một số phương pháp phân loại vi khuẩn dựa trên cấu trúc adn và những ứng dụng trong nghiên cứu vi khuẩn Haemophilus influenzae

ĐẶT VẤN ĐỀ Sự bùng nổ của các bệnh nhiễm trùng thường do kết quả của tình trạng phơi nhiễm với nguồn lõy. Nhìn chung, những căn nguyên gõy ra sự bùng nổ của bệnh nhiễm trùng hay bắt nguồn từ một loại tế bào vi sinh vật riêng lẻ. Vì vậy, các thế hệ sau của chúng giống nhau về gen hoặc có quan hệ gần với vi sinh vật bắt nguồn gõy bệnh (source organism). Trong nghiên cứu về các giai đoạn dịch tễ học, những vi sinh vật có liên quan đến sự bùng nổ dịch đều có mối liên quan về dòng tế bào, tức là có nguồn gốc chung. Vi sinh vật có liên quan về dòng tế bào, là thành viên của cùng một loài giống nhau nên có chung yếu tố độc lực, những đặc điểm sinh hóa và đặc điểm về gen. Tuy nhiên, nếu những chủng vi sinh vật được phõn lập từ các nguồn khác nhau ở thời điểm và địa lý khác nhau thì có thể đủ sự khác biệt ở mức độ loài hoặc phõn loại dưới typ (subtype) hay chủng (strain). Quy trình phõn loại dưới typ rất quan trọng trong dịch tễ học để xác định sự bùng nổ của các bệnh nhiễm trùng, phát hiện sự lõy truyền chéo của các nguồn bệnh trong bệnh viện, xác định nguồn gốc của nhiễm trùng, phát hiện những chủng vi sinh vật độc lực cụ thể và kiểm soát chương trình tiêm chủng vacxin [32]. Phõn loại dưới loài (subtyping) hoặc phõn loại các chủng đã được thực hiện bởi nhiều phương pháp khác nhau, những phương pháp này phải có khả năng đưa ra tiêu chuẩn chung để dễ dàng sử dụng rộng rói. Trong phõn loại dưới loài, tất cả các vi khuẩn trong một loài phải được phõn loại bởi nhiều phương pháp khác nhau đã được sử dụng. Tuy nhiên, với những phương pháp phõn loại dựa theo đặc điểm kiểu hình (phenotype), chẳng hạn như: phương pháp dựa vào phản ứng kháng nguyên – kháng thể hoặc sự xuất hiện receptor của bacteriophage hoặc bằng các đặc điểm sinh học cụ thể không xuất hiện ở tất cả những chủng vi khuẩn trong cùng một loài. Typ huyết thanh (serotype) 1 có thể chỉ xác định được bằng sự xuất hiện của dấu ấn huyết thanh học (serological marker). Ví dụ: 10 – 15% chủng Mycobacterium avium không có khả năng định typ huyết thanh bởi vì những chủng này không ngưng kết với bất kỳ kháng huyết thanh mẫu. Tương tự, phương pháp phõn loại theo bacteriopgage thường được áp dụng để đánh giá đặc điểm của Staphylococcus aureus, trong đó một số chủng S. aureus phõn lập được thiếu receptor của bacteriophage, do đó không thể phõn được loại theo phương pháp này [25]. Một số phương pháp phõn loại dưới loài có khả năng phõn biệt (differentiation power) cao nên phõn loại rừ ràng được các chủng vi khuẩn không có mối liên quan với nhau, chẳng hạn do sự khác biệt về địa lý và nguồn gõy nhiễm trùng [36]. Vấn đề rất quan trọng đối với những phương pháp phõn loại dưới loài là phải có độ tái lặp (reproducibility) [36]. Độ tái lặp của một kỹ thuật là khả năng tạo ra những kết quả lặp lại giống nhau với một chủng cụ thể sau nhiều lần thực hiện. Độ tái lặp đặc biệt quan trọng để giải thích cơ sở số liệu một cách tin cậy trong phõn loại vi khuẩn, bao gồm các chủng chưa biết trong cùng một loài hay đối với những chủng chưa biết rừ loài đều có thể được so sánh để phõn loại. Phối hợp với những phương pháp xác định