Phân lập và định danh các chủng vi khuẩn nội sinh phân hủy AHLs có khả năng ức chế sự phát triển của vi khuẩn thối nhũn từ khoai tây với hiệu quả cao và ổn định. Thử nghiệm các chủng vi khuẩn nội sinh để phòng trừ bệnh thối nhũn khoai tây do vi khuẩn Ecc gây ra trên khoai tây Tìm ra quy trình xử lý VKNS để phòng trừ bệnh hiệu quả.
Trang 1SỞ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO HÀ NỘI TRƯỜNG THPT chuyên Hà Nội - Amsterdam
**************
ĐỀ TÀI DỰ THI KHOA HỌC, KỸ THUẬT DÀNH CHO HỌC SINH TRUNG HỌC CẤP THÀNH PHỐ
LẦN THỨ TƯ (NĂM HỌC 2014 - 2015).
Tên đề tài: ỨNG DỤNG VI KHUẨN NỘI SINH PHÂN HỦY N-ACYL-L-HOMOSERINE
LACTONES (AHLs) TRONG PHÒNG TRỪ BỆNH THỐI NHŨN KHOAI TÂY
Lĩnh vực: Sinh học tế bào và phân tử
NGƯỜI HƯỚNG DẪN
- TS Hoàng Hoa Long
- Đơn vị công tác: Viện Di truyền nông
nghiệp, KM2, đường Phạm Văn Đồng, Từ
Trang 2DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
CHỮ VIẾT TẮT CHỮ VIẾT ĐẦY ĐỦ
AND Acid Deoxyribo Nucleic
ARN Acid Ribo Nucleic
CV026 Chromobacterium violaceum
CFU (Colony Forming Unit) đơn vị hình thành khuẩn lạc
Ep Endophytes (vi khuẩn nội sinh)
LB Môi trường Luria Bertani medium
PCR Polymerase chain reaction
QQ Quorum Quenching
QS Quorum Sensing
VKNS Vi khuẩn nội sinh
YPDA Yeast Peptone Dextrose Agar
Trang 3DANH MỤC HÌNH ẢNH
Hình 1: Mẫu khoai tây bị bệnh thối nhũn 9
Hình 2: Thí nghiệm thử khả năng sản sinh AHLs của vi khuẩn 11
Hình 3: Phương pháp xác định VKNS phân hủy AHLs 13
Hình 4: Hình thái khuẩn lạc của chủng vi khuẩn gây bệnh P2.6.1 trên môi trường YPDA sau 24 giờ nuôi cấy ở 28oC 17
Hình 5: Triệu chứng bệnh sau khi tái nhiễm chủng P.2.6.1 trên khoai tây sau 24h 18
Hình 6: Khả năng sản sinh AHLs chuỗi ngắn của chủng vi khuẩn gây bệnh P.2.6.1 19
Hình 7: Các chủng VKNS có khả năng phân hủy AHLs chuỗi ngắn 21
Hình 8: Sản phảm PCR nhân đoạn gen 16S rRNA của các chủng VKNS 22
DANH MỤC BẢNG Bảng 1: Độc tính của các chủng vi khuẩn phân lập được từ củ khoai tây bị bệnh thối nhũn 17
Bảng 2: Khả năng sản sinh AHLs của các chủng vi khuẩn gây bệnh 19
Bảng 3: Các chủng VKNS có khả năng phân hủy AHLs 20
Bảng 4: Hiệu lực phòng trừ bệnh thối nhũn của chủng VKNS 1.6 21
Trang 4MỤC LỤC
DANH MỤC BẢNG 3
MỤC LỤC 4
I LÝ DO CHỌN ĐỀ TÀI 4
II TỔNG QUAN VẤN ĐỀ 5
1 Mục tiêu nghiên cứu 5
2 Đối tượng nghiên cứu 6
3 Phương pháp và cơ chế 6
4 Các giai đoạn tiến hành 7
5 Tính mới, tính thời sự của đề tài 7
6 Ý nghĩa thực tiến của đề tài 7
III QUÁ TRÌNH NGHIÊN CỨU VÀ KẾT QUẢ 7
3.1 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu 7
3.1.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 7
3.1.2 Đối tượng nghiên cứu 7
3.1.3 Môi trường dùng trong nghiên cứu 8
3.1.4 Dụng cụ, thiết bị 8
3.2 Phương pháp nghiên cứu 8
3.2.1 Phương pháp nghiên cứu vi khuẩn gây bệnh thối nhũn khoai tây Ecc 8
3.2.2 Phân lập các chủng VKNS từ củ khoai tây 11
3.2.3 Tuyển chọn các chủng VKNS có khả năng phân hủy AHLs trong điều kiện in vitro và in vivo 12
3.2.4 Đánh giá khả năng ức chế sự phát triển của vị khuẩn gây bệnh thối nhũn và triệu chứng bệnh trên lát cắt củ khoai tây của VKNS 13
3.2.5 Phân loại vi khuẩn VKNS và đánh giá mức độ an toàn sinh học của các chủng VKNS 15
3.2.6 Đánh giá khả năng tồn tại của các chủng VKNS bên trong mô cây chủ 16
