩm Staphylococcus aureus 16 1.2.3 Độc tố ruột enterotoxin Staphylococcus aureus 16 1.2.3.1 Đặc điểm 16 1.2.3.2 Tính chất 17 1.2.3.3 Phân loại 17 1.2.3.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến phát triển việc tạo độc tố SE Staphylococcus aureus 18 1.2.3.5 Những hoạt tính độc tố SE 19 1.2.3.6 Tần suất Staphylococcus aureus mang gen sinh độc tố 20 Sinh viên: Nguyễn Thị Dung Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội 1.3 Tổng quan enzym endolysin 21 1.3.1 Giới thiệu enzym endolysin 21 1.3.1.1 Khái niệm 21 1.3.1.2 Cấu tạo 21 1.3.1.3 Tính chất endolysin 22 1.3.2.4 Vai trò ứng dụng 24 1.3.3 Tổng hợp nhân tạo endolysin kháng khuẩn 24 1.3.4 Ứng dụng endolysin công nghệ sinh học thực phẩm 26 1.4 Ảnh hưởng điều kiện nuôi cấy đến khả sinh enzym endolysin 28 1.4.1 Ảnh hưởng môi trường nuôi cấy 28 1.4.2 Ảnh hưởng nhiệt độ nuôi cấy 28 1.4.3 Ảnh hưởng pH 29 PHẦN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 30 2.1 Vật liệu 30 2.2 Hóa chất thiết bị 30 2.3 Phương pháp nghiên cứu 30 2.3.1 Các môi trường nuôi cấy chủ yếu 30 2.3.2 Phương pháp nghiên cứu 31 2.3.2.1 Phương pháp đánh giá hoạt tính kháng khuẩn thực khuẩn thể (theo Stephen, 2009) 31 2.3.2.2 Phương pháp phân tách thực khuẩn thể 32 2.3.2.3 Phương pháp nhận dạng dòng thực khuẩn thể 32 Sinh viên: Nguyễn Thị Dung Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội 2.3.2.4 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng nhiệt độ nuôi cấy, thành phần môi trường tới phát triển hoạt tính dòng thực khuẩn thể NA6 33 PHẦN III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 35 3.1 Kết đánh giá hoạt tính kháng khuẩn gây bệnh Staphylococcus aureus dòng thực khuẩn thể NA6 35 3.1.1 Nguồn gốc hình thái dòng thực khuẩn thể NA6 35 3.1.2 Đánh giá hoạt tính kháng vi khuẩn gây bệnh Staphylococcus aureus dòng thực khuẩn thể NA6 36 3.2 Xác định nguồn sinh enzym endolysin có khả ức chế vi khuẩn gây bệnh Staphylococus aureus dòng thực khuẩn thể NA6 37 3.2.1 Đánh giá khả kháng số vi khuẩn gây bệnh dòng thực khuẩn thể NA6 38 3.2.2 Xác minh endolysin qua khả kháng endolysin dòng TKT NA6 39 3.2.3 Phân loại thực khuẩn thể NA6 39 3.3 Nghiên cứu ảnh hưởng pH, nhiệt độ đến phát triển hoạt tính dòng thực khuẩn thể NA6 42 3.3.1 Ảnh hưởng nhiệt độ 42 3.3.2 Ảnh hưởng pH 44 3.3.3 Ảnh hưởng nguồn cacbon nitơ 45 3.3.3.1 Ảnh hưởng nguồn cacbon 45 3.3.3.2 Ảnh hưởng nguồn Nitơ 46 PHẦN IV: KẾT LUẬN 48 TÀI LIỆU THAM KHẢO 49 Sinh viên: Nguyễn Thị Dung Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội DANH MỤC BẢNG Bảng 1: Những đặc tính S aureus, S epidermidis Micrococci 11 Bảng 2: Các đặc điểm endolysin để ứng dụng thực phẩm 23 Bảng 3: Đường kính vòng phân giải vi khuẩn S aureus dòng thực khuẩn thể NA6 36 Bảng 4: Kiểm tra khả kháng số vi khuẩn gây bệnh dòng thực khuẩn thể NA6 38 Bảng 5: Xác minh endolysin qua khả kháng endolysin NA6 39 Bảng 6: Độ tương