sự khác nhau của đặc điểm kiểu hình (phenotypic characteristics), cũng như sự biểu hiện lác đác (sporadic) của các gen độc lực hoặc đặc điểm kháng nguyên cũng có thể góp phần vào việc nõng cao mức đánh giá độ tái lặp [36]. Nhiều kỹ thuật sinh học phõn tử được dùng hiện nay để phõn loại (genotype) vi khuẩn dựa trên phõn tích các đoạn ADN với những độ dài khác nhau trên thạch điện di, kết quả được thể hiện bởi tớnh đa dạng của các mẫu (pattern) băng (band) điện di trên thạch (gel). Mỗi mẫu băng này rất phức tạp, do đó để thuận tiện cho phõn tích các mẫu băng cần phải dựa trên cơ sở giải thích và xác định mối liên hệ. Đõy là một yếu tố hữu ích trong đánh giá từng 2 phương pháp phõn loại cụ thể [25][36]. Vì vậy, cùng với việc đánh giá mức độ thuận tiện của những phương pháp phõn loại cụ thể, khả năng giải thích kết quả và sự thuận tiện trong tiến hành kỹ thuật cũng rất quan trọng. Những khó khăn về kỹ thuật, giá cả và thời gian thực hiện cũng phải được đánh giá trong việc lựa chọn của mỗi phương pháp phõn loại cụ thể [24][36]. Nhược điểm của phương pháp phõn loại dựa trên kiểu hình là nguồn gốc cho sự phát triển của các phương pháp phõn loại dựa trên kiểu gen hoặc trình tự ADN. Những phương pháp phõn loại dựa trên cấu trúc ADN có khả năng giảm tối đa hạn chế có liên quan đến khả năng phõn loại (typeability) và độ tái lặp (reproducibility). Ngoài ra, trong một số trường hợp những phương pháp phõn loại dựa vào cấu trúc ADN có thể thiết lập được một số lượng lớn cơ sở dữ liệu về đặc điểm của các vi khuẩn. Vì vậy, tôi thực hiện chuyên đề: "Một số phương pháp phõn loại vi khuẩn dựa trên cấu trúc ADN và những ứng dụng trong nghiên cứu vi khuẩn Haemophilus influenzae" nhằm giải quyết 2 mục tiêu: 1. Xác định nguyên lý, ứng dụng của một số phương pháp phõn loại vi khuẩn dựa trên cấu trúc ADN và so sánh ưu điểm, nhược điểm của từng phương pháp. 2. Ứng dụng của các phương pháp phõn loại sinh học phõn tử trong nghiên cứu vi khuẩn Haemophilus influenzae. 3 Chương I NGUYÊN LÝ VÀ ỨNG DỤNG CỦA MỘT SỐ KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ TRONG PHÂN LOẠI CÁC CHỦNG VI KHUẨN 1.1. Nguyên lý và ứng dụng của một số kỹ thuật sinh học phân tử sử dụng trong phân loại vi khuẩn 1.1.1. PFGE (Pulsed Field Gel Electrophoresis): Kỹ thuật điện di trong trường xung điện (điện di trong trường điện thay đổi) [1], [2], [3], [25], [35] PFGE (Pulsed Field Gel Electrophoresis) thường được xem là "tiêu chuẩn vàng - gold standard" của các phương pháp sinh học phõn tử dùng trong phõn loại vi khuẩn. Đối với kỹ thuật PFGE, các chủng vi khuẩn nghiên cứu được nuôi cấy trên môi trường lỏng hoặc môi trường thạch, sau đó sẽ hòa vi khuẩn vào thạch agarose lỏng rồi đổ vào những khuôn nhỏ (small molds), kết quả miếng thạch sau khi đổ được cắt và tạo ra các nút thạch (plugs) nhỏ có chứa toàn bộ tế bào vi khuẩn. Vi khuẩn được cố định trong thạch sẽ chịu tác dụng của enzym ly giải tế bào để giải phóng toàn bộ ADN, tiếp theo ADN của vi khuẩn sẽ bị giáng hóa dưới tác dụng phõn cắt tại những vị trí đặc hiệu bởi enzym giới hạn. Các nút thạch (plugs) chứa ADN sau khi đã được phõn cắt được đặt vào những giếng (wells) tương ứng trên khuôn thạch agarose và tiến hành điện di. Trong đó, bộ điện di được đặt với dòng