3.2.7 Quy trình xử lý VKNS để phòng trừ bệnh hiệu quả (đang tiến hành) 17
3.3 Kết quả nghiên cứu 17
3.3.1 Phân lập, tuyển chọn các chủng vi khuẩn gây bệnh thối nhũn từ củ khoai tây 17
3.3.2 Đánh giá độc tính của tác nhân gây bệnh trên cũ khoai tây trong phòng thí nghiệm 17
3.3.3 Khả năng sản sinh AHLs của các chủng vi khuẩn gây bệnh 18
3.3.4 Phân lập và tuyển chọn các chủng vi khuẩn nội sinh từ củ khoai tây 19
3.3.5 Tuyển chọn các chủng vi khuẩn nội sinh có khả năng phân hủy AHLs in vitro và in vivo 20
3.3.6 Đánh giá khả năng ức chế bệnh thối nhũn trên lát cắt củ khoai tây của chủng VKNS 1.6 21
3.3.7 Phân loại và đánh giá mức độ an toàn sinh học của chủng vi khuẩn nội sinh 1.6 .22 3.3.8 Khả năng tồn tại của chủng vi khuẩn nội sinh 1.6 trong mô cây chủ 23
IV KẾT LUẬN 24
V TÀI LIỆU THAM KHẢO 25
I Tài liệu tham khảo tiếng Việt 25
II Tài liệu tham khảo tiếng Anh 25
I LÝ DO CHỌN ĐỀ TÀI
Cây khoai tây có tên khoa học là Solanum tuberosum, thuộc họ
Solanaceae Ngày nay, khoai tây trở thành cây lương thực quan trọng, trên khắp
Trang 5thế giới từ khoai tây người ta đã chế biến ra hàng trăm món ăn khác nhau, thơmngon, rẻ tiền, rất bổ dưỡng vì trong khoai tây có chứa các vitamin, khoángchất và phân loại của chất phytichemical như carotenoids và phenol tự nhiên Một củ khoai tây còn vỏ có kích thước trung bình 150g, cung cấp 27 mg vitamin
C (45% giá trị hàng ngày), 620 mg kali (18%), 0.2 mg vitamin B6 (10%) và mộtlượng rất nhỏ thiamin, riboflavin, folate, niacin, magie, photpho, sắt, kẽm…Nghiên cứu còn cho thấy khoai tây không chỉ là lương thực, mà còn là dượcphẩm, có tính chất chữa bệnh GS.Venket Rao khoa dinh dưỡng Trường đại học
Y Toronto, Canada cho hay, trong khoai tây có nhiều chất chống ôxy hóa Nó cókhả năng ngăn ngừa quá trình lão hóa, hạn chế sự phát triển của ung thư, kíchthích tiêu hóa và chữa viêm tuyến dịch vị và một số bệnh khác Những nghiêncứu gần đây còn cho thấy khoai tây rất giàu sterol, giúp tăng cường khả năngmiễn dịch cho cơ thể
Tuy nhiên, người nông dân đang phải đối mặt với tình trạng gây hại củasâu, bệnh trên khoai tây, đặc biệt là bệnh thối nhũn khoai tây do vi khuẩn
Erwinia carotovora subsp carotovora gây ra Hiện nay, biện pháp phòng trừ
bệnh chủ yếu là dựa vào các phương pháp truyền thống và sử dụng thuốc trừ sâuhóa học Tuy nhiên, các biện pháp này đều không có hiệu quả cao và đặc biệtviệc sử dụng thuốc hóa học bảo vệ thực vật đã gây ảnh hưởng nghiêm trọng đếnchất lượng nông sản, sức khỏe và môi trường sống của con người Vì vậy, đềxuất một biện pháp phòng trừ hiệu quả và thân thiện với môi trường trở thànhvấn đề cấp bách hiện nay
Vi khuẩn gây bệnh E carotovora subsp carotovora sử dụng quorum
sensing (QS) như một cơ chế trao đổi thông tin giữa các tế bào và phụ thuộc mật
độ quần thể Trong cơ chế này, N-acyl-L-homoserine lactones (AHLs) đóng vai
trò như các chất tự cảm ứng (autoinducer) và cũng là các phân tử tín hiệu có mặttrong hầu hết các vi khuẩn gây bệnh Gram âm Theo các nghiên cứu gần đây,một nhóm vi khuẩn có khả năng phân hủy AHLs qua cơ chế quorum quenching(QQ) đã được sử dụng trong phòng trừ sinh học bệnh thực vật
Do vậy, nhóm tác giả tiến hành thực hiện đề tài nghiên cứu: "Ứng dụng
vi khuẩn nội sinh phân hủy N-acyl-L-homoserine lactones (AHLs) trong phòng trừ bệnh thối nhũn khoai tây".