đồng đoạn gen dòng thực khuẩn thể NA6 41 Bảng 7: Ảnh hưởng nhiệt độ đến phát triển hoạt tính dòng TKT NA6 42 Bảng 8: Ảnh hưởng pH đến phát triển hoạt tính dòng TKT NA6 44 Bảng 9: Sự phát triển hoạt tính TKT NA6 nguồn cacbon khác 45 Bảng 10: Ảnh hưởng nguồn Nitơ đến phát triển hoạt tính dòng thực khuẩn thể NA6 Sinh viên: Nguyễn Thị Dung 46 Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội DANH MỤC HÌNH Hình 1: Hình thái Staphylococcus aureus Hình 2: Tụ cầu Staphylococcus aureus gram dương kính hiển vi Hình 3: Các yếu tố độc lực Staphylococcus aureus 13 Hình 4: Cấu trúc điển hình vách peptidoglycan vi khuẩn Gram dương 22 Hình 5: Hình dạng khuẩn lạc vi khuẩn Staphylococcus aureus 35 Hình 6: Hoạt tính đối kháng với vi khuẩn gây bệnh S aureus dòng thực khuẩn thể NA6 37 Hình 7: Khả ức chế vi khuẩn S.aureus TKT NA6 ni 350C 43 Hình 8: Khả phát triển ức chế vi khuẩn gây bệnh S.aureus dòng TKT NA6 mơi trường TSB có bổ sung 0,5% lactose Sinh viên: Nguyễn Thị Dung 46 Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội LỜI MỞ ĐẦU Hiện ngộ độc thực phẩm mối lo ngại nghiêm trọng cho sức khỏe cộng đồng toàn giới Nguyên nhân người sử dụng loại thực phẩm bị nhiễm loài vi khuẩn gây bệnh hay độc tố chúng Mặc dù có cơng nghệ đại, phương pháp thực hành sản xuất tốt (GMP), kiểm soát chất lượng vệ sinh an toàn sản xuất đánh giá rủi ro (HACCP), số lượng trường hợp bị ngộ độc bị bệnh thực phẩm tăng lên suốt thập kỷ qua Ở châu Âu, năm ước tính có 380.000 người dân bị bệnh sử dụng sản phẩm thực phẩm nhiễm vi khuẩn, loại vi khuẩn gây bệnh như: Staphylococcus aureus, Salmonella Listeria [16] Staphylococcus aureus tác nhân phổ biến gây nhiễm trùng bệnh viện cộng đồng dân cư với tỷ lệ mắc tử vong cao toàn giới S aureus nhiễm độc thức ăn, đồ uống tiếp xúc người mang mầm bệnh dẫn đến viêm ruột cấp thức ăn có chứa độc tố ruột S aureus, gây nước điện giải dẫn tới sốc S aureus nguyên nhân hàng đầu gây nhiễm khuẩn bệnh viện, chủng S aureus gây nhiễm khuẩn bệnh viện thường có khả kháng lại nhiều kháng sinh S.aureus gây hội chứng sốc nhiễm độc tiết độc tố gây sốc Theo số quan quản lý thực phẩm châu Âu, vi sinh vật gây bệnh phổ biến có nguồn gốc từ thực phẩm bao gồm Salmonella, Escherichia coli O157:H7, S aureus Listeria với số loài khác Sử dụng chất hóa học để bảo quản thực phẩm chấp nhận nhiều chất bảo quản hóa học làm ảnh hưởng lâu dài tới sức khỏe cộng đồng Trong số chất bảo quản sinh học biết nay, endolysin thu hút quan tâm nhà khoa học có khả diệt ức chế vi sinh vật gây bệnh Sinh viên: Nguyễn Thị Dung Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội Endolysins (hay tên gọi khác lysins) enzym thủy phân có nguồn gốc từ thực khuẩn thể (bacteriophage) có tác dụng phá hủy peptidoglycan thành tế bào vi khuẩn giai đoạn cuối chu trình sinh sản thực khuẩn thể Các enzyme làm giảm độ mạnh học thành tế bào dẫn đến dung giải tế bào