điện thay đổi ở các khoảng được xác định trước sao cho điện trường phải cho phép các đoạn ADN có kích thước lớn khoảng 10 - 800 kb phõn tách rời được với nhau. Mẫu thạch sau điện di sẽ được nhuộm với thuốc nhuộm huỳnh quang như ethidium bromide và quan sát dưới đốn cực tớm (UV light). Kết quả phõn tích ADN trên thạch được chụp ảnh và số liệu có thể được lưu giữ bằng một trong các hệ thống kỹ thuật số thương mại, như sản phẩm của Alpha-Innotech, Bio-Rad, 4 Hitachi hoặc Molecular Dyamics. Phõn tích số liệu có thể được thực hiện bởi sử dụng một số phần mềm thương mại sẵn có ở Applied Math, Bio-Rad, BioSystematics, Bio-numerics, Media Cybernetics hoặc Scanalytics. Bảng 1.1: Tiêu chuẩn phân loại các mức độ liên quan về gen giữa các chủng vi khuẩn của bằng kỹ thuật PFGE [35]. Số đoạn ADN (band) khác nhau Mối liên quan 0 Không thể phân biệt được (Indistinguishabble) 2 - 3 Có mối liên quan gần (Closely related) 4 - 6 Có thể có liên quan (Possbly related) ≥ 7 Khác nhau hoàn toàn (Different) Tenover và cộng sự [35] đã đưa ra một hệ thống tiêu chuẩn để giải thích những mẫu PFGE trong mối tương quan để xác định sự liên quan giữa các chủng vi khuẩn phân lập được. Trong đó, những chủng vi khuẩn này tương ứng sẽ tạo ra các mẫu PFGE hoàn toàn giống nhau được xem là có nguồn gốc từ một chủng (Indistinguishabble). Những chủng vi khuẩn phân lập được khác nhau bởi xảy ra một biến cố về gen, sẽ phản ánh bởi sự khác nhau 2 – 3 băng trên thạch điện di và được xem là có mối liên quan gần (Closely related). Những chủng phân lập được khác nhau bởi 4 – 6 băng trên thạch điện di do xuất hiện 2 biến cố độc lập của gen, được xem là có thể có liên quan với nhau (Possbly related). Những chủng phân lập được khác nhau bởi 6 băng hoặc nhiều hơn trên thạch điện di, do xuất hiện sự thay đổi bởi 3 hoặc nhiều hơn biến cố độc lập của gen, được xem là không có mối liên quan với nhau (Different). Tiờu chuẩn này có thể áp dụng được đối những nghiên 5 cứu ở địa phương nhỏ, trong đó sự khác biệt về gen được xem là có giới hạn (bảng 1.1). Đối với những nghiên cứu lớn, xác định các mẫu băng khác nhau trên thạch điện di của vi khuẩn dựa trên sự phõn cắt phõn tử ADN bởi enzym giới hạn trong kỹ thuật PFGE được chứng minh là tốt hơn so với hầu hết các phương pháp dùng trong phõn loại vi khuẩn dựa trên tớnh chất sinh hóa hay kỹ thuật sinh học phõn tử khác. Kỹ thuật này có độ tách biệt (discriminatory) và độ tái lặp (reproducibility) tốt hơn cả so với các phương pháp khác dùng để phõn loại vi khuẩn, cụ thể, với các loài vi khuẩn: Escherichia coli, Entercocci kháng vancomycin, Staphylococcus aureus, loài Acinetobacter, Pseudomonas aeruginosa và Mycobacterium avium [25]. Ngoài ra, PFGE có hiệu quả hơn đối với khả năng phân biệt (differentiate) các chủng Staphylococcus aureus kháng methicillin so với các phương pháp khác. PFGE cũng có khả năng tách biệt tốt hơn so với kỹ thuật Repetitive Element Sequence-base PCR (Rep – PCR) được dùng để phõn biệt phức hợp Acinetobacter calcoaceticus - Acinetobacter baumannii, Entercocci kháng vancomycin, Neisseria gonnorhoeae và Pseudomonas aeruginosa [25] Hiện nay, với sự giúp đỡ của máy tính và phần mềm phõn tích kết quả điện di trên thạch, PFGE có thể tạo ra ngõn hàng số liệu về những