II TỔNG QUAN VẤN ĐỀ
1 Mục tiêu nghiên cứu
- Phân lập và định danh các chủng vi khuẩn nội sinh phân hủy AHLs có
Trang 6khả năng ức chế sự phát triển của vi khuẩn thối nhũn từ khoai tây với hiệu quảcao và ổn định.
- Thử nghiệm các chủng vi khuẩn nội sinh để phòng trừ bệnh thối nhũn
khoai tây do vi khuẩn Ecc gây ra trên khoai tây
- Tìm ra quy trình xử lý VKNS để phòng trừ bệnh hiệu quả
2 Đối tượng nghiên cứu
- Mẫu củ khoai tây bị bệnh thối nhũn
- Mẫu củ khoai tây sạch bệnh
- Các chủng vi khuẩn gây bệnh sản sinh AHLs: Erwinia cartovora subsp.
carotovora (Ecc) gây bệnh thối nhũn khoai tây
- Chủng vi khuẩn chỉ thị Chromobacterium violaceum CV026 có khả năng phản
ứng với các phân tử AHLs và hình thành sắc tố màu tím (violacein)
3 Phương pháp và cơ chế
* Phương pháp nghiên cứu
- Phân lập VKNS và vi khuẩn gây bệnh theo phương pháp khử trùng bề mặt tiêuchuẩn
- Phân loại VKNS và vi khuẩn gây bệnh dựa trên xác định các đặc tính sinh lýsinh hóa và giải trình tự gen 16S rRNA
- Tuyển chọn các chủng có khả năng phân hủy AHLs in vitro và in vivo theo phương pháp đồng nuôi cấy với reporter strains Chromobacterium violaceum
và vi khuẩn gây bệnh thông qua phá hủy mạng lưới QS Vấn đề này không chỉ
có ý nghĩa khoa học đối với một loại bệnh nhất định trên cây trồng mà còn giúptạo cơ sở để nghiên cứu điều trị các bệnh trên người do vi khuẩn phụ thuộc tínhiệu QS gây ra
Trang 74 Các giai đoạn tiến hành
Bước 1: Phân lập các chủng vi khuẩn gây bệnh thối nhũn Ecc
Bước 2: Phân lập các chủng VKNS từ củ khoai tây.
Bước 3: Tuyển chọn các chủng VKNS có khả năng phân hủy AHLs trong điều
kiện in vitro và in vivo
Bước 4: Đánh giá khả năng ức chế sự phát triển của vi khuẩn gây bệnh thối
nhũn và triệu chứng bệnh trên lát cắt củ khoai tây của VKNS
Bước 5: Phân loại, đánh giá mức độ an toàn sinh học của các chủng VKNS Bước 6: Đánh giá khả năng tồn tại của các chủng VKNS bên trong mô cây chủ Bước 7: Quy trình xử lý VKNS để phòng trừ bệnh hiệu quả (đang tiến hành)
5 Tính mới, tính thời sự của đề tài
Ở Việt Nam: Hiện chưa có nghiên cứu nào vè cơ chế gây bệnh của vi khuẩn gâybệnh thối nhũn cũng như sử dụng các chủng vi khuẩn nội sinh đối kháng đểphân hủy AHLs của vi khuẩn gây bệnh trong phòng trừ bệnh thối nhũn do vikhuản gây hại cây trồng
Trên thế giới: Đã có nhiều nghiên cứu theo hướng này Hầu hết các nghiên cứuđều sử dụng vi khuẩn đã được phân lập từ đất hoặc vi khuẩn biểu mô Do vậyđiểm mới của đè tài này là sử dụng các chủng vi khuẩn nội sinh
6 Ý nghĩa thực tiến của đề tài
Ứng dụng vi khuẩn nội sinh phòng trừ bệnh thối nhũn khoai tây góp phầntạo ra sản phẩm nông sản an toàn, làm giảm sử dụng thuốc hóa học giúp bảo vệmôi trường, sức khỏe con người và tăng thu nhập cho người nông dân Trên cơ
sở đó có thể mở rộng ứng dụng để phòng trừ bệnh trên nhiều loài cây trồng khácnhau
III QUÁ TRÌNH NGHIÊN CỨU VÀ KẾT QUẢ
3.1 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
3.1.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu
- Thời gian: Từ tháng 05/2014 đến nay
- Địa điểm: Bộ môn Bệnh Học Phân Tử - Viện Di Truyền Nông Nghiệp
3.1.2 Đối tượng nghiên cứu
- Mẫu củ khoai tây bị bệnh thối nhũn
Trang 8- Mẫu củ khoai tây sạch bệnh.
