phân lập và xác định đặc tính sinh học của vi khuẩn salmonella tại một số trang trại lợn nuôi theo quy mô công nghiệp ở miền bắc

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRĐ ĐỜNG ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI - - NGUYỄN MẠNH PHƯƠNG PHÂN LẬP VÀ XÁC ðỊNH ðẶC TÍNH SINH HỌC CỦA VI KHUẨN SALMONELLA TẠI MỘT SỐ TRANG TRẠI LỢN NUÔI THEO QUY MÔ CÔNG NGHIỆP Ở MIỀN BẮC LUẬN VĐ ĐN THẠC SĨ NÔNG NGHIỆP Chuyên ngành : THÚ Y Mã số : 60.62.50 Người hướng dẫn khoa học: TS Nguyễn Bá Tiếp Hµ néi - 2011 LỜI CAM ðOAN Tôi xin cam ñoan ñây công trình nghiên cứu riêng Các số liệu, kết nêu luận văn trung thực chưa ñược công bố công trình khác Các tài liệu tham khảo, trích dẫn ñều có nguồn gốc rõ ràng Hà Nội, ngày 10 tháng 10 năm 2011 Tác giả Nguyễn Mạnh Phương Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………………… i LỜI CẢM ƠN Tôi xin chân thành cảm ơn sợ giúp ñỡ thầy cô giáo Viện ðào tạo Sau ñại học Khoa Thú y – Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội ñã giành nhiều thời gian, công sức giúp ñỡ trình học tập thực ñề tài Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn TS Nguyễn Bá Tiếp Bộ môn Giải phẫu – Tổ chức Khoa Thú y trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội, PGS.TS Cù Hữu Phú trưởng Bộ môn Vi trùng – Viện Thú y Quốc gia, Th.S Văn Thị Hường Bộ môn Vi trùng – Viện Thú y Quốc gia, B.S Natipong Lampa giám ñốc Phòng thí nghiệm Công ty C.P Việt Nam ñã tận tình giúp ñỡ, hướng dẫn trình thực hoàn thành luận văn Xin chân thành cám ơn cán công nhân viên chức Bộ môn Vi trùng – Viện Thú y Quốc gia, cán công nhân viên chức Phòng thí nghiệm Công ty C.P Việt Nam ñã tạo ñiều kiện giúp ñỡ trình nghiên cứu thực ñề tài Tôi xin gửi lời cảm ơn tới người thân gia ñình, bạn bè, ñồng nghiệp ñộng viên, giúp ñỡ trình hoàn thành luận văn Hà Nội, ngày 10 tháng 10 năm 2011 Tác giả Nguyễn Mạnh Phương Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………………… ii MỤC LỤC LỜI CAM ðOAN i LỜI CẢM ƠN .ii MỤC LỤC iii DANH MỤC CÁC BẢNG vi DANH MỤC SƠ ðỒ, HÌNH vii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT viii Phần I ðẶT VẤN ðỀ 1.1 Tính cấp thiết ñề tài 1.2 Mục ñích nghiên cứu 1.3 Ý nghĩa thực tiễn ñề tài 1.4 Ý nghĩa khoa học ñề tài Phần II TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Tình hình nghiên cứu vi khuẩn Salmonella bệnh chúng gây 2.1.1 Tình hình nghiên cứu giới 2.1.2 Tình hình nghiên cứu nước 2.2 Một số ñặc ñiểm vi khuẩn Salmonella 2.2.1 ðặc ñiểm hình thái 2.2.2 Tính chất nuôi cấy 2.2.3 ðặc tính sinh hoá 2.2.4 Sức ñề kháng vi khuẩn Salmonella 2.2.5 ðặc ñiểm dịch tễ học vi khuẩn Salmonella 10 2.2.6 Cấu trúc kháng nguyên vi khuẩn Salmonella 11 2.2.7 Các yếu tố gây bệnh vi khuẩn Salmonella 13 2.3 Bệnh vi khuẩn Salmonella gây lợn 17 2.3.1 Thể nhiễm trùng huyết S.choleraesuis chủng kunzendorf 17 Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………………… iii 2.3.2 Thể viêm ruột S typhimurium 19 2.4 Biện pháp phòng trị bệnh Salmonella gây lợn 21 2.4.1 Phòng bệnh 21 2.4.2 ðiều trị bệnh 21 Phần III ðỐI TƯỢNG, NỘI DUNG, NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23 3.1 ðối tượng, ñịa ñiểm nghiên cứu 23 3.1.1 ðối tượng 23 3.1.2 ðịa ñiểm 23 3.2 Nội dung nghiên cứu 23 3.3 Nguyên liệu dùng nghiên cứu 23 3.3.1 Mẫu thí nghiệm 23 3.3.2 Các loại môi trường thông thường ñặc hiệu dùng ñể nuôi cấy, phân lập giám ñịnh vi khuẩn Salmonella 24 3.3.3 Các loại hóa chất 24 3.3.4 Các loại kháng huyết chuẩn ñể ñịnh typ vi khuẩn Salmonella 24 3.3.5 Các loại hóa chất, Primer chủng vi khuẩn dùng cho phản ứng PCR 24 3.3.6 Dụng cụ, trang thiết bị máy móc phòng thí nghiệm 25 3.4 Phương pháp nghiên cứu 25 3.4.1 Phương pháp lấy mẫu 25 3.4.2 Phương pháp nuôi cấy, phân lập vi khuẩn Salmonella 25 3.4.3 Phương pháp giám ñịnh vi khuẩn Salmonella phân lập ñược 27 3.4.4 Phương pháp xác ñịnh serotyp vi khuẩn Salmonella 29 3.4.5 Phương pháp xác ñịnh khả mẫn cảm với kháng sinh 31 3.4.6 Xác ñịnh số yếu tố gây bệnh (ñộc tố ñường ruột (Stn), yếu tố xâm nhập (InvA) chủng Salmonella phương pháp PCR 32 3.4.7 Kiểm tra ñộc lực chủng Salmonella phân lập ñược phương