HAEMOPHILUS INFLUENZAE
2.6. Kỹ thuật Sequencing
Kỹ thuật sequencing thường được sử dụng để phõn tích một đoạn hay một nhúm gen trên chromosom của vi khuẩn. Vì vậy, để phõn tích so sánh hoặc phõn loại sự khác biệt các chủng vi khuẩn trong cùng một loài, đoạn gen cần phõn tích luôn được xác định. Hiện nay, kỹ thuật sequencing thường được áp dụng với nhiều mục đích trong nghiên cứu về Haemophilus influenzae.
- Phõn loại và so sánh mối liên quan giữa các chủng H. influenzae phõn lập được: hiện nay những nghiên cứu thường sử dụng kỹ thuật sequencing để phõn tích một vùng gồm các gen đặc trưng của loài (housekeeping gene: đõy là những gen tương đối ổn định, chúng sao chép tương đối ổn định bất chấp sự thay đổi các điều kiện môi trường của tế bào. Sản phẩm của những gen này cần thiết cho duy trì sự sống của tế bào. Gen này được sử dụng như một tiêu chuẩn nội trong phản ứng PCR định lượng, bởi vì những gen này được cho là sự hiện hiện của chúng không chịu ảnh hưởng của điều kiện môi trường hoặc gen mã hóa 16S rARN trong đánh giá phõn loại, đặc biệt để so sánh mối liên quan giữa các chủng H. influezae phõn lập được. Cụ thể, nghiên cứu của Alice L. Erwin phõn tích mối liên quan về gen của các chủng H. influenzae phõn lập được bằng phõn loại dựa trên trình tự của hệ thống locus (Multilocus Sequence Typing: MLST). Nghiên cứu này, sử dụng một vùng giới hạn (term island). Trong đó, giới hạn (term) không có nghĩa là locus có khả năng chuyển từ chủng này sang chủng khác hoặc vừa mới có được gần đõy. Vùng (Island), chức năng của chúng được biết bao gồm các locus gen quy định khả năng bám của H. influenzae là hmw, hia và hif; vùng này được kế cận bởi
infA và ksgA chứa các locus tham gia tổng hợp lipopolysaccharide (LPS) là lic2BC hoặc losAB; và ba locus quy định các tớnh chất sinh hóa trong định
typ sinh học. Một số chủng gần đõy đã được giải trình tự, mỗi một chủng có chứa một vùng gen lớn (numerous island) mà không xuất hiện ở chủng khác. Một số nghiên cứu lai hoá (hybridization) đã xác định được những vùng khác (other islands). Vùng chắc chắn (certain islands) thông thường xuất hiện nhiều hơn ở những chủng phõn lập được từ bệnh nhõn, hơn là phõn lập được
từ người khỏe mạnh. Ngoài ra, nghiên cứu của Alice L. Erwin cũng phõn loại các chủng H. influenzae bằng phương pháp giải trình tự gen mã hóa 16S rARN, từ đó đưa ra so sánh với phương pháp phõn loại dựa trên trình tự của hệ thống locus. Kết quả nghiên cứu cho thấy phương pháp phõn loại dựa trên giải trình tự gen mã hóa 16S rARN ít đa dạng hơn so với phương pháp phõn loại theo trình tự của hệ thống locus. Xem xét toàn bộ, cõy phả hệ theo phõn loại trình tự 16S không có mõu thuẫn gì với phương pháp phõn tích MLST. Tuy nhiên, hầu hết các nhánh của cõy phả hệ được đưa ra (support) rất ít. Trước đõy, cho thấy, phương pháp phõn loại dự vào cấu trúc gen 16S có thể hữu ích trong xác định nguồn gốc của cả các củng H. influenzae định typ hay không định typ huyết thanh. Gần đõy, các nghiên cứu cho thấy phương pháp này không thực sự hữu ích bằng MLST trong xác định mối liên quan phả hệ của các chủng H. influenzae không định typ huyết thanh [11].
- Phõn tích sự khác biệt về cấu trúc của vỏ polysaccharide của các chủng Hib dựa trên do sự khác nhau về cấu trúc gen bcs4, hcsA và hcsB.
Hình 2.1: Hình ảnh mô tả vùng giới hạn (term island) trên phõn tử
ADN của H. influenzae được sử dụng trong phõn loại theo sequencing.