- Các chủng vi khuẩn gây bệnh sản sinh AHLs: Erwinia cartovora subsp.
carotovora (Ecc) gây bệnh thối nhũn khoai tây
- Chủng vi khuẩn chỉ thị Chromobacterium violaceum CV026 có khả
năng phản ứng với các phân tử AHLs và hình thành sắc tố màu tím(violacein)
3.1.3 Môi trường dùng trong nghiên cứu
+ Môi trường YPDA dùng trong phân lập và nuôi cấy vi khuẩn: Cao nấmmen 1,5 g; Peptone 0,3 g; Glucose 1,5 g; Nước cất 1000 ml; Agar 20 g; pH 7,2;Khử trùng 121oC trong 15 phút
+ Môi trường LB dùng trong nuôi cấy, thử khả năng phân hủy AHLs:Tryptone 10g; Cao nấm men 5g; NaCl 5g; Nước cất 1000 ml; Agar 20; pH 7,2;Kkhử trùng 121ºC trong 15 phút
+ Sữa gầy (skimmed milk) dùng trong bảo quản các chủng vi khuẩn: 10%skim milk; 0,05 % L-Glutamic Acid; khử trùng 121ºC trong 15 phút
3.1.4 Dụng cụ, thiết bị
Các thiết bị và máy móc của Bộ môn Bệnh học Phân tử, Viện Di truyềnNông nghiệp, bao gồm một số thiết bị chính như: tủ cấy an toàn sinh họcNUAIRE (Mỹ), nồi khử trùng OMRON (Nhật Bản), máy ly tâm lạnhUNIVERSAL (Mỹ), cân điện tử AND (Anh), lò vi sóng, máy chụp ảnh gel, máy
đo pH HORIBA (Nhật Bản), máy PCR, tủ lạnh giữ giống VESTROST (ĐanMạch), tủ nuôi cấy JEIOTECH (Hàn Quốc), bể điện di MUPID (Nhật Bản), tủsấy LENTON (Anh), máy khuấy từ FISHER (Mỹ)…
Dụng cụ: đĩa Petri, Pipette các loại, ống Fancol, ống nghiệm, ốngeppendorf, ống đong, đèn cồn, bình tam giác (50, 100, 250 ml), bình Schott, quecấy…
3.2 Phương pháp nghiên cứu
3.2.1 Phương pháp nghiên cứu vi khuẩn gây bệnh thối nhũn khoai tây Ecc
3.2.1.1 Điều tra và thu thập mẫu bệnh
- Mẫu khoai tây bị bệnh thối nhũn được thu thập từ các chợ đầu mối trênđịa bàn Hà Nội và trên các cánh đồng trồng khoai tây khu vực Thường Tín,Đông Anh, Sóc Sơn
Trang 9- Các mẫu bệnh được thu dựa trên triệu chứng thối nhũn điển hình: môbệnh bị thối, có màu kem đến màu nâu, ướt, nhũn Quá trình thối bắt đầu trên bềmặt củ và ăn sâu vào bên trong Ranh giới giữa mô bệnh và khỏe rõ ràng bởiđường viền tối màu hoặc đen (Hình 1) Thường thối nhũn không có mùi tronggiai đoạn đầu phân hủy, nhưng khi có sự xâm nhiễm thứ cấp có mùi rất khóchịu.
