Phân lập và xác định đặc tính enzyme n acyl l homoserine lactone (AHL) lactonase của vi khuẩn nội sinh sử dụng trong phòng trừ bệnh thối nhũn củ khoai tây
Tài liệu hạn chế xem trước, để xem đầy đủ mời bạn chọn Tải xuống
1
/ 66 trang
THÔNG TIN TÀI LIỆU
Thông tin cơ bản
Định dạng
Số trang
66
Dung lượng
1,76 MB
Nội dung
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT *** NGUYỄN THỊ THU HÀ PHÂNLẬPVÀXÁCĐỊNHĐẶCTÍNH ENZYM N-ACYL-L-HOMOSERINE LACTONE(AHL)LACTONASECỦAVIKHUẨNNỘISINHSỬDỤNGTRONGPHÒNGTRỪBỆNHTHỐINHŨNCỦKHOAITÂY LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC HÀ NỘI - 2015 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT *** PHÂNLẬPVÀXÁCĐỊNHĐẶCTÍNH ENZYM N-ACYL-L-HOMOSERINE LACTONE(AHL)LACTONASECỦAVIKHUẨNNỘISINHSỬDỤNGTRONGPHÒNGTRỪBỆNHTHỐINHŨNCỦKHOAITÂY Chuyên ngành: Visinh vật học Mã số: 60420103 LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC TS Hoàng Hoa Long HÀ NỘI - 2015 MỞ ĐẦU Cây khoaitây (Solanum tuberosum L), thuộc họ Cà (Solanaceae) lồi nơng nghiệp ngắn ngày, trồng lấy củ chứa tinh bột Khoaitây có nguồn gốc vùng cao thuộc dãy núi Andes, Nam Mỹ, người Pháp đưa vào Việt Nam từ năm 1890 Có thời kỳ khoaitây xem lương thực có tầm quan trọng thứ ba sau lúa ngơ Khoaitây có giá trị dinh dưỡng cao khoaitây có chứa vitamin, khống chất, caronoids phenol tự nhiên Khoaitây không lương thực mà dược phẩm Một nhà khoa học Viện Thực phẩm Anh phát khoaitây chứa hợp chất sinh học cucoamin có tác dụng làm giảm huyết áp ăn thường xuyên Trong nghiên cứu khác gần đây, GS Venket Rao, Khoa Dinh dưỡng Đại học Y Toronto Canada phát thấy khoaitây có nhiều chất chống oxy hóa Nó có khả ngăn ngừa q trình lão hóa, hạn chế phát triển ung thư số bệnh khác Theo thông tin Cục Trồng trọt, Bộ Nông nghiệp Phát triển Nông thôn, Việt Nam quốc gia có khả phát triển mạnh khoai tây, nhiều đồng Bắc Bộ, miền núi phía Bắc, Bắc Trung Bộ Tây Nguyên, với diện tích ước tính 200.000 Tuy nhiên, diện tích trồngkhoaitây đạt 30.000-35.000 ha, với suất 10-11 tấn/ha Một nguyên nhân dẫn đến giảm suất diện tích trồngkhoaitâytình trạng gây hại sâu bệnh, đặc biệt bệnhthốinhũnvikhuẩn Erwinia gây ra, phổ biến loài Erwinia carotovora subsp carotovora (Ecc) Bệnh gây chủ yếu loài trồng có giá trị kinh tế cao thuộc họ cà, họ thập tự, họ bầu bí, họ hành, số loài hoa lan… Bệnh gây hại cho từ trồng ngồi đồng ruộng thu hoạch bảo quản kho Đặc biệt điều kiện thời tiết nóng ẩm mưa nhiều bệnh trở nên trầm trọngVikhuẩn Ecc sửdụng Quorum Sensing (QS) chế trao đổi thông tin tế bào phụ thuộc mật độ quần thể để kiểm soát gen liên quan đến tính độc hoạt động tế bào vikhuẩnTrong chế này, N-acyl-L-homoserine lactones (AHLs) đóng vai trò chất tự cảm ứng (autoinducer) phân tử tín hiệu tổng hợp tiết suốt trình phát triển vikhuẩn Khi nồng độ phân tử AHLs tăng lên với phát triển quần thể vikhuẩn đạt đến ngưỡng định (quorum level), AHLs gây hiệu ứng kiểu hình thơng qua việc điều hòa biểu gen đích, mà vikhuẩn gây bệnh Ecc gen quy địnhtính độc chủ Hiện nay, biện pháp phòngtrừbệnh chủ yếu dựa vào