pháp tiêm truyền qua ñộng vật thí nghiệm 34 Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………………… iv 3.4.8 Phương pháp bố trí thí nghiệm thử nghiệm số phác ñồ ñiều trị 35 Phần IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 36 4.1 Kết phân lập vi khuẩn Salmonella từ trang trại nuôi lợn công nghiệp miền Bắc 36 4.2 Kết phân lập vi khuẩn Salmonella từ mẫu nước: 40 4.3 Kết phân lập vi khuẩn Salmonella từ mẫu quan lợn nghi mắc bệnh 43 4.4 Kết giám ñịnh số ñặc tính nuôi cấy sinh hóa chủng Salmonella phân lập ñược 46 4.5 Kết xác ñịnh serotyp chủng vi khuẩn Salmonella phân lập ñược 50 4.6 Kết kiểm tra mức ñộ mẫn cảm chủng Salmonella phân lập ñược với số loại kháng sinh 52 4.7 Kết kiểm tra ñộc lực chủng Salmonella phân lập ñược 54 4.8 Kết xác ñịnh số yếu tố gây bệnh chủng vi khuẩn Salmonella phân lập ñược 56 4.9 Kết số phác ñồ ñiều trị tiêu chảy Salmonella 59 Phần V KẾT LUẬN VÀ ðỀ NGHỊ 62 5.1 Kết luận: 62 5.2 ðề nghị: 62 TÀI LIỆU THAM KHẢO 63 Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………………… v DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 3.1 Bảng ñánh giá mức ñộ mẫn cảm vi khuẩn với số loại kháng sinh 32 Bảng 3.2 Trình tự cặp mồi kích thước sản phẩm xác ñịnh số yếu tố gây bệnh chủng Salmonella phân lập ñược 33 Bảng 4.1 Kết phân lập vi khuẩn Salmonella từ trang trại 36 Bảng 4.2 Kết phân lập vi khuẩn Salmonella mẫu phân 37 Bảng 4.3 Kết phân lập vi khuẩn Salmonella từ mẫu nước 41 Bảng 4.4 Kết phân lập Salmonella từ mẫu nước có xử lý chlorine mẫu nước không xử lý chlorine 42 Bảng 4.5 Kết phân lập vi khuẩn Salmonella từ phủ tạng 45 lợn nghi mắc bệnh 45 Bảng 4.6 Kết xác ñịnh hình thái, tính chất bắt màu, ñặc tính nuôi cấy chủng vi khuẩn Salmonella phân lập ñược……………………………… 48 Bảng 4.7 Kết giám ñịnh số ñặc tính sinh hoá chủng vi khuẩn Salmonella phân lập ñược 50 Bảng 4.8 Kết xác ñịnh serotyp chủng vi khuẩn Salmonella phân lập ñược 51 Bảng 4.9 Kết kiểm tra mức ñộ mẫn cảm với số loại kháng sinh chủng vi khuẩn Salmonella phân lập ñược 53 Bảng 4.10 Kết kiểm tra ñộc lực chủng Salmonella phân lập ñược phương pháp tiêm truyền qua chuột nhắt trắng 54 Bảng 4.11 Kết kiểm tra số yếu tố gây bệnh chủng 57 vi khuẩn Salmonella phân lập ñược 57 Bảng 4.12 Các phác ñồ thử nghiệm ñiều trị tiêu chảy Salmonella 60 Bảng 4.13 Kết thử nghiệm số phác ñồ 61 ñiều trị tiêu chảy Salmonella 61 Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………………… vi DANH MỤC SƠ ðỒ, HÌNH Hình 4.1 So sánh tỷ lệ phân lập ñược Salmonella từ trang trại lợn có triệu chứng tiêu chảy tỉnh 37 Hình 4.2 So sánh kết phân lập vi khuẩn Salmonella mẫu phân 38 Hình 4.3: Lợn bị nhiễm Salmonella biểu tím tai, tím vùng bụng 39 Hình 4.4: Lợn bị tiêu chảy Salmonella phân vàng, nước 39 Hình 4.5 So sánh tỷ lệ nhiễm Salmonella nguồn nước uống 41 Hình 4.6 So sánh tỷ lệ nhiễm Salmonella nước 42 trang trại không xử lý nước chlorine tỉnh 42 Hình 4.7: Mổ khám lợn tiêu chảy nghi Salmonella 44 Hình 4.8: Ruột xuất huyết, có màng giả 44 Hình 4.9 So sánh tỷ lệ phân lập vi khuẩn Salmonella từ phủ tạng lợn nghi mắc bệnh 45 Hình 4.10: Khuẩn lạc Salmonella môi trường CHROM 47 Hình 4.11: Khuẩn lạc Salmonella môi trường DHL 47 Hình 4.12 Vi khuẩn Salmonella môi trường TSI môi trường LIM 49 Hình 4.13 So sánh tỷ lệ chủng Salmonella phân lập ñược 51 Hình 4.14 & 4.15: Mổ khám chuột chết sau tiêm canh trùng Salmonella 55 Hình 4.16 So sánh tỷ lệ dương tính với số yếu tố gây bệnh vi khuẩn Salmonella kiểm tra phương pháp PCR 57 Hình 4.17 Sản phẩm PCR xác ñịnh gen sản sinh ñộc tố ñường ruột yếu tố xâm nhập với ñối chứng tương ứng giếng (259 bp 521 bp); ñối chứng âm (giếng 6&7); mẫu dương tính với Stn (giếng 1,3,4) với InvA (1,2,3,4); giếng 8, thang chuẩn 1000 bp 58 Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………………… vii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ADP Adenosine DiPhosphate ATP Adenosine TriPhosphate BHI Brain Heart Infusion BPW Buffered Pepton Water CHO Chinese Hamster Ovary Cell CIRAD Centre de Cooperation Internationale en Recherche Agronomique pour le Developpement DHL Deoxycholate Hydrogen sulfide Lactose