Hình 1: Mẫu khoai tây bị bệnh thối nhũn
Mẫu bệnh thu thập được để riêng biệt trong túi báo, bảo quản ở nhiệt độ
4oC cho đến khi phân lập vi khuẩn gây bệnh
3.2.1.2 Phân lập vi khuẩn gây bệnh
Phân lập vi khuẩn gây bệnh được tiến hành theo phương pháp của Furuya
và cộng sự (2002) theo các bước sau:
- Rửa mẫu dưới vòi nước và sau đó xịt cồn 70% trên toàn mẫu
- Cắt những miếng nhỏ (1x1cm) giữa vùng bị bệnh và vùng không bị bệnhtrên 3 điểm khác nhau của mẫu bệnh, sau đó đặt vào đĩa Petri đã khử trùng
- Nhỏ 1ml nước cất đã khử trùng vào sau đó nghiền nát để lấy dịch gốc.Chuẩn bị 6 ống eppendorf 1.5ml, mỗi ống chứa 900µl nước cất khử trùng
- Hút 100µl dịch gốc nhỏ vào ống 1 trộn đều, tiếp tục hút 100µl dịch từống 1 nhỏ sang ống 2 và làm lần lượt cho đến ống thứ 6 để được các nồng độpha loãng
- Lấy 100µl từ các ống eppendorf với 6 nồng độ đã được pha loãng nhỏlần lượt vào các đĩa môi trường YPDA và trang đều trên bề mặt đĩa
- Để mẫu trong tủ 28oC, sau 24 giờ kiểm tra khuẩn lạc Mô tả đặc điểmcủa các khuẩn lạc trên đĩa, sau đó chuyển cấy vào môi trường YPDA mới
Trang 10- Bảo quản các chủng vi khuẩn đã phân lập được trong sữa tách béo 10%
ở -20oC để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo
3.2.1.3 Đánh giá độc tính của tác nhân gây bệnh trên củ khoai tây trong phòng
thí nghiệm
Độc tính của các tác nhân gây bệnh được đánh giá trong phòng thí nghiệmbằng phương pháp lây nhiễm trực tiếp lên lát cắt củ khoai tây (Nguyễn Thanh Hà
và cs., 2013) theo các bước sau:
- Củ khoai tây được rửa sạch dưới vòi nước chảy Xịt cồn 70% lên bề mặtcủa củ Sau đó, củ khoai tây được cắt thành những lát có chiều dầy khoảng 1cm
và đặt trong đĩa petri
- Dùng đầu tăm nhọn đã khử trùng lấy nguồn khuẩn nhiễm đã được cấytrên YPDA sau 24 giờ, đâm đều xung quanh lát cắt khoai tây, mỗi lần lấy nguồnkhuẩn nhiễm sử dụng cho 2-3 lỗ châm
- Đối chứng dương được sử dụng là chủng vi khuẩn Erwinia carotovora subsp carotovora ATCC175713T (Ecc), gây bệnh thối nhũn điển hình Đốichứng âm được sử dụng với nước cất khử trùng
- Mẫu khoai tây sau khi nhiễm được đặt trên giấy thấm ẩm trong đĩa Petri
và ủ ở 28oC Quan sát triệu chứng và mức độ biểu hiện bệnh sau 24h, 48h Mỗichủng vi khuẩn được lây nhiễm trên 3 lát cắt Thí nghiệm được lặp lại 3 lần
3.2.1.4 Xác định khả năng sản sinh AHLs
Khả năng sản sinh AHLs của vi khuẩn gây bệnh được tiến hành theophương pháp đồng nuôi cấy của Molina và cộng sự (2003) (Hình 2) với một sốthay đổi như sau:
- Chủng vi khuẩn chỉ thị CV026 và Ecc được cấy trên môi trường LB vàYPDA tương ứng và ủ ở 28oC trong 48 giờ
- Các chủng vi khuẩn nghiên cứu được cấy trên môi trường YPDA và ủ ở
28oC trong 24 giờ
- Các chủng vi khuẩn được cấy vạch thành một đường trên môi trường
LB, kèm sát bên phải là chủng vi khuẩn chỉ thị CV026 cũng được cấy vạchthành một đường, tạo thành 2 đường cấy song song
- Đối chứng dương gồm hai chủng Ecc và CV026 cấy sát nhau Đối chứng
âm là chủng Ecc và chủng CV026 được cấy riêng biệt