giải phóng thực khuẩn thể hệ Do có mặt endolysins chúng phân hủy lớp peptidoglycan thành tế bào vi sinh vật chúng tiếp xúc, dẫn đến vi sinh vật bị chết, chúng coi chất kháng sinh thực phẩm có tính tác động chọn lọc, khơng thay đổi đặc điểm cảm quan, kết cấu thực phẩm an toàn cho người Xuất phát từ lý tiến hành thực đề tài: “Nghiên cứu đặc điểm sinh học khả sinh tổng hợp enzym endolysin có hoạt lực diệt vi khuẩn Staphylococcus aureus dòng thực khuẩn thể NA6” MỤC ĐÍCH CỦA ĐỀ TÀI: Nghiên cứu đặc điểm sinh học khả sinh tổng hợp enzym endolysin để dòng thực khuẩn thể NA6 có hoạt lực diệt vi khuẩn gây bệnh Staphylococcus aureus cao NỘI DUNG NGHIÊN CỨU: Đánh giá hoạt tính kháng vi khuẩn gây bệnh S aureus dòng thực khuẩn thể NA6 Nghiên cứu đặc điểm sinh học dòng thực khuẩn thể NA6 Ảnh hưởng loại mơi trường ni cấy (nguồn carbon, nitơ, muối khống ) đến khả sinh tổng hợp enzym endolysin hoạt tính kháng khuẩn dòng thực khuẩn thể NA6 Ảnh hưởng pH, nhiệt độ đến phát triển hoạt tính dòng thực khuẩn thể NA6 Sinh viên: Nguyễn Thị Dung Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội PHẦN I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Khái quát chung tình hình ngộ độc thực phẩm 1.1.1 Tình hình ngộ độc thực phẩm giới Từ năm 1973 đến năm 1987, theo thống kê Cơ quan Kiểm soát bệnh tật (Centers for Disease Control: CDC) Atlanta (Hoa Kỳ), ước tính có khoảng 500 trận dịch bệnh thức ăn gây nên, ảnh hưởng trung bình khoảng 16.000 người năm Tuy nhiên, số chưa đánh giá cách đầy đủ, chưa phản ánh thật tầm quan trọng vấn đề Tỉ lệ mắc bệnh hàng năm khơng rõ, theo thống kê quan y tế Hoa Kỳ, riêng Hoa Kỳ, ước tính có khoảng 6.500.000 đến 81.000.000 lượt bệnh năm Ở Á châu, nhiều trận dịch ngộ độc thức ăn gần ghi nhận Nhật điều làm cho nhiều quốc gia khác phải lo ngại Từ tháng đến tháng năm 2010, biến cố ngộ độc vi khuẩn E.coli nhiễm từ cải Romaine lettuce xảy Michigan, New York, Tennessee Pennsylvania, Hoa Kỳ Thủ phạm chủng E.coli mới, E.coli 0145 Đây chủng loại thấy nên nhà khoa học quan tâm đến E.coli 0145 gây bệnh tương tự E.coli 0157:H7 Biến cố làm cho vài chục người ngã bệnh Vào trung tuần tháng năm 2011, Châu Âu chấn động dịch bệnh ngộ độc thực phẩm E.coli 0104, chủng làm hủy hoại xuất huyết niêm mạc ruột Enterohemorrhagic E.coli EHEC Đây loại thấy từ xưa Người ta nghi nguồn lây nhiễm từ dưa leo hữu organic sản xuất từ vùng Almeria Malaga, thuộc Tây Ban Nha nhập vào quốc gia Châu Âu Tính đến 30/5/2011, Đức quốc gia bị nặng với gần 400 nguời bệnh có 14 tử vong Đan Mạch có 11 tử vong Ngồi ra, dịch bệnh thấy xuất Thụy Điển, Anh Quốc, Hà Lan… Sinh viên: Nguyễn Thị Dung Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội GTACCTATTACATGGAAGAAAGCGCTCGTTTCACCAACGGTAACCAG CCAATCACCGTTCGTAAAGTTGGTCCGTTTCTGTCTTGCCCGGTTGGT TACCAGTTTCAGCCGGGCGGTTACTGCGATTACACCGAAGTTATGCTG CAGGATGGCCACGTTTGGGTTGGTTACACTTGGGAAGGCCAGCGTTA