DNA Deoxyribo Nucleic Acid DPF Delayer Permebility Factor EDTA Ethylene Diamine Tetra Acetic acid ETEC EnteroToxigenic E coli GDP Guanin DiPhosphate GTP Guanin TriPhosphate InvA Invasion A LIM Lysine Indole Motility LPS LipoPolySaccharide LT Heat- Labile Toxin mARN Messenger Acide RiboNucleotide PCR Polymerase Chain Reaction RPF Rapid Permebility Factor RV Rappaports Vassiliadis ST Heat- stabile Toxin Stn Salmonella toxin TSI Triple- Sugar- Iron Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………………… viii Phần I ðẶT VẤN ðỀ 1.1 Tính cấp thiết ñề tài Chăn nuôi công nghiệp tác ñộng tích cực ñến trình nhiễm trùng phát bệnh truyền nhiễm Thực tế cho thấy trang trại vật nuôi mắc số loại bệnh ðây kết quy trình tiêm vacxin, hạn chế phát triển tiếp xúc với vật chủ trung gian truyền bệnh, sử dụng thuốc ñiều trị quy trình khác Tuy vậy, tính kháng thuốc vi sinh vật gây bệnh nguyên nhân làm giảm hiệu ñiều trị thuốc, tăng nguy nhiễm bệnh gây thiệt hại kinh tế (EMEA, 2006) Vi sinh vật gây bệnh có khả biến ñổi phạm vi loài vật chủ hay tương tác vật chủ với thân vi sinh vật ñó Có nhiều tiêu ñánh giá mức biến ñổi vi sinh vật theo yếu tố không gian thời gian Những tiêu thường ñược quan tâm gồm thành phần loài, typ, subtyp, ñặc tính sinh hóa, ñộc lực, khả ñề kháng với tác nhân hóa học ñặc biệt thuốc sát trùng kháng sinh Nhiều thay ñổi ñược tạo biến ñổi di truyền than vi sinh vật Các biến ñối vi khuẩn virus theo thời gian ñã ñang thách thức chiến lược nghiên cứu, sản xuất sử dụng vacxin kháng sinh chăn nuôi mà hậu cuối dịch bệnh sảy ra, gây tổn thất kinh tế (Baxendale, 1996) Ảnh hưởng dây chuyền mang tính tuần hoàn tác ñộng làm thay ñổi ñặc tính sinh học vật nuôi sức khỏe người Một nhóm ñối tượng vi sinh vật gây bệnh ñược quan tâm vi khuẩn gây hội chứng tiêu chảy Mặc dù chuồng trại ñược thiết kế khoa học (chuồng kín, có hệ thống ñiều hòa không khí…) biện pháp phòng bệnh ñược trọng hơn, hàng năm hội chứng tiêu chảy mà ñó có nguyên nhân vi khuẩn Salmonella thường xuyên xảy gây Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………………… (1996) Các mẫu giấy thử kháng sinh dùng nghiên cứu hãng OXOID sản xuất Kết ñược trình bày bảng 4.9 Bảng 4.9 Kết kiểm tra mức ñộ mẫn cảm với số loại kháng sinh chủng vi khuẩn Salmonella phân lập ñược Rất mẫn cảm Mẫn cảm trung Tỷ lệ mẫn bình cảm Số TT Tên kháng sinh Kháng chủng kiểm tra (+) (%) (+) (1) (%) (2) (1) + (2) (+) (%) Gentamycin 31 3,22 10 32,26 35,48 20 64,52 Colistin 31 16,13 10 32,26 48,39 16 51,61 Tetracyclin 31 0,00 3,22 3,22 30 96,78 Kanamycin 31 0,00 29,03 29,03 22 70,97 Streptomycin 31 0,00 0,00 0,00 31 100,00 Sulfatrimethoprime 31 0,00 6,45 6,45 29 93,55 Norfloxacin 31 12,90 12 38,71 51,61 15 48,39 Amoxicillin 31 0,00 3,22 3,22 30 96,77 Ampicillin 31 0,00 3,22 3,22 30 96,77 10 Apramicin 31 25,80 10 32,26 58,06 13 41,94 11 Enrofloxacin 31 0,00 12,90 12,90 27 87,10 Kết bảng 4.9 cho thấy: Các chủng vi khuẩn Salmonella phân lập ñược ñều kháng hoàn toàn với Streptomycin Tỷ lệ kháng Tetracyclin, Amoxicillin Ampicillin (96,77%) tỷ lệ kháng Sulfatrimethoprime tới 93,55% Các chủng Salmonella mẫn cảm cao với Apramicin (58,06%) tiếp ñến Norfloxacin (51,61%) Colistin (48,39%) Tỷ lệ chủng mẫn cảm với Gentamycin, Kanamycin, Enrofloxacin ñều 40% Theo Phùng Quốc Chướng (1995), vi khuẩn Salmonella mẫn cảm với Norfloxacin Ciprofloxacin Kết nghiên cứu Tô Liên Thu (2005) cho biết Salmonella phân lập ñược từ thịt lợn mẫn cảm cao với Norfloxacin (90%), Ofloxacin (90%) Gentamycin (90%) Nghiên cứu cho thấy, không xét riêng chủng vi khuẩn, ñã có thay ñổi tỷ lệ chủng Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………………… 53 Salmonella mẫn cảm với loại kháng sinh (tỷ lệ mẫn cảm giảm so với nghiên cứu ñã ñược công bố) Như thấy tác dụng nhiều loại kháng sinh ñối với vi khuẩn Salmonella ñã giảm 4.7 Kết kiểm tra ñộc lực chủng Salmonella phân lập ñược Trong số serotyp ñược phát hiện, serotyp chọn ngẫu nhiên chủng ñể kiểm tra ñộc lực phương pháp tiêm truyền qua chuột nhắt trắng (2ml canh trùng /chuột; tiêm phúc mạc); chuột ñối chứng (2ml môi trường BHI /chuột; tiêm