phương pháp truyền thống sửdụng thuốc trừ sâu hóa học Tuy nhiên, biện pháp không mang lại hiệu cao, đặc biệt việc sửdụng thuốc trừ sâu hóa học gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến chất lượng nông sản môi trường sống người Do biện pháp phòngtrừsinh học sửdụngvisinh vật đối kháng tự nhiên ngày đặc biệt quan tâm Nhiều nghiên cứu tự nhiên tồn nhóm vikhuẩncưtrú bên mô chủ không gây triệu chứng bệnh cho gọi vikhuẩnnộisinh (bacterial endophyte) Trong số chúng, có vikhuẩn có khả phân hủy AHLs qua chế Quorum Quenching (QQ), hoạt động xảy tự nhiên có tác dụng chặn đứng bước quan trọng hệ thống QS hình thành, tích lũy tiếp nhận phân tử tín hiệu Dựa vào cấu trúc phân tử AHLs, nhà khoa học xácđịnh nhóm enzymephân hủy AHLs: AHL-lactonase, AHL-acylase AHL- oxidoreductase Cho đến nay, enzyme AHL-lactonase nghiên cứu nhiều Enzyme phát lần từ chủng vikhuẩn Bacillus sp 240B có khả bất hoạt phân tử AHL Gen mã hóa enzyme chuyển vào chủng vikhuẩn gây bệnh E carotovora SCG1 làm giảm đáng kể giải phóng AHL, giảm hoạt động enzyme pectolytic ngoại bào giảm độc tínhkhoai tây, cà, cải bắp, cà rốt,… Kể từ giới, nhiều vikhuẩn có hoạt tính AHL-lactonase miêu tả Bacillus thuringiensis subsp morisoni, Arthrobacter sp., Microbacterium testaceum Tuy nhiên, Việt Nam chưa có nghiên cứu chế gây bệnhvikhuẩnthốinhũnsửdụng chủng vikhuẩnnộisinh (VKNS) đối kháng để phân hủy AHLs vikhuẩn gây bệnhphòngtrừbệnhthốinhũn Do vậy, tiến hành chọn nghiên cứu đề tài “Phân lậpxácđịnhđặctínhenzyme N-acyl-L-homoserine lactone(AHL)lactonasevikhuẩnnộisinhsửdụngphòngtrừbệnhthốinhũncủkhoai tây” với hy vọng hướng nghiên cứu góp phần đặt viên gạch để thiết lập biện pháp phòngtrừ hiệu bệnhthốinhũnkhoaitâyvikhuẩn Ecc gây Việt Nam Mục đích đề tài Xácđịnh hoạt tínhenzymephân hủy N-acyl-Lhomoserine lactones (AHLs), AHL lactonase chủng vikhuẩnnộisinhsửdụngphòngtrừbệnhthốinhũncủkhoaitây Yêu cầu đề tài - Phânlậpxácđịnh khả phân hủy AHLs vikhuẩnnộisinh từ cà dại - Thử nghiệm ảnh hưởng thời gian nuôi cấy VKNS đến hoạt tínhenzyme AHL lactonase - Thử nghiệm loại môi trường nuôi cấy VKNS ảnh hưởng đến hoạt tínhenzyme AHL lactonase - Xácđịnh hoạt tínhenzyme AHL lactonase chủng VKNS phân hủy loại AHLs tổng hợp C6, C8 C10 - Thử nghiệm hiệu phòngtrừbệnhthốinhũncủkhoaitây chủng vikhuẩnnộisinh có hoạt tínhenzyme AHL lactonase điều kiện phòng thí nghiệm Ý nghĩa đề tài Ý nghĩa khoa học - Thực đề tài giúp tơi có thêm kinh nghiệm, kiến thức kỹ thuật phân lập, xácđịnh khả phân hủy, xácđịnh hoạt tínhenzymephân hủy AHLs từ vikhuẩnnội sinh, đối tượng quan tâm, ngồi cung cấp thêm hiểu biết kỹ thuật khác mà công nghệ sinh học đại áp dụng - Kết nghiên cứu để tài cung cấp vật liệu khởi đầu cho việc nghiên cứu enzymephân hủy AHLs tiền đề phát triển chiến lược phòngtrừbệnhthốinhũnkhoaitây an tồn bền vững sau Ý nghĩa thực tiễn Ngoài ý nghĩa khoa học, vấn đề nghiên cứu đề tài có ý nghĩa thực tiễn Các chủng vikhuẩn có ích mang enzymephân hủy AHLs sửdụng để ức chế phát triển vikhuẩn gây bệnhthốinhũn nhiều loài trồng có giá trị