mẫu phõn tớch ADN với hầu hết tất cả các loại vi khuẩn. Vì vậy, những mẫu này có thể tạo ra cơ sở dữ liệu tham khảo, so sánh đối với một số chủng mới để xác định quan hệ phát sinh loài (phylogenetic relationship). Khả năng này được phản ánh bởi một số báo cáo về an toàn thực phẩm, các nghiên cứu đưa ra 2 sự chấp nhận đối với kỹ thuật này, đó là: (I) để nõng cao khả năng giám sát sự bùng nổ ngộ độc thức ăn do vi khuẩn, cần thiết phải thực hiện kỹ thuật ADN fingerprinting (trong đó, PFGE là tiêu chuẩn vàng) để xác định nguồn gốc của yếu tố gõy nhiễm trùng và (II) để thiết lập một mạng lưới giúp cho việc so 6 sánh ADN fingerprinting thuận tiện, cho phép lưu giữ ở những trang web thường trực để chia sẻ số liệu một cách nhanh chóng [25], [32], [36] Tuy nhiên, một trong những yếu tố làm giới hạn việc sử dụng phương pháp PFGE là thời gian có liên quan đến hoàn thành quá trình phõn tích. Mặc dù các bước thực hiện không phức tạp, nhưng thời gian để hoàn thành là 2 đến 3 ngày. Điều này làm giảm khả năng phõn tích một lượng lớn mẫu chủng vi khuẩn. 1.1.2. Kỹ thuật Southern blotting và RFLP (Kỹ thuật đa hình chiều dài các đoạn ADN cắt ngẫu nhiên bới các enzym giới hạn) Southern blotting do Edward Southern phát minh ra năm 1975. Kỹ thuật này đã được sử dụng nhiều năm để phát hiện và xác định sự có mặt một gen (một trình tự gen) nào đó trong bộ gen của tế bào sinh vật Eukaryote và Prokaryote. Để phát hiện gen này, trước hết cần tách chiết ADN bộ gen của tế bào, toàn bộ phõn tử ADN được phõn cắt bởi enzym giới hạn thành các đoạn nhỏ, và các đoạn ADN nhỏ này được phõn tách bởi quá trình điện di trên thạch agarose. Những đoạn ADN sau khi phõn tách sẽ được di chuyển từ thạch agarose tới màng nitrocellulose hoặc nylon bằng kỹ thuật Southern blotting (Gây biến tính ADN trên gel bằng dung dịch kiềm, thông thường là NaOH 0,5N; NaCl 1,5N. Sau đó, chuyển các đoạn ADN từ bản gel lên màng lai bằng sức mao dẫn). Vị trí của các đoạn ADN trên gel được giữ nguyên khi chuyển lên màng lai [1], [2], [3]. Acid nucleic gắn trên màng sau đó được lai với một hoặc nhiều mẫu dò được đánh dấu (labelled probes) có trình tự tương đồng với đoạn gen được nghiên cứu, tạo nên các phõn tử ADN lai (các mẫu dò có thể được đánh dấu với một nửa mẫu dò, bao gồm: chất phóng xạ hoặc cơ chất có màu với hoạt tớnh enzym hoặc cơ chất huỳnh quang với hoạt tớnh enzym). Sau đó, rửa màng lai để loại bỏ các mẫu dò thừa, thấm khô và thực hiện ghi hình phóng xạ bằng phim X-quang với chất đánh dấu là phóng xạ 7 hoặc đo huỳnh quang hay phát hiện sự xuất hiện màu trên màng lai tùy theo phương pháp gắn chất đánh dấu đã được sử dụng. Phương pháp cổ điển trên hiện nay đã được điều chỉnh phù hợp với khả năng phõn biệt các chủng vi khuẩn dựa trên cơ sở quan sát tớnh đa dạng của những băng ADN được tạo ra do sự phõn cắt bởi enzym giới hạn tại những vị trí nhận dạng đặc hiệu trên gen cụ thể từ chủng này tới chủng khác. Kết quả những băng ADN được tạo ra trên thạch sẽ khác nhau về kích thước giữa các chủng vi khuẩn khác nhau. Vì vậy, kỹ thuật với tên RFLP (restriction fragment length polymorphism) ra đời với bản chất xác định sự đa dạng tự nhiên của các vị trí có trình tự đặc hiệu nằm trên gen mà enzym giới hạn có khả năng nhận diện và cắt. Kỹ thuật này tạo nên các đoạn ADN khác nhau được phõn biệt bằng điện di đồ, những đoạn cắt này cũn được gọi là các “dấu võn tay” đặc trưng cho từng phõn tử ADN. Xử lý những mẫu ADN bằng cùng một cặp enzym giới hạn, các bộ gen có cấu trúc khác nhau tạo nên số lượng đoạn cắt có chiều dài khác nhau, cũn những bộ gen hoàn toàn giống nhau tạo nên các đoạn cắt giống nhau. Bản đồ di truyền kết quả RFLP có tớnh chớnh xác cao, thường được sử dụng trong nghiên cứu định loại nguồn gốc và mức độ tiến hóa của các loài sinh vật [1], [2]. Trong kỹ thuật RFLP, chỉ có những đoạn gen (ADN) được lai hóa với mẫu dò mới có thể thấy được qua phõn tích bằng RFLP, điều này làm đơn giản hóa cho quá trình phõn tích các mẫu ADN fingerprinting rất nhiều [25]. Những mẫu dò đặc hiệu với gen đã được sử dụng để phõn loại dưới loài đối với các vi khuẩn như Brucella, Legionella pneumophila và Pseudomonas aeruginosa. Hơn thế nữa, ribotyping, một dạng khác của RFLP – Southern blotting sử dụng những mẫu dò bắt nguồn từ gen rARN 16S và 23S được áp dụng thành công ở nhiều nghiên cứu để phõn biệt các chủng vi khuẩn [25]. Kết quả phõn tích ribotyping chỉ cho một số lượng nhỏ các băng, do đó đơn 8 giản cho phõn tích. Tuy nhiên, điều này cũng hạn chế khả năng của kỹ thuật trong việc phõn biệt giữa các chủng có mối liên quan gần. Tác dụng lên nhiều vị trí gen của kỹ thuật Southern blotting cũng có thể được áp dụng trong các nghiên cứu phõn loại dưới loài của vi khuẩn. Grundmann và cộng sự [25] sử dụng phối hợp mẫu dò gen toxA với các mẫu dò của gen rARN 23S và 16S để phõn loại dưới loài Pseudomonas aeruginosa. Cả hai bộ mẫu dò sử dụng trong kỹ thuật RFLP – Southern blotting đều mang lại những thông tin về mối liên quan về tiến hóa của các chủng vi khuẩn được nghiên cứu. Tuy nhiên, không có kỹ thuật nào có khả năng tách biệt giữa các chủng vi khuẩn hiệu quả bằng kỹ thuật PFGE. RFLP – Southern blotting là một kỹ thuật hữu ích cho nghiên cứu giới hạn về phõn loại dưới loài của các chủng vi khuẩn, các kỹ thuật blotting cồng kềnh đã được thay thế rộng rói bởi kỹ thuật PCR based locus – specific RFLP [25]. 1.1.3. Phương pháp PCR based locus – specific RFLP (Kỹ thuật RFLP dựa trên khuếch đại PCR đoạn gen đặc hiệu) PCR có khả năng khuếch đại một cách thông thường những đoạn gen đặc hiệu để nghiên cứu sự khác nhau giữa các chủng vi khuẩn và khả năng đề kháng kháng sinh. Đoạn gen đặc hiệu nào đó sử dụng trong nghiên cứu sẽ được khuếch đại bởi các primer đặc hiệu và sau đó được phõn tích bằng kỹ thuật RFLP. Những đoạn ADN sau khi bị phõn cắt sẽ được tách biệt trên thạch agarose hoặc gel nhỏ polyacrylamide và các mẫu gen này sẽ được quan sát, phõn tích sau khi nhuộm bằng ethilium bromide [1], [2]. Kỹ thuật RFLP dựa trên khuếch đại PCR đoạn gen đặc hiệu (locus- specific RFLP) đã được áp dụng ở rất nhiều nghiên cứu khác nhau. Shortrige và cộng sự đã sử dụng RFLP để phõn tích gen ureC để chứng tỏ sự khác nhau giữa các chủng Helicobacter pylori ở Mỹ. Vùng gen 16S, 23S và vùng đệm 16S-23S cũng đã được sử dụng là đích tác dụng của kỹ thuật RFLP dựa trên 9 đoạn gen đặc hiệu (locus-specific RFLP) [25]. Trong đó, sự thay đổi này của ribotyping, đó là ADN ribosom được khuếch đại và bị cắt bởi enzym giới hạn. Những đoạn ADN bị cắt bởi