phúc mạc) Kết ñược trình bày bảng 3.9 Bảng 4.10 Kết kiểm tra ñộc lực chủng Salmonella phân lập ñược phương pháp tiêm truyền qua chuột nhắt trắng Liều Serotyp tiêm (ml) S.agona 0,2 S.meleagridis 0,2 S.ruzizi 0,2 S.typhimurium 0,2 S.anatum 0,2 ðối chứng (BHI) 0,2 ðường tiêm Phúc mạc Phúc mạc Phúc mạc Phúc mạc Phúc mạc Phúc mạc Kết theo dõi Kết phân lập Số Thời gian Thời gian chuột chuột chuột thử chết sớm chết muộn nhất 13 17 100,00 + 15 20 100,00 + 16 20 100,00 + 12 100,00 + 10 14 100,00 + 0 0,00 Số Tỷ lệ chết vi khuẩn từ chuột chết Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………………… 54 Hình 4.14 & 4.15: Mổ khám chuột chết sau tiêm canh trùng Salmonella Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………………… 55 Kết bảng 4.10 cho chủng nghiên cứu gấy chết 100% chuột nhắt trắng Thời gian gây chết chuột thí nghiệm sớm 10 sau tiêm (ñối với S typhimurium S anatum) gây chết muộn 26 sau tiêm (ñối với S.ruzizi) Những chuột chết ñược mổ khám, lấy máu tim, nuôi cấy phân lập vi khuẩn Salmonella Tất mẫu máu từ chuột chết ñều phân lập ñược vi khuẩn Salmonella Kết tiêm truyền ñộng vật thí nghiệm cho thấy chủng Salmonella phân lập ñược ñều có ñộc lực cao chứng tỏ vi khuẩn Salmonella nguyên nhân quan trọng gây tiêu chảy ñàn lợn trang trại thuộc nghiên cứu 4.8 Kết xác ñịnh số yếu tố gây bệnh chủng vi khuẩn Salmonella phân lập ñược Chúng ñã tiến hành xác ñịnh gen quy ñịnh ñộc tố (Salmonella toxin; Stn) yếu tố xâm nhập (Invation A; InvA) phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) Ưu ñiểm phương pháp ñộ nhạy ñộ ñặc hiệu cao, thực với số lượng mẫu lớn cho kết nhanh, xác thời gian ngắn Các cặp mồi thích hợp ñược sử dụng phản ứng PCR ñể xác ñịnh số yếu tố ñộc lực chủng vi khuẩn Salmonella bao gồm (1) Stn – F (mồi xuôi) Stn – R (mồi ngược) dùng ñể xác ñịnh gen sản sinh ñộc tố ñường ruột Stn (cho kích cỡ sản phẩm 259 bp), (2) InvA – F (mồi xuôi) InvA – R (mồi ngược) ñể xác ñịnh gen ñịnh yếu tố xâm nhập InvA (cho kích cỡ sản phẩm 521 bp) Các bước tiến hành phản ứng PCR ñã mô tả phần phương pháp nghiên cứu Kết xác ñịnh gen quy ñịnh ñộc tố ñược trình bày bảng 4.11 Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………………… 56 Bảng 4.11 Kết kiểm tra số yếu tố gây bệnh chủng vi khuẩn Salmonella phân lập ñược Yếu tố gây bệnh TT Số chủng Serotyp Stn kiểm tra InvA (+) (%) (+) (%) S.agona 80,00 100,00 S.meleagridis 50,00 100,00 S.ruzizi 50,00 50,00 S.typhimurium 16 16 100,00 16 100,00 S.anatum 83,33 100,00 Tổng 31 27 87,10 30 96,77 100 100 100 100 100 96,77 100 83,33 80 87,1 Tỷ lỷ % 80 60 50 50 50 Stn InvA 40 20 S.agona S.meleagridis S.ruzizi S.typhimurium S.anatum Average Serotyp Hình 4.16 So sánh tỷ lệ dương tính với số yếu tố gây bệnh vi khuẩn Salmonella kiểm tra phương pháp PCR Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………………… 57 Hình 4.17 Sản phẩm PCR xác ñịnh gen sản sinh ñộc tố ñường ruột yếu tố xâm nhập với ñối chứng tương ứng giếng (259 bp 521 bp); ñối chứng âm (giếng 6&7); mẫu dương tính với Stn (giếng 1,3,4) với InvA (1,2,3,4); giếng 8, thang chuẩn 1000 bp Kết bảng 4.11 cho thấy tổng số 31 chủng Salmonella ñược kiểm tra, có 27 chủng mang gen Stn (chiếm tỷ lệ 87,10%); 30 chủng mang gen InvA (chiếm 96,77%) - Tất chủng thuộc serotyp S typhimurium ñược kiểm tra có mang hai gen Stn InvA - Tất chủng thuộc serotyp S.anatum mang gen InvA có chủng mang gen Stn (83,33%) - Trong số chủng thuộc serotyp S.agona, chủng mang gen Stn (80,00%) tất chủng mang gen InvA - Cả hai chủng thuộc serotyp S.meleagridis mang gen InvA ñó chủng chứa gen Stn Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………………… 58 - Trong số chủng S.ruzizi ñược kiểm tra chủng có chứa gen Stn chủng có gen InvA Từ kết cho thấy: Hầu hết chủng Salmonella mang gen mã hóa yếu tố xâm nhập (tỷ lệ chung mang gen tới 96,77%, có chủng thuộc serotyp S.ruzizi không mang gen này) Các chủng thuộc serotyp S typhimurium ñều mang gen quy ñịnh ñộc tố Tỷ lệ chủng mang gen quy ñịnh ñộc tố cao serotyp S.anatum S.agona ðối với serotyp khác, số chủng nghiên cứu chưa ñủ lớn nên tỷ lệ mang yếu tố ñộc lực yếu tố xâm nhập chưa