HAEMOPHILUS INFLUENZAE
2.3. Kỹ thuật RAPD
Kỹ thuật RAPD (Randomly amplified polymorphic DNA) dựa trên lý thuyết về các bản sao khuếch đại ngẫu nhiên đặc hiệu từ những đoạn ADN giới hạn được tạo ra do enzym giới hạn cắt toàn bộ sợi ADN của vi khuẩn. Jordans và cộng sự đã chọn một đoạn mồi RAPD để mô tả trước khi phõn loại
Listeria monocytogenes. RAPD được chứng minh là kỹ thuật đơn giản trong
so sánh các chủng Hi không có vỏ khi bùng nổ bệnh bằng cách phõn biệt giữa các chủng bởi phõn loại theo cấu trúc OMP, tương tự như ribotyping. RAPD với 6 đoạn mồi khác nhau được dùng để phõn biệt các chủng Hib có hiệu quả tương tự như MLEE. Phương pháp này được xem là rất tốt cho phõn loại, nhưng hiện nay chưa xác định được khả năng đánh giá mối liên quan giữa các
chủng vi khuẩn hay xõy dựng phả hệ giữa các chủng vi khuẩn phõn lập được có liên quan về dịch tễ học (phylogenetically relate strains) [40].
Về phõn loại các chủng Hi theo RAPD, điển hình gần đõy nghiên cứu của S. Yokota và cộng sự tại Nhật Bản 2007 đã sử dụng 6 đoạn mồi khác nhau để phõn loại Hi phõn lập được từ bệnh nhi mắc viêm tai giữa, bao gồm: các mồi P1 (5'-GGTGCGGGAA-3'), P2 (5'-CTTTCGCTCC-3'), P3 (5'- GTAGACCCGT-3'), P4 (5'-AAGAGCCCGT-3'), P5 (5'-AACGCGCAAC-3') và P6 (5'-CCCGTCAGCA-3') để khuếch đại ngẫu nhiên các đoạn ADN trên toàn bộ sợi ADN của Hi. Thêm vào đó, nghiên cứu của Toru Kobuta, Futoshi Higa và cộng sự tại Nhật Bản năm 2006 [19]; A. Sharma và cộng sự tai Ấn Độ năm 2002 [30] đã sử dụng RAPD trong phân loại vi khuẩn Haemophilus
influenzae. Qua các nghiên cứu có sử dụng kỹ thuật “dấu võn tay” RAPD để
phõn loại Haemophilus influenzae cho thấy đõy là một kỹ thuật cho mức độ tách biệt rất cao. Mồi ngẫu nhiên thường được sử dụng với để phõn loại vi khuẩn này bằng kỹ thuật RAPD đó là AP1 và AP2. Trong đó, mồi AP2 thường được sử dụng do có độ tách biệt cao (DI: Discriminatory Index) [19], [31].
Ngoài ra, một số nghiên cứu có thể sử dụng kỹ thuật RAPD trong xác định nguồn gốc của vi sinh vật gõy bệnh dựa trên đánh giá phõn loại theo sự tương đồng về ADN của các chủng vi khuẩn. Trên cơ sở như vậy, năm 2008 S. Yokota và cộng sự tại đưa ra kết luận, phần lớn các chủng Hi kháng Quinolon phõn lập được ở người trên 58 tuổi và không gặp ở trẻ nhỏ [42].
2.4. Rep - PCR
Các trình tự lặp lại với những chức năng chưa được biết được tỡm thấy ở tất cả các bộ gen (genome) của vi khuẩn và các loài prokaryote, chúng bao gồm những đoạn xuôi ngược giống nhau nằm ngoài gen (REP) và đoạn tương đồng nằm trong gen có tớnh lặp lại của trực khuẩn đường ruột (ERIC) được
xác định. REP là các trình tự nguyên thủy được bảo tồn với một cấu trúc ngược xuôi, nằm trên đoạn không mã hóa và phõn bố khắp trên chromosome. Những trình tự này xuất hiện ở rất nhiều loài khác nhau, cho nên chúng trở thành những đích lý tưởng cho PCR. ADN của các chủng Hi không có vỏ được khuếch đại với những primer ERIC đã đưa ra sự khác biệt và phức tạp của kết quả PCR fingerprinting của 40 chủng vi khuẩn không có liên quan về dịch tễ học từ những bệnh nhõn bị viêm tắc nghẽn đường thở mạn tớnh và xơ phế nang. Trong một nghiên cứu tương tự, PCR với một mồi ERIC kết hợp với một mồi tùy ý (arbitrary primer), kết quả tạo ra số lượng band ít hơn và ít đồng nhất hơn. Kỹ thuật này ổn định và có độ lặp lại với bằng chứng thu được một kết quả dữ liệu đồng nhất từ những khuẩn lạc sau khi cấy chuyển, từ những chủng vi khuẩn của một bệnh nhõn, và từ những chỉng Hi không có vỏ
trong suốt quá trình dịch bệnh đường hô hấp. Rep - PCR đã thể hiện là kỹ thuật phõn loại genotype có độ phõn giải cao dễ dàng hơn và nhanh hơn trong những nghiên cứu dịch tễ, với độ tách biệt tương đương với RFLP và phõn loại theo OMP [40].