CTACCTGCCGATTCGTACCTGGAACGGTAGCGCTCCGCCGAACCAGA TCCTGGGTGATCTGTGGGGTGAAATTAGCCTCGAG So sánh trình tự ngân hàng liệu NCBI chương trình BLAST để xác định mức độ tương đồng dòng TKT NA6 Kết cho thấy dòng TKT NA6 có độ tương đồng tới ≥98% với staphylococcal phages như: phi11, phi29 Bảng 6: Độ tương đồng đoạn gen dòng thực khuẩn thể NA6 Dòng TKT NA6 Chiều dài trình tự so sánh (nu) 1357 Dòng bacteriophage tương đồng Mức độ tương đồng (%) Staphylococcal phages phi11 99 Staphylococcal phages phi11 98 Theo liệu NCBI thông tin dòng bacteriophage Staphylococcal phages phi11, Staphylococcal phages phi29 cho thấy dòng phage có hoạt tính kháng vi khuẩn gây bệnh S aureus cao có enzym endolysin Dòng Staphylococcal phages phi11 nghiên cứu tách chiết enzym endolysin tinh khiết enzym có hoạt tính kháng khuẩn S.aureus cao Bên cạnh đó, dòng TKT NA6 có độ tương đồng cao với dòng Staphylococcal phages phi11 Vì vậy, dòng TKT có tiềm ứng dụng vào sản xuất thực tế biện pháp xử lý sinh học Sinh viên: Nguyễn Thị Dung 41 Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội 3.3 Nghiên cứu ảnh hưởng pH, nhiệt độ đến phát triển hoạt tính dòng thực khuẩn thể NA6 Theo nghiên cứu Iriarte ctv., 2007 cho thấy nhiệt độ độ ẩm có ảnh hưởng đến lớn đến tuổi thọ thực khuẩn thể Khi TKT tiếp xúc với cường độ cao ánh sáng mặt trời vào ban ngày giảm mật độ nghiêm trọng vòng vài sau áp dụng điều kiện thực tế Thử nghiệm Ignoffo ctv dải pH để đánh giá tác động đến tồn thực khuẩn thể cho thấy pH thấp cao có ảnh hưởng tiêu cực đến phát triển TKT Tuy nhiên, nhiệt độ, độ ẩm, pH tương đối khác dòng TKT khác phụ thuộc điều kiện thực thí nghiệm 3.3.1 Ảnh hưởng nhiệt độ Dòng thực khuẩn thể NA6 vi khuẩn S aureus nuôi lắc môi trường TSA lỏng nhiệt độ khác nhau: 250 C, 300C, 350C, 400C, 450C, tốc độ lắc 200 vòng/phút Quan sát dịch lỏng đánh giá mật độ thực khuẩn thể sau 24h nuôi cấy Bảng Ảnh hưởng nhiệt độ đến phát triển hoạt tính dòng TKT NA6 Nhiệt độ Mật độ TKT (pfu/ml) Mật độ vi khuẩn S.aureus (OD600nm) CTTN Đối chứng 25 5,3x108 1,8 5,3 30 2,9x109 1,3 6,8 35 5,5x1010 0,7 7,2 40 8,1x109 1,2 6,7 45 2,5x107 2,0 4,9 Sinh viên: Nguyễn Thị Dung 42 Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội Theo kết bảng cho thấy, ngưỡng nhiệt độ từ 30-350C thích hợp cho sinh trưởng hoạt lực dòng TKT NA6 Nhiệt độ tối ưu 350C Ở ngưỡng nhiệt độ thấp 200C cao 450C sinh trưởng hoạt lực TKT NA6 giảm đáng kể Các nghiên cứu thực khuẩn thể độc lực cho thấy thực khuẩn thể nhân lên ký sinh vào tế bào vi khuẩn Đầu tiên thực khuẩn thể (phage) phải tìm thấy chỗ tiếp nhận đặc hiệu bề mặt tế bào vi khuẩn, sau enzym cuối phage làm tan tế bào vi khuẩn co bóp đẩy nhân chứa AND phage vào tế bào vi khuẩn Vỏ capsid lại vi khuẩn Sau 2-3 phút, enzyme deoxyribonuclease phage xuất phá hủy ADN tế bào vi khuẩn, mARN kèm theo hàng loạt enzym cần thiết cho phage tổng hợp ADN phage hình thành với protein (tạo vỏ capsid) phage tổng hợp ribosome tế bào chủ Các thành phần ADN lắp ghép với protein tạo thành phage Các phage hình thành sau thời gian khoảng 12 phút giải phóng phage thường xảy phút thứ 25 Trung bình vi khuẩn giải phóng từ 100 đến vài trăm phage Các thực khuẩn thể vừa giải phóng lại tìm đến ký sinh vào tế bào vi khuẩn khác trình tổng hợp phage lại diễn trên, vi khuẩn lại bị tiêu diệt Hình Khả ức chế vi khuẩn S.aureus TKT NA6 nuôi 350C Sinh viên: Nguyễn Thị Dung 43 Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội Theo hình cho thấy, kết nghiên cứu phù hợp với nghiên cứu thực khuẩn thể độc lực Trong môi trường lỏng có vi khuẩn phát triển, cho vào thực khuẩn thể tương ứng mơi trường vốn đục ngầu vi khuẩn trở thành suốt sau vài 3.3.2 Ảnh hưởng pH Dòng thực khuẩn thể NA6 nuôi cấy môi trường TSB nhiệt độ 350C dải pH khác nhau, nuôi lắc 200 vòng/phút 24 quan sát dịch lỏng đánh giá mật độ thực khuẩn thể Kết trình bày bảng Bảng Ảnh hưởng pH đến phát triển hoạt tính dòng TKT NA6 pH Mật độ TKT (pfu/ml) Mật độ vi khuẩn S.aureus (OD600nm) CTTN Đối chứng 1,8x107 1,5 5,1 6,3x108 1,6 7,1 2,7x1010 0,7 7,9 2,9x109 0,9 7,3 8,5x106 1,9 5,2 Dòng thực khuẩn thể NA6 thích hợp với khoảng pH từ trung tính đến kiềm pH tối ưu cho sinh trưởng thực khuẩn thể pH = 7,0, khả ức chế thu đạt kết cao cơng thức lại Mặt khác, khoảng pH khảo sát, dòng thực khuẩn thể sinh trưởng cho khẳ ức chế tốt, điều chứng tỏ dòng thực khuẩn thể có độc tính cao thích nghi với điều kiện pH khác Sinh viên: Nguyễn Thị Dung 44 Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội 3.3.3 Ảnh hưởng nguồn cacbon nitơ 3.3.3.1 Ảnh hưởng nguồn cacbon Bảng Sự phát triển hoạt tính TKT NA6 nguồn cacbon khác Nguồn cacbon Mật độ TKT (pfu/ml) Mật độ vi khuẩn S.aureus (OD600nm) CTTN Đối chứng Glucose 3,2x1010 0,8 7,1 Sachacose 5,7x108 2,1 6,5 Fuctose 2x108 1,7 6,3 Maltose 4,9x107 1,9 6,9 Lactose 6,1x109 1,2 6,9 Dựa vào nghiên cứu trước, môi trường TSA sử dụng môi trường bản, có bổ sung 0,5% nguồn cacbon khác để ni cấy dòng TKT NA6 Kết cho thấy nguồn carbon khảo sát, glucose lactose nguồn cacbon phù hợp cho sinh trưởng khả ức chế vi khuẩn gây bệnh cao Sinh viên: Nguyễn Thị Dung 45 Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội Hình 8: Khả phát triển ức chế vi khuẩn gây bệnh S.aureus dòng TKT NA6 mơi trường TSA có bổ sung 0,5% lactose 3.3.3.2 Ảnh hưởng nguồn Nitơ Bảng 10 Ảnh hưởng nguồn Nitơ đến phát triển hoạt tính dòng thực khuẩn thể NA6 Nguồn nitơ Mật độ TKT (pfu/ml) Mật độ vi khuẩn S.aureus (OD600nm) CTTN Đối chứng Trypton 5,9x109 0,6 7,3 Cao thịt bò 2,6x1010 3,1 7,1 Casein 7,1x108 2,3 6,8 Soyton 4,3x107 2,9 6,1 Kết thu bảng 10 cho thấy, với TSA môi trường nuôi cấy bổ sung nguồn nitơ khác nhau, sau 24h nhân ni, mơi Sinh viên: Nguyễn Thị Dung 46 Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội trường có bổ sung cao thịt bò mật độ thực khuẩn