cao Kết xác ñịnh gen quy ñịnh yếu tố xâm nhập gen quy ñịnh ñộc tố cho thấy khả gây bệnh cao Salmonella sở chăn nuôi ðặc biệt với S.typhimurium, serotyp có tỷ lệ phát hiện, tỷ lệ mang yếu tố ñộc lực yếu tố xâm nhập cao 4.9 Kết số phác ñồ ñiều trị tiêu chảy Salmonella Dựa kết kiểm tra kháng sinh ñồ Salmonella, ñã lựa chọn kháng sinh hóa dược ñiều trị theo phác ñồ Nguyên tắc ñiều trị ức chế, tiêu diệt vi khuẩn, chống nước ñiện giải, kết hợp với vệ sinh chăm sóc tốt Chúng tiến hành ñiều trị thử nghiệm 14 trang trại, trang trại 40 chia lô với phác ñồ, phác ñồ kết hợp dùng kháng sinh ñiều trị bổ xung muối, ñiện giải ñã nêu phần phương pháp thí nghiệm Ba loại kháng sinh ñược sử dụng Norfloxacin, Colistin, Apramicin Các kháng sinh có tác dụng mạnh với vi khuẩn gram (-) theo kết kháng sinh ñồ mẫn cảm với Salmonella: Apramicin (58,06%), Norfloxacin (51,61%), Colistin (48,39%) Norfloxacin kháng sinh thuộc nhóm Fluoroquinolin, chế tác dụng Norfloxacin ức chế enzyme DNA-gyrase (enzyme tham gia trình tổng hợp nhân vi khuẩn) ức chế nhân lên vi khuẩn Thuốc có tác dụng hiệp ñồng với nhóm Aminoglucozid nhóm Polymycin Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………………… 59 Phác ñồ sử dụng kết hợp Norfloxacin với Colistin Colistin kháng sinh thuộc nhóm Polymycin, chế tác dụng Colistin phá màng vi khuẩn Kết hợp có tác dụng cộng hưởng làm tăng tác dụng lẫn Phác ñồ sử dụng kết hợp Norfloxacin với Apramicin Apramicin kháng sinh thuộc nhóm Aminoglucozid, chế tác dụng ức chế tổng hợp protein vi khuẩn Hai kháng sinh có tác dụng hiệp ñồng Các phác ñồ ñược trình bày bảng 4.12 Bảng 4.12 Các phác ñồ thử nghiệm ñiều trị tiêu chảy Salmonella Phác ñồ Chế phẩm Hoạt chất Liều dùng Nor-100 Nofloxacin 1ml/6kg thể trọng Muối ñiện giải Ampicillin + colistin Muối ñiện giải 1ml/10kg thể trọng Nor-100 Nofloxacin 1ml/6kg thể trọng Colistinsunfat Colistin 5mg/1kg thể trọng Noptress Muối ñiện giải 1g/20kg thể trọng Nor-100 Nofloxacin 1ml/6kg thể trọng Apralan Apramicin 15mg/1kg thể trọng Noptress Muối ñiện giải 1g/20kg thể trọng Noptress Ampisure Noptress 1g/20kg thể trọng 1g/20kg thể trọng Cách dùng Tiêm bắp 1lần/ngày Hòa nước cho uống Tiêm bắp 1lần/ngày Hòa nước cho uống Tiêm bắp 1lần/ngày Hòa nước cho uống Hòa nước cho uống Tiêm bắp 1lần/ngày Hòa nước cho uống Hòa nước cho uống Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………………… 60 Do khó khăn việc bố trí thí nghiệm nên tiến hành thử nghiệm ñiều trị theo dõi kết ñiều trị ngày Những lợn ñược ñiều trị sau ngày không khỏi ñược ñiều trị phác ñồ khác phù hợp Kết ñiều trị ñược trình bày bảng 4.13 Bảng 4.13 Kết thử nghiệm số phác ñồ ñiều trị tiêu chảy Salmonella Phác Số trại ñồ thí nghiệm Số lợn ñiều trị Kết ñiều trị sau ngày Chưa Khỏi Chết khỏi Tỷ lệ (%) Khỏi Chết Chưa khỏi 14 140 78 13 49 55,71 9,29 35,00 14 140 82 10 48 58,57 7,14 34,29 14 140 113 22 80,71 3,57 15,72 14 140 120 16 85,71 2,86 11,43 Kết cho thấy phác ñồ cho hiệu ñiều trị tốt nhất, tỷ lệ lợn khỏi sau ngày 85,71% tỷ lệ chết thấp 2,86% Kết phù hợp với kết kháng sinh ñồ Hiện ñưa Apramicin vào ñiều trị nên khả kháng lại Apramicin Salmonella chưa mạnh với kháng sinh khác, ñó khả ñiều trị tốt Phác ñồ kết hợp cho uống chế phẩm Apralan(50%) liều 30mg/1kg thể trọng, kết hợp với tiêm kháng sinh Norfloxacin (chế phẩm Nor-100) liều 1ml/8kg thể trọng, ñồng thời bổ xung muối ñiện giải cho lợn bệnh thu ñược kết tốt Phác ñồ có kết hợp Norfloxacin Colistin cho kết tốt thứ hai; tỷ lệ khỏi sau ngày 85,71% Nếu dung riêng loại kháng sinh phác ñồ phác ñồ hiệu ñiều trị khỏi sau ngày thấp hơn, chưa ñến 60% Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………………… 61 Phần V KẾT LUẬN VÀ ðỀ NGHỊ 5.1 Kết luận: 1.Tại trang trại chăn nuôi lợn quy mô công nghiệp có tượng vật nuôi mắc hội chứng tiêu chảy Tỷ lệ phân lập ñược Salmonella spp từ mẫu phân lợn tiêu chảy trang trại trung bình 40,63% Tỷ lệ phát Salmonella mẫu nước uống trang trại không dùng chlorine xử lý nước cao (36,36%) so với trại có dùng chlorine (0%) Dùng chlorine xử lý nước uống cho lợn có tác dụng hạn chế nhiễm khuẩn Salmonella nước Tỷ lệ phát S.typhimurium