enzym giới hạn sẽ được quan sát sau khi điện di trên gel thạch. Vì vậy, làm giảm bớt nhu cầu về kỹ thuật Southern blotting. Ribotyping được áp dụng rất thành công cho phõn biệt các chủng vi khuẩn và thể hiện độ tương đồng cao với operon rARN Một áp dụng mới của kỹ thuật RFLP dựa trên khuếch đại PCR đoạn gen đặc hiệu (locus-specific RFLP), Cockerill và cộng sự đã xác định được đột biến điểm xảy ra ở gen katG của Mycobacterium tuberculosis dẫn đến mức độ đề kháng khác nhau với isoniazid giữa các chủng vi khuẩn này phõn lập được, thể hiện qua những mẫu RFLP của gen được khuếch đại sử dụng trong nghiên cứu. Tuy nhiên, khả năng tách biệt (discriminatory power) của kỹ thuật PCR khuếch đại đoạn gen đặc hiệu (locus-specific PCR) nhìn chung không tốt bằng các phương pháp khác, trước hết bởi vì trong nghiên cứu, kỹ thuật này chỉ phõn tích một vùng giới hạn của hệ gen nó có thể khuếch đại được. Ví dụ nghiên cứu của Kỹhn và cộng sự cho thấy PCR – ribotyping có khả năng tách biệt nghèo nàn khi so sánh với kỹ thuật PFGE và các phương pháp phõn loại theo sinh hóa [25]. Tuy nhiên, kỹ thuật RFLP dựa trên đoạn khuếch đại PCR gen đặc hiệu cho thấy hiệu quả áp dụng đáng tin cậy ở một số nghiên cứu dịch tễ học của virus viêm gan C (HCV). Bằng kỹ thuật này, HCV được chia thành 6 genotype chớnh, đánh số từ 1 đến 6. Davison và cộng sự đã phát triển một kỹ thuật đơn giản để xác định genotype của HCV dựa trên sự khuếch đại PCR và phõn tích RFLP đoạn ADN không mã hóa nằm trên bộ gen của virus này. Kỹ thuật sử dụng phương pháp cắt ADN bằng nhiều hoặc một enzym riêng lẻ HaeIII – RSAI, MvaI - HinfI, BstI và ScrFI cho phép tách biệt các chủng virus phõn lập được vào các nhúm 1a, 1b, 2a, 2b, 3a, 3b, 4, 5 và 6. RFLP của các 10 [...]... về những vi sinh vật được phõn loại Vì vậy, các chủng vi sinh vật bùng nổ mới phát hiện được có thể được so sánh chéo giữa các phòng xét nghiệm để kiểm soát những thay đổi trong quần thể vi sinh vật Chương II ỨNG DỤNG CỦA CÁC PHƯƠNG PHÁP 24 PHÂN LOẠI VI KHUẨN DỰA TRÊN CẤU TRÚC ADN TRONG NGHIÊN CỨU VI KHUẨN HAEMOPHILUS INFLUENZAE 2.1 Kỹ thuật PFGE 2.1.1 Nghiên cứu đặc điểm sinh học của Haemophilus influenzae. .. với những mẫu Rep, nhưng cả hai đều cho khả năng độ tách biệt cao trong phõn loại ở mức độ chủng vi khuẩn Áp dụng cả hai phương pháp Rep và ERIC PCR để định typ các chủng vi khuẩn sẽ làm tăng khả năng tách biệt so với sử dụng riêng lẻ từng kỹ thuật Rep – PCR nhanh chóng trở thành một trong các phương pháp được sử dụng rộng rói nhất trong phõn loại dựa trên cấu trúc ADN Rep – PCR với các đoạn mồi dựa trên. .. tự ADN phải được hướng vào một vùng giới hạn (rất nhỏ) của chromosome vi khuẩn Một điều không thực tế, đó là thực hiện giải trình tự nhiều vùng hoặc một vùng lớn ADN trên chromosome của vi khuẩn Vì vậy, trái ngược lại với phương pháp phân tích ADN dựa vào các kỹ thuật như PFGE, Rep PCR hoặc RAPD có thể nghiên cứu toàn bộ chromosome, giải trình tự ADN chỉ nghiên cứu một phần rất nhỏ của những đoạn ADN. .. các chủng vi khuẩn hoặc nấm Đõy cũng là hạn chế của kỹ thuật này khi sử dụng trong phân loại vi khuẩn [25], [32], [36] Hơn nữa, một đoạn ngắn ADN được sử dụng phải thỏa mãn một số tiêu chuẩn trước khi được sử dụng để phân biệt các chủng vi sinh vật Cấu trúc