- Mẫu được để trong tủ 28oC Thí nghiệm được làm nhắc lại 3 lần và kết
Trang 11quả được thể hiện sau 24 giờ
Hình 2: Thí nghiệm thử khả năng sản sinh AHLs của vi khuẩn
3.2.2 Phân lập các chủng VKNS từ củ khoai tây
3.2.2.1 Vật liệu nghiên cứu
Mẫu khoai tây sạch bệnh thu thập từ các chợ đầu mối trên địa bàn Hà Nội
và các vùng trồng khoai tây ở Thường Tín, Đông Anh
Trang 12Nghiền mẫu trong đĩa petri khử trùng Nhỏ 1ml nước cất đã khử trùng vào dịchnghiền và trộn đều để tạo dịch gốc Chuẩn bị 6 ống pendorf 1.5ml, mỗi ốngchứa 900µl nước cất khử trùng Hút 100 µl dịch gốc nhỏ vào ống 1 trộn đều, tiếptục hút 100 µl dịch từ ống 1 nhỏ sang ống 2 và làm lần lượt cho đến ống thứ 6
để được các nồng độ pha loãng Lấy 100 µl từ các ống pendorf với 6 nồng độ đãđược pha loãng nhỏ lần lượt vào các đĩa môi trường YPDA và trà đều trên bềmặt đĩa Để mẫu trong tủ 28oC, sau 24h kiểm tra khuẩn lạc Mô tả đặc điểm củacác khuẩn lạc trên đĩa, sau đó chuyển cấy vào môi trường YPDA mới Bảo quảncác chủng VKNS phân lập được trong sữa gầy (skimmed milk) 10% ở -20oC đểtiến hành các thí nghiệm tiếp theo
3.2.3 Tuyển chọn các chủng VKNS có khả năng phân hủy AHLs trong điều
kiện in vitro và in vivo
Khả năng phân hủy AHLs của vi khuẩn gây bệnh được tiến hành theophương pháp đồng nuôi cấy của Molina và cộng sự (2003) (Hình 3) với một sốthay đổi như sau:
- Chủng vi khuẩn chỉ thị CV026 và chủng vi khuẩn gây bệnh thối nhũnEcc được cấy trên môi trường LB và YPDA tương ứng và ủ ở 28oC trong 48h
- Các chủng VKNS được cấy trên môi trường YPDA và ủ ở 28oC trong24h
- Các chủng VKNS được cấy vạch thành một đường trên môi trường, kèmsát hai bên là chủng vi khuẩn Ecc và chủng vi khuẩn chỉ thị CV026 cũng đượccấy vạch thành một đường, tạo thành 3 đường cấy song song
- Đối chứng dương chỉ gồm hai chủng Ecc và CV026 cấy sát nhau; Đốichứng âm là chủng Ecc và chủng CV026 được cấy riêng biệt
- Mẫu được để trong tủ 280C
Lưu ý: Thí nghiệm được làm nhắc lại 3 lần và kết quả được thể hiện sau24h
Trang 13Hình 3: Phương pháp xác định VKNS phân hủy AHLs
3.2.4 Đánh giá khả năng ức chế sự phát triển của vị khuẩn gây bệnh thối
nhũn và triệu chứng bệnh trên lát cắt củ khoai tây của VKNS
3.2.4.1 Chuẩn bị lát cắt củ khoai tây
- Rửa củ khoai tây dưới vòi nước chảy cho hết bùn đất và để ráo nước
- Cắt lát khoai tây và khoan một lỗ trên mỗi lát cắt khoai tây (sử dụngkhoan đục lỗ thạch)
- Khử trùng bề mặt lát cắt khoai tây với cồn 70% trong 3 phút, tiếp theoNaClO (3% Cl-) + 1 - 2 giọt Tween 20 trong 5 phút Tráng sạch bằng nước cấtkhử trùng 3 lần
- Thấm khô bằng giấy thấm khử trùng Đặt mỗi lát cắt khoai tây vào mỗiđĩa Petri
3.2.4.2 Chuẩn bị dịch vi khuẩn
- Chuẩn bị ống eppendorf (1.5ml) chứa 1000µl nước cất khử trùng Dùngque cấy lấy 1 - 2 đầu que cấy vi khuẩn (VKNS và vi khuẩn gây bệnh Ecc) đãnuôi trên đĩa Petri cho vào ống nước cất, trộn kỹ trên máy vortex cho đến khi tạothành dịch khuẩn đục (khoảng 108-109 cfu/ml)