cao (51,61%) trang trại lợn thịt nuôi theo hướng công nghiệp miền Bắc 4.Chủng thuộc serotyp mang gen quy ñịnh ñộc tố yếu tố xâm nhập với tỷ lệ cao ðặc biệt 100% số chủng S.typhimurium ñược phát mang hai gen quy ñịnh ñộc tố yếu tố xâm nhập Cùng với tỷ lệ phát cao, nói cần ý ñến S.typhimurium chăn nuôi lợn thịt theo quy trình công nghiệp 5.Phác ñồ ñiều trị có phối hợp loại thuốc kháng sinh uống tiêm cho hiệu ñiều trị tốt sử dụng loại kháng sinh Phác ñồ 4, dùng chế phẩm Nor-100 tiêm bắp uống Apralan kết hợp uống ñiện giải cho hiệu ñiều trị tốt nhất, tỷ lệ khỏi sau ngày ñiều trị 85,71% 5.2 ðề nghị: Mở rộng ñối tượng nghiên cứu lứa tuổi lợn Nghiên cứu xác ñịnh thêm số yếu tố gây bệnh Salmonella như: yếu tố bám dính, gen kháng kháng sinh DT04… Mở rộng nghiên cứu auto vac-xin phòng bệnh Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………………… 62 TÀI LIỆU THAM KHẢO I Tài liệu nước Võ Thị Trà An, Nguyễn Ngọc Tuân, Lê Hữu Ngọc (2006), “Tình hình nhiễm Salmonella phân thân thịt (bò, heo, gà) số tỉnh phía Nam”, Tạp chí Khoa học kỹ thuật thú y, số 2, tr 37-42 Phùng Quốc Chướng (1995), Tình hình nhiễm Salmonella lợn vùng Tây Nguyên khả phòng trị Luận án PTS khoa học nông nghiệp, Trường ðại học Nông nghiệp I Hà Nội ðỗ Trung Cứ, Trần Thị Hạnh, Nguyễn Quang Tuyên (2001), “ Kết phân lập xác ñịnh số yếu tố gây bệnh vi khuẩn Salmonella spp gây bệnh phó thương hàn lợn số tỉnh miền núi phía Bắc” Tạp chí Khoa học kỹ thuật thú y, số 3, tr 10-17 ðỗ Trung Cứ (2004), Phân lập xác ñịnh yếu tố gây bệnh Salmonella lợn số tỉnh miền núi phía Bắc biện pháp phòng trị Luận án Tiến sỹ nông nghiệp, Viện Thú y Quốc gia ðỗ ðức Diên (1999), Vai trò E.coli Salmonella hội chứng tiêu chảy lợn Kim Bảng (Hà Nam) thử nghiệm số giải pháp phòng trị Luận văn Thạc sỹ Nông nghiệp, Trường ðại học Nông nghiệp I, Hà Nội Trương Văn Dung, Yoshihara Shinobu (2002), Cẩm nang chẩn ñoán tiêu chuẩn bệnh gia súc Việt Nam Viện Thú y Quốc gia Tổ chức hợp tác quốc tế Nhật Bản ðào Trọng ðạt, Phan Thanh Phượng, Lê Ngọc Mỹ (1995), Bệnh ñường tiêu hóa lợn NXB Nông nghiệp, tr 63- 96 Trần Xuân Hạnh (1995), “Phân lập giám ñịnh vi khuẩn Salmonella lợn tuổi giết thịt” Tạp chí Khoa học kỹ thuật Thú y, số 3, tr 89-93 Nguyễn Bá Hiên (2001), Một số vi khuẩn ñường ruột thường gặp biến Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………………… 63 ñộng chúng gia súc khỏe mạnh bị tiêu chảy nuôi vùng ngoại thành Hà Nội Luận án Tiến sĩ Nông nghiệp, Trường ðại học Nông nghiệp I, Hà Nội 10 Laval A (2000), “Dịch tễ Salmonellosis” Báo cáo hội thảo bệnh lợn Viện Thú y – Hà Nội tháng 6/2000, Tài liệu dịch Trần Thị Hạnh – Viện Thú y 11 Hồ Văn Nam, Nguyễn Thị ðào Nguyên, Trương Quang, Phùng Quốc Chướng, Chu ðức Thắng, Phạm Ngọc Thạch (1997), ” Bệnh viêm ruột ỉa chảy lợn”, Tạp chí khoa học kỹ thuật thú y, số 2, tr.39-45 12 Phạm Hồng Ngân (2010), Nghiên cứu số ñặc tính gây bệnh vi khuẩn Escherichia coli, Salmonella gây tiêu chảy bê sữa nuôi ngoại thành Hà Nội biện pháp phòng trị Luận án tiến sĩ nông nghiệp, Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội 13 Nguyễn Thị Nội, Nguyễn Ngọc Nhiên, Cù Hữu Phú (1989), “Enterobacteria in diarrhoea pig” Kết 20 năm nghiên cứu Viện Thú y (1969 – 1989), Hà Nội, tr 43 14 Nguyễn Thị Oanh (2003), Tình hình nhiễm số yếu tố gây bệnh vi khuẩn Salmonella vật nuôi (lợn, trâu, bò, nai, voi) ðăk Lăk Luận án Tiến sỹ Nông nghiệp, Trường ðại học Nông nghiệp I, Hà Nội 15 Cù Hữu Phú, Nguyễn Ngọc Nhiên, Vũ Bình Minh, ðỗ Ngọc Thuý (2000), “Phân lập vi khuẩn E.coli Salmonella lợn mắc bệnh tiêu chảy, xác ñịnh số ñặc tính sinh vật hoá học chủng vi khuẩn phân lập ñược biện pháp phòng trị” Kết nghiên cứu Khoa học kỹ thuật thú y (1996-2000), NXB Nông nghiệp, Hà Nội, tr 171-176 16 Nguyễn Vĩnh Phước (1970), Vi sinh vật học thú y NXB ðại học trung học chuyên nghiệp Hà Nội 17 Hoàng Thị Phi Phượng, Trần Thị Hạnh (2005), “Nghiên cứu ảnh hưởng thức ăn gây nhiễm E.coli Salmonella ñối với lợn sau cai sữa”, Tạp chí Khoa học kỹ thuật Thú y, số 1, tr 41 – 46 Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………………… 64 18 Phan Thanh Phượng (1988), Phòng chống bệnh phó thương hàn lợn NXB Nông thôn, Hà Nội 19 Lê Văn Tạo (1993), “Phân lập, ñịnh danh vi khuẩn Salmonella gây bệnh cho lợn” Báo cáo khoa học mã số KN 02 – 15, NXB Nông nghiệp, Hà Nội 20 Lê Văn Tạo, Nguyễn Thị Vui (1994), “Phân lập ñịnh typ vi khuẩn Salmonella gây bệnh cho lợn” Tạp chí Nông nghiệp công nghiệp thực phẩm, số 11, tr 430- 431 21 Nguyễn Như Thanh, Nguyễn Bá Hiên, Trần Thị Lan Hương 2001 Vi sinh vật Thú y NXB Nông nghiệp, Hà Nội 22 Tô Liên Thu (2005), Nghiên cứu tình trạng ô nhiễm số vi khuẩn vào thịt lợn, thịt gà sau giết mổ Hà Nội số phương pháp làm giảm nhiễm khuẩn thịt Luận án Tiến sỹ Nông nghiệp, Viện Thú y Quốc gia Hà Nội 23 Nguyễn Quang Tuyên (1996), Nghiên cứu ñặc tính số chủng Salmonella gây bệnh tiêu chảy bê nghé biện pháp phòng trị Luận án PTS Khoa học Nông nghiệp, Viện thú y quốc gia Hà Nội 24 Tạ Thị Vịnh, ðặng Khánh Vân (1996), “Bước ñầu thăm dò xác ñịnh E.coli Salmonella lợn bình thường lợn mắc hội chứng tiêu chảy Hà Tây Hà Nội” Tạp chí Khoa học kỹ thuật thú y, số 1, tr 41- 44 II Tài liệu nước 25 Asai T, Otagiri Y, Osumi T, Namimatsu T, Hirai H and Sato S (2002), “Isolation of Salmonella from Diarrheic Feces of Pig” J Vet Med Sci 64, 2, p 159- 160 26 Baxendale W (1996) Current methods of delivery of poultry vaccines In poultry immunology (Davison T.F., Morris T.R and Payne L.N., eds) Carfax Publishing company, Abingdon, UK, 375-387 27 CIRAD “Training Course Salmonella”, 23 – 37 October 2006 Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………………… 65 28 Cloeckaert A, Praud K, Doublet B, Demartin M and Weill F.X (2006), “Variant Salmonella genomic island J – L antibiotic resistance gene cluster in Salmonella enterica serovar Newport” Antimicrob Agents Chemother, 50, p 3944-3946 29 Cortez A.L.L, Carvalho A.C.F.B, Ikuno A.A, Bürger K.P and Vidal – Martins A.M.C (2006), “Identification of Salmonella spp isolates from chicken abattoirs by multiplex – PCR” Res Vet Sci, 81, p 340-344 30 EMEA (European Medical Agency) Reflection paper on the use of fluoroquinolones in food-producing animals in the European Union: Development of resistance and impact on human and animal health ðịa truy cập: http://www.fidin.nl/54601/EMEA-CVMP-reflection-paperfluroquinolones-food-producing-animals-EU-20060501.pdf Truy cập ngày 19 tháng 10 năm 2011 31 Kishima M, Uchidami, Namimatsu T, Osumi T, Takahashi S, Tanaka K, Aoki H, Matsuura K and Yamamoto K (2008), “Nationwide Surveillance of Salmonella in the Faeces of Pigs in Japan” 32 NCCLS (2000), Performance standards for antimicrobial disk susceptibility tests Approved standard, seventh edition edn Pennsylvania, USA: The National Committe for Clinical Laboratory Standards, p 5-10 33 Plonait H, Bickhardt (1997), “Salmonella infektion und Salmonellose Lehrbuch der Schweine Krankheuten”, Parey Buchverlag, Berlin, s.334338 34 Popoff M.Y (2001), Antigenic formulas of the Salmonella serovas , 8th edition WHO Collaborating Centre for reference and Research on Salmonella Institus Pasteur, Paris, France, p 156 35 Quinn P.J, Carter M.E, Makey B, Carter G.R (2002), Clinical veterinary microbiology Wolfe Pulishing, London WC1 H9LB, England, p 209-236 36 Selbitz H.J (1995), Grundsaetzliche Sicherheisanfornderungen bein Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………………… 66 Einsatz von lebendimpfstoffen bei lebensmittelliefernden Tieren Berl Much Tieruzl Wschr, 144, p 428-423 37 Schwartz K.J (1999), “Salmonellosis” In: Straw, B E., S D Allaire, W L Mengeling, and D J Taylo (eds), Disease of Swine, p 535-551 Iowa State University Press, Ames 38 Skyberg J.A, Logue C.M and Nolan L.K (2006),“Virulence genotyping of Salmonella spp with multiplex PCR“ Avian Dis, 50, p 77-81 39 Weinstein D.L, Carsiotis M, Lissner CH.R, Osrien A.D (1984), “Flagella help Samonella typhimurium survive within murine macrophages” Infection and Immuniti, 46 p 819-825 40 Wilcock B.P, Schwartz K.J (1992), “Salmonella” Disease of Swine, 7th Edition, p 570-583 Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………………… 67 [...]