chuyển gen mã hóa enzyme vào trồng giúp trồng chống chịu với bệnh hại Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan khoaitây 1.1.1 Nguồn gốc địa lý phân bố khoaitâyKhoaitây có tên khoa học Solanum tuberosum, thuộc họ Cà (Solanaceae) Đây lồi nơng nghiệp ngắn ngày, trồng lấy củ chứa tinh bột Cây khoaitây có nguồn gốc vùng cao thuộc dãy núi Andes, Nam Mỹ du nhập vào Tây Ban Nha vào khoảng năm 1570 Anh Quốc vào năm 1590 Sau đó, lan truyền khắp châu Âu châu Á (Hawkes, 1994) Sau nhiều kỷ chọn lọc nhân giống, có nghìn lồi khoaitây khác Hơn 99% loài khoaitâytrồng toàn cầu có nguồn gốc từ nhiều giống khác vùng đất thấp Trung-Nam Chile, giống di dời từ cao nguyên Andes Trên giới, khoaitây coi lương thực có tầm quan trọngđứng hàng thứ tư sau lúa mì, lúa nước ngô (Steveson cs., 2001) Năm 1890, người Pháp Giám đốc Vườn bách thảo Hà Nội đem hạt khoaitâytrồng thử nước ta Điều kiện khí hậu nhiệt đới gió mùa, mùa đơng có nhiệt độ trung bình 15 – 250C, thuận lợi cho khoaitâysinh trưởng phát triển Vào năm 1980, Việt Nam trở thành nước sản xuất khoaitây lớn Đông Nam Á với 100.000 diện tích trồng (Batt., 2002) Khoaitây trở thành lương thực có tầm quan trọng thứ ba sau lúa ngô Việt Nam Tuy nhiên, theo thống kê Tổ chức Nông lương Liên hợp quốc (FAO), năm gần diện tích trồngkhoaitây dao động khoảng 35.000 - 40.000 (Bảng 1.1) Trong 90% diện tích tập trung tỉnh thuộc đồng Bắc Bộ, số miền núi phía Bắc Trung Bộ, 0,5% diện tích lại trồng Đà Lạt (Lâm Đồng) (Phạm Xuân Tùng, 2001) Bảng 1.1: Tình hình sản xuất khoaitây Việt Nam giai đoạn 2005-2011 Năm Diện tích (ha) Sản lượng (tấn) 35.000 Năng suất (Tấn/ha) 10,6 2005 2006 37.613 11,1 419.161 2007 38.450 11,4 436.710 2008 41.160 11,8 486.184 2009 37.544 11,7 442.791 2010 37.100 12,0 446.200 2011 40.046 11,2 448.710 370.000 (Nguồn: FAO, 2012) Năng suất khoaitây trước thường đạt tấn/ha, cao 18-20 tấn/ha Từ năm 1981 đến nay, suất bình quân đạt gần 12 tấn/ha, cao đạt 35-40 tấn/ha, có thời điểm khoaitây xuất sang Nga (có năm tới 1.000 tấn) Khi lương thực lúa gạo ngơ dồi khoaitây nghiên cứu theo hướng chất lượng hiệu 1.1.2 Đặc điểm nông sinh học KhoaitâyKhoaitây thân thảo, tán gọn, ưa lạnh, phát triển khoảng 60 cm chiều cao, khoaitây có thời gian sinh trưởng ngắn 80-100 ngày, chết sau hoa Hoa có màu trắng, hồng, đỏ, xanh, màu tím, nhụy hoa màu vàng Khoaitây thụ phấn chủ yếu trùng, ong vò vẽ mang phấn hoa từ đến khác Sau khoaitây hoa, số giống cho màu xanh giống màu xanh trái cà chua anh đào, chứa 300 hạt (Wikipedia) 1.1.3 Vai trò KhoaitâyKhoaitây nguồn cung cấp lương thực dồi Theo báo cáo Tổ chức Nông Lương Liên Hợp Quốc (FAO) sản lượng khoaitây toàn Thế giới đến năm 2010 320 triệu tấn, 2/3 thức ăn trực tiếp người, lại thức ăn cho động vật nguyên liệu sản xuất tinh bột Ở Việt Nam, khoaitây nhập vào từ năm 1890 Do có giá trị kinh tế cao, thuộc nhóm ưa lạnh nên có lợi sản xuất vụ đơng, thời gian sinh trưởng ngắn, dễ trồng, tốn cơng chăm sóc, phù hợp với nhiều loại đất trồng nên khoaitây trở thành trồng xóa đói giảm nghèo cho bà