của vùng ADN được lựa chọn phải bao gồm một chuỗi với trình tự có thể thay đổi cấu trúc nhưng kế bên là những vựng cú độ bảo tồn cao Vùng ADN này... vi c lựa chọn và giải thích các phương pháp phân loại sinh học phân tử dùng trong các nghiên cứu dịch tễ học [36] Cho dù một phương pháp phân loại cụ thể có độ tách biệt cao, độ lặp lại tốt, nhưng sự phức tạp của phương pháp và cách giải thích kết quả cũng như giá cả đều liên quan đến vi c cú xõy dựng hay sử dụng phương pháp đó hay không tùy theo khả năng của mỗi phòng xét nghiệm Vì vậy, lựa chọn phương. .. được và xác định nguồn gốc gõy nhiễm trùng Hiện nay, trong nước cũng như trên thế giới, những nghiên cứu so sánh sự tương đồng về các mẫu phõn tích ADN trên điện di đồ của những chủng Haemophilus influenzae phõn lập được từ nghiên cứu Sau khi đánh giá sự tương đồng của các mẫu ADN của mỗi chủng vi khuẩn dựa trên những băng (band) ADN ở điện di đồ sẽ đưa ra được mối liên quan giữa các chủng vi khuẩn Haemophilus. .. giá những phương pháp phõn loại vi khuẩn dựa trên cấu trúc phõn tử ADN, kỹ thuật giải trình tự gen có độ chớnh xác nhất chỉ khi cả hai chuỗi ADN được xác định trình tự Tuy nhiên, phương pháp phõn loại bằng kỹ thuật giải trình tự thường chỉ thực hiện được trên một đoạn ADN ngắn và phải thỏa món đủ những điều kiện nghiêm ngặt của quá trình giải trình tự nên khả năng phõn biệt giữa các chủng vi khuẩn ở một. .. biệt về cấu trúc của phõn tử ADN Do đó, giải trình tự gen được xem là phương pháp tốt nhất về khả năng phõn biệt trong những phõn loại nhỏ hơn ở mỗi loài vi sinh vật Phương pháp giải trình tự ADN được thực hiện dựa nguyên tắc tạo ra những mảnh ADN được đánh dấu tại đầu 5’ hoặc 3’ Những mảnh ADN chứa những base đã đánh đấu được tách ra trên gel polyacrylamid Trong đó, mỗi mảnh ADN này được phân biệt... influenzae typ b phõn lập được từ những bệnh nhi vi m màng nóo mủ [21] Tất cả những nghiên cứu này đều dựa trên sự phõn loại genotype của Haemophilus influenzae theo kỹ thuật PFGE kết hợp với đối tượng và địa điểm nghiên cứu để đánh giá về mặt dịch tễ học [12], [22], [27] 2.2 Kỹ thuật PCR – RFLP Kỹ thuật PCR – RFLP được sử dụng trong nghiên cứu những chủng Haemophilus influenzae dựa trên phõn tớch RFLP các đoạn... sợi ADN của Hi Thêm vào đó, nghiên cứu của Toru Kobuta, Futoshi Higa và cộng sự tại Nhật Bản năm 2006 [19]; A Sharma và cộng sự tai Ấn Độ năm 2002 [30] đã sử dụng RAPD trong phân loại vi khuẩn Haemophilus influenzae Qua các nghiên cứu có sử dụng kỹ thuật “dấu võn tay” RAPD để phõn loại Haemophilus influenzae cho thấy đõy là một kỹ thuật cho mức độ tách biệt rất cao Mồi ngẫu nhiên thường được sử dụng . " ;Một số phương pháp phõn loại vi khuẩn dựa trên cấu trúc ADN và những ứng dụng trong nghiên cứu vi khuẩn Haemophilus influenzae" nhằm giải quyết 2 mục tiêu: 1. Xác định nguyên lý, ứng dụng. của một số phương pháp phõn loại vi khuẩn dựa trên cấu trúc ADN và so sánh ưu điểm, nhược điểm của từng phương pháp. 2. Ứng dụng của các phương pháp phõn loại sinh học phõn tử trong nghiên cứu. nghiên cứu vi khuẩn Haemophilus influenzae. 3 Chương I NGUYÊN LÝ VÀ ỨNG DỤNG CỦA MỘT SỐ KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ TRONG PHÂN LOẠI CÁC CHỦNG VI KHUẨN 1.1. Nguyên lý và ứng dụng của một số kỹ thuật