Cụ thể, nghiên cứu của Leo Schouls và cộng sự tại Hà Lan cho thấy với 9 chủng Hib gõy bệnh xõm hại được nghiên cứu, trong đó 8 chủng typ I có trình tự nhúm gen phụ trách tổng hợp vỏ polysaccharide giống nhau, một chủng typ II có trình tự khác thường. Nghiên cứu này cũn cho thấy các chủng
– 4 tuổi), người chưa được tiêm vacxin và cho thấy sự bộc lộ vỏ polysaccharide ít hơn so với typ I. Sự bộc lộ vỏ polysaccharide nhiều hơn ở typ I có thể giúp cho các vi khuẩn Hib typ I có lợi hơn so với typ II. Kết quả sau khi sử dụng vacxin phòng bệnh, những chủng Hib typ II nhanh chóng bị loại bỏ khỏi quần thể dõn cư. Tuy nhiên, hiện tượng lạ này không giải thích được tại sao hiện nay có sự gia tăng hiện tượng thất bại của vacxin [11], [13], [30], [37], [43].
- Xác định các đột biến gen của Hib:
+ Xác định những đột biến kháng thuốc: điển hình kỹ thuật sequencing dùng trong giải trình tự các vùng của gen ftsI mã hoá transpeptidase có vai trò trong tổng hợp penicillin – binding protein (PBP) 3A hoặc PBP 3B, qua phõn tích trình tự của vùng gen này có thể xác định được những đột biến dẫn đến sự sai khác của các acid amin được tổng hợp. Vì vậy, cấu trúc của PBP thay đổi và dẫn đến hiện tượng đề kháng kháng sinh nhúm β−lactam [17], [19]. Ngoài ra, trong nghiên cứu cơ chế đề kháng kháng sinh nhúm Quinolon của
H. influenzae do đột biến các gen gyrA, gyrB, parC và parE [42].
+ Xác định các đột biến gen gõy thay đổi các phõn tử protein cấu trúc của tế bào vi khuẩn Hib. Cụ thể, một số nghiên cứu xác định đột biến gen
ompP2 (Outer membrane protein) dẫn đến thay đổi cấu trúc phõn tử protein
porin nằm trên màng ngoài tế bào của vi khuẩn Hib, có vai trò thẩm thấu chọn lọc các chất [14]. Ngoài ra, xác định trình tự và những thay đổi về cấu trúc gen quy định tổng hợp protein pili của Hib, đõy là cấu trúc giúp cho vi khuẩn này có thể bám được vào vùng hầu họng và tấn công gõy ra các bệnh nhiễm trùng xõm hại [33].
Phõn loại là một phần rất quan trọng trong nghiên cứu vi sinh vật. Phõn loại vi khuẩn là phương pháp luôn được thực hiện với mục đích xác định nguồn gốc bệnh nhiễm trùng hay đặc điểm dịch tễ học của các chủng vi khuẩn gõy bệnh phõn lập được. Phương pháp phõn loại vi sinh vật dựa trên cấu trúc phõn tử ADN đã khắc phục được phần lớn những nhược điểm của phõn loại theo đặc điểm kiểu hình cổ điển. Tuy nhiên, những phương pháp phõn loại này cũng có nhược điểm nhất định, đó là sự phức tạp khi thực hiện kỹ thuật và chi phí cao cho đầu tư trang thiết bị cũng như hóa chất cho mỗi mẫu xét nghiệm.
Qua nghiên cứu, đánh giá những phương pháp phõn loại vi khuẩn dựa trên cấu trúc phõn tử ADN, kỹ thuật giải trình tự gen có độ chớnh xác nhất chỉ khi cả hai chuỗi ADN được xác định trình tự. Tuy nhiên, phương pháp phõn loại bằng kỹ thuật giải trình tự thường chỉ thực hiện được trên một đoạn ADN ngắn và phải thỏa món đủ những điều kiện nghiêm ngặt của quá trình giải trình tự nên khả năng phõn biệt giữa các chủng vi khuẩn ở một số trường hợp cụ thể không cao. Vì vậy, những kỹ thuật như PFGE, Rep – PCR và AFLP được sử dụng để phõn tích toàn bộ cấu trúc ADN (chromosome) của vi khuẩn nên có khả năng phõn biệt đủ lớn để tạo ra kết quả phõn loại dưới loài có độ tin cậy. Ngoài ra, đối với những phương pháp này, phần xõy dựng hệ thống thiết bị cũng như giá cả thấp hơn cho mỗi mẫu xét nghiệm.
Một số phương pháp phõn loại dựa trên cấu trúc phõn tử ADN như: sequencing, PFGE, Rep – PCR, AFLP, PCR based locus – specific RFLP và RAPD đã được áp dụng trong các nghiên cứu về H. influenzae. Tuy nhiên, kỹ thuật phõn loại PFGE được đánh giá là phương pháp thường được sử dụng nhất trong nghiên cứu dịch tễ học hay xác định nguồn gốc của H. influenzae, đặc biệt là H. influenzae typ b.