nông dân nhiều địa phương thuộc tỉnh miền Bắc Thái Bình, Lạng Sơn, Yên Bái,… (Nguồn báo điện tử: Thái Bình, Lạng Sơn, Yên Bái) Tuy nhiên, ngành Nông nghiệp Việt Nam cung cấp 80% nhu cầu tiêu dùngkhoaitây nước, phải nhập gần 100.000 khoaitây hàng năm Khoaitây thực phẩm có giá trị dinh dưỡng cao, có 2% protein bao gồm lysine (một axit amin thường khơng có protein thực vật) nên phối hợp tốt với ngũ cốc Trong protein khoaitây có số axit amin tự chất kiềm purin Giá trị sinh học khoaitây tương đối cao lên tới 75% (theo phương pháp Mittchell) Người ta tính khoảng 200g khoaitây nướng vỏ cung cấp 844mg Kali (gấp đôi chuối), 28% phần sắt hàng ngày, 43% phần vitamin C, 35% phần vitamin B6 nhiều chất khác niacin, thiamin, folat… Việc sửdụngkhoaitây làm thực phẩm khuyến khích số nhà khoa học Viện Thực phẩm Anh phát hiện, khoaitây có hợp chất sinh học cucoamin có tác dụng làm giảm huyết áp ăn thường xuyên chữa bệnh “ngủ” Châu Phi Không sửdụng để làm lương thực thực phẩm khoaitâysửdụng y dược Qua nghiên cứu, GS Venket Rao, Khoa Dinh dưỡng Trường đại học Y Toronto, Canada, phát thấy khoaitây có nhiều chất chống oxy hóa Nó có khả ngăn ngừa q trình lão hóa, hạn chế phát triển ung thư số bệnh khác Còn nhà nghiên cứu Đại học Y Harvard, Mỹ, phát người thường xuyên ăn khoaitây có khả giảm ung thư tuyến tiền liệt 1.2 Bệnhthốinhũnkhoaitây 1.2.1 Tác nhân gây bệnh tác hại bệnhTrong điều kiện thời tiết khí hậu nước ta năm gần nắng nóng, mưa nhiều đan xen nhiều bão liên tục điều kiện thuận lợi cho loài vikhuẩn gây bệnhtrồngBệnhvikhuẩn gây nguy hiểm gây nhiều khó khăn cho cơng tác phòngtrừ bảo quản Thời gian ủ bệnh khó phát gây thiệt hại lớn thời kỳ sinh trưởng thời gian bảo quản, lưu trữ nông phẩm Đối với khu vực sản xuất thuộc vùng nhiệt đới bệnhthốinhũnkhoai tây, cà rốt, hành tây, bắp cải….chủ yếu vikhuẩn Erwinia gây nên Những nghiên cứu trước kết luận vikhuẩn gây thốinhũnkhoaitây có ba lồi: Erwinia carotovora pv carotovora (Ecc), Erwinia carotovora pv atroseptica (Eca) E chrysanthemi (Ech) Trong Ecc lồi chủ yếu gây bệnhthốinhũncủkhoaitây (Jerenial), (Randall cs) Vikhuẩn phổ biến bề mặt, vết thương củkhoaitây sau thu hoạch Ecc gây bệnh vùng khí hậu ơn đới nhiệt đới, có phổ ký chủ rộng Ecc cưtrú đất, nước sơng, hồ chí đại dương Vikhuẩn nhân lên tồn vùng rễ nhiều chủ khơng phải chủ nhiều lồi cỏ dại Hai loài Eca Ech tác nhân gây bệnhthối đen 10 ... ti n hành ch n nghi n cứu đề tài Ph n l p xác định đặc tính enzyme N- acyl- L- homoserine lactone (AHL) lactonase vi khu n nội sinh sử dụng phòng trừ bệnh thối nh n củ khoai tây với hy vọng hướng... VÀ ĐÀO TẠO VI N KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VI T NAM VI N SINH THÁI VÀ TÀI NGUY N SINH VẬT *** PH N L P VÀ XÁC ĐỊNH ĐẶC TÍNH ENZYM N- ACYL- L- HOMOSERINE LACTONE (AHL) LACTONASE CỦA VI KHU N NỘI... N- acyl- Lhomoserine lactones (AHLs), AHL lactonase chủng vi khu n nội sinh sử dụng phòng trừ bệnh thối nh n củ khoai tây Yêu cầu đề tài - Ph n l p xác định khả ph n hủy AHLs vi khu n nội sinh từ cà dại - Thử nghiệm