thể cao Tuy nhiên khả ức chế vi khuẩn S.aureus lại so với trypton Với nguồn nitơ casein soyton cho mật độ TKT khă ức chế vi khuẩn không cao trypton cao thịt bò Vì vậy, ni TKT mơi trường TSA có bổ sung 0,5% trypton tốt so với nguồn nitơ khác Sinh viên: Nguyễn Thị Dung 47 Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội PHẦN IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận Dòng thực khuẩn thể NA6 có khả ức chế vi khuẩn gây S.aureus cao môi trường thạch đĩa sau 48 nuôi cấy Ngoài khả ức chế vi khuẩn chủ (S.aureus), dòng NA6 có khả ức chế vi khuẩn gây bệnh Listeria monocytogenes Xác định yếu tố ảnh hưởng tới đến phát triển hoạt tính dòng thực khuẩn thể NA6 - Nhiệt độ tối ưu: 35-40oC - pH tối ưu: - Nguồn cacbon tối ưu glucose - Nguồn nitơ tối ưu trypton Giải trình tự gen dòng thực khuẩn thể NA6 so sánh NCBI chương trình BLAST để xác định mức độ tương đồng dòng TKT NA6 Kết cho thấy dòng TKT NA6 có độ tương đồng tới ≥98% với staphylococcal phages như: phi11, phi29 4.2 Kiến nghị Được tiếp tục nghiên cứu dòng TKT NA6 để tách tinh khiết enzym endolysin, ứng dụng bảo quản sữa bảo quản thực phẩm Sinh viên: Nguyễn Thị Dung 48 Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu nước Lê Huy Chính (2001), Vi sinh y học, Nhà xuất Y học, Hà Nội Bùi Thế Hiền, Tô Thị Thu Cộng (2005), Tình hình nhiễm thực phẩm vi sinh vật hai xã huyện Kiến Xương tỉnh Thái Bình năm 2001, Trung tâm y tế dự phòng Thái Bình, Thơng tin khoa học, Cục an tồn vệ sinh thực phẩm, 2005 Nguyễn Đỗ Phúc, Nguyễn Thị Kê, Trần Linh Thước (2006), Mối tương quan đậm độ khả sinh độc tố ruột (enterotoxin) S aureus hai môi trường nuôi cấy TSGM BHI, Y học Thành phố Hồ Chí Minh, số đặc biệt chuyên đề Y tế công cộng Y học dự phòng, phụ tập 10, (số 4), tr 412-417 Nguyễn Thị Kê, Nguyễn Xuân Mai, Nguyễn Đỗ Phúc, Hoàng Hoài Phương, Bùi Thị Kiều Nương, Nguyễn Trần Chính, Cao Minh Nga, Cao Ngọc Nga, (2006), Khảo sát tính chất kháng kháng sinh số chủng vi sinh vật lấy qua đường tiêu hóa, Y học Thành phố Hồ Chí Minh, số đặc biệt chuyên đề Y tế cơng cộng Y học dự phòng, phụ tập 10 (số 4), tr 406-411 Trần Linh Thước (2002), Phương pháp phân tích vi sinh vật nước, thực phẩm mỹ phẩm Nxb Giáo dục 230 trang Tài liệu nước Borysowski, J., Weber-Dabrowska, B., & Gorski, A (2006) Bacteriophage endolysins as a novel class of antibacterial agents Experimental Biology Medicine (Maywood), 231, 366-377 Braga, L.C., Shupp, J.W., Cummings, C., Jett M., Takahashi, J.A., Carmo, L.S., Chartone-Souza E and Nascimento, M.A., (2004) Pomegranate extract Sinh viên: Nguyễn Thị Dung 49 Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội inhibits Staphylococcus aureus grow than dsubse quententero toxin production Journal of Ethnopharmacology 96 pp.335-339 Bremer, P J., Fletcher G C., and Osbome, C., (2004) Staphylococcus aureus, Nee Zealand Institute for Crop and Food Research