... nhỏ ñến năng xuất chăn nuôi Xuất phát từ vấn ñề trên, chúng tôi tiến hành nghiên cứu ñề tài: Phân lập và xác ñịnh ñặc tính sinh học của vi khuẩn Salmonella tại một số trang trại lợn nuôi theo quy mô công nghiệp ở Miễn Bắc 1.2 Mục ñích nghiên cứu - Phân lập chủng Salmonella tại các trang trại nghiên cứu - Xác ñịnh các ñặc tính sinh học của vi khuẩn Salmonella và vai trò của Salmonella trong hội chứng... lượng vi khuẩn thải ra theo phân, lượng vi khuẩn thải ra có tương quan thuận với lượng vi khuẩn ăn vào và ảnh hưởng ñến khả năng sinh trưởng của lợn, làm giảm mức ñộ tăng trọng và tăng lượng thức ăn tiêu tốn của lợn 2.2 Một số ñặc ñiểm của vi khuẩn Salmonella Vi khuẩn Salmonella thuộc bộ Eubacteriales, họ Enterobacteriaceae Giống Salmonella gồm 2 loài: S enterica và S bongori gồm trên 2000 serotyp theo. .. phát triển của vi khuẩn - Môi trường BPW, RV: dùng ñể tăng sinh vi khuẩn Salmonella - Môi trường thạch thường: dùng ñể kiểm tra hình thái, màu sắc khuẩn lạc của vi khuẩn Salmonella - Môi trường thạch máu (Blood Agar Base): dùng ñể giữ giống và kiểm tra khả năng dung huyết của vi khuẩn Salmonella - Môi trường thạch DHL: là môi trường ñặc biệt dùng ñể nuôi cấy, phân lập vi khuẩn Salmonella - Môi trường... – 20% Kết quả phân lập và xác ñịnh serotyp của vi khuẩn Salmonella gây bệnh ở lợn của Lê Văn Tạo (1993) cho thấy 50% các chủng phân lập ñược thuộc S choleraesuis; 12,5% S enteritidis; 6,25% S typhimurium và số còn lại thuộc các serotyp khác Trần Xuân Hạnh (1995) ñã phân lập và giám ñịnh vi khuẩn Salmonella ở lợn tại Thành phố Hồ Chí Minh cho kết quả: S typhisuis ở lợn bệnh là 16,9%; ở lợn bình thường... danh vi khuẩn phân lập ñược - Xác ñịnh ñộc lực và các yếu tố gây bệnh của Salmonella phân lập ñược - Thử nghiệm một số phác ñồ ñiều trị 3.3 Nguyên liệu dùng trong nghiên cứu 3.3.1 Mẫu thí nghiệm Mẫu thí nghiệm là phân và phủ tạng (hạch amidan, gan, lách, hạch màng treo ruột và hồi tràng) của lợn ốm và chết bị tiêu chảy có các triệu chứng của bệnh do vi khuẩn Salmonella Mẫu nước uống của lợn ở các trang. .. xét nghiệm và thí nghiệm: + Phòng thí nghiệm công ty cổ phần chăn nuôi C.P Vi t Nam + Phòng thí nghiệm bộ môn Vi trùng – Vi n Thú y.Quốc Gia 3.2 Nội dung nghiên cứu - Phân lập và xác ñịnh tỷ lệ nhiễm Salmonella ở mẫu xét nghiệm (mẫu phân, mẫu nước, mẫu cơ quan) từ lợn và các trang trại có lợn bị tiêu chảy ở 6 tỉnh miền Bắc - Xác ñịnh tỷ lệ nhiễm Salmonella trong nguồn nước uống ở khu vực chăn nuôi - ðịnh... ñường Giữ giống vi khuẩn Kiểm tra hình thái Xác ñịnh khả năng mẫn cảm kháng sinh Xác ñịnh các yếu tố ñộc lực Xác ñịnh serotyp Sơ ñồ 2.1 Quy trình phân lập và giám ñịnh vi khuẩn Salmonella từ các mẫu phân và phủ tạng Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………………… 26 3.4.3 Phương pháp giám ñịnh vi khuẩn Salmonella phân lập ñược 3.4.3.1 Kiểm tra hình thái học Dùng phương... Cứ, 2004) Tại Nhật Bản, Asai và cs (2002) cho thấy tỷ lệ nhiễm Salmonella ở lợn con theo mẹ là 4,5%, lợn sau cai sữa bị tiêu chảy là 12,4%; lợn vỗ béo là 17,3% Tác giả cũng cho biết S typhimurium ñược phân lập thấy nhiều nhất ở lợn sau cai sữa là 72,6%; lợn gần xuất chuồng là 73,8% Kishima và cs (2008) công bố tỷ lệ nhiễm và phân bố của vi khuẩn Salmonella trong phân lợn khỏe mạnh bình thường tại Nhật... chăn nuôi của trại (nước giếng khoan, nước giếng ñào, nước ao chứa) Nước ñược ñựng trong các chai thủy tinh vô trùng, bảo quản lạnh và vận chuyển về phòng thí nghiệm 3.4.2 Phương pháp nuôi cấy, phân lập vi khuẩn Salmonella ðược tiến hành dựa trên cơ sở quy trình phân lập và giám ñịnh vi khuẩn của Khoa Thú y ứng dụng và sức khỏe cộng ñồng, trường ðại học Nông nghiệp và thú y Obihiro, Nhật Bản, với một số. .. tố của chúng bị phá hủy bởi nhiệt ñộ .Và ñặc tính quan trọng của Cytotoxin làm tổn thương tế bào biểu mô Trên ñây là 3 loại ñộc tố gây bệnh chính của vi khuẩn Salmonella, chúng là các tác nhân trực tiếp, quy t ñịnh khả năng gây bệnh của vi khuẩn 2.3 Bệnh do vi khuẩn Salmonella gây ra ở lợn Mầm bệnh sau khi nhiễm vào ñường tiêu hoá, nhanh chóng ñi vào hệ lâm ba của ruột gây vi m sưng hạch, từ ñó vào