Trong tổng số 32 trang trại có hiện tượng tiêu chảy, 9 trang trại có biểu hiện lâm sàng rõ của Salmonella (tiêu chảy phân vàng có vết bong niêm mạc ruột, lợn bệnh có biểu hiện tím tai, tím vùng bụng dưới...). Tiến hành mổ khám lợn chết trong 9 trang trại này và thu bệnh phẩm bao gồm hạch amidan, gan, lách, hạch màng treo ruột, hồi tràng (12 mẫu mỗi loại) và phân lập xác định sự có mặt của vi khuẩn Salmonella. Kết quả được trình bày ở bảng 4.5
Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………………… 44
Hình 4.7: Mổ khám lợn tiêu chảy nghi do Salmonella
Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………………… 45
Bảng 4.5. Kết quả phân lập vi khuẩn Salmonella từ phủ tạng của lợn nghi mắc bệnh của lợn nghi mắc bệnh
STT Loại bệnh phẩm Số mẫu kiểm
tra Số mẫu dương tính
Tỷ lệ % 1 Hạch amidan 12 8 66,67 2 Gan 12 6 50,00 3 Lách 12 6 50,00 4 Hạch màng treo ruột 12 10 83,33 5 Hồi tràng 12 10 83,33 0 20 40 60 80 100
Hộch amidanGanLáchHộch màng treo ruộtHội tràng
66,67 50,0050,00 83,3383,33 T ỷ l ỷ % Loỷi bỷnh phỷm
Hình 4.9. So sánh tỷ lệ phân lập vi khuẩn Salmonella từ phủ tạng của lợn nghi mắc bệnh
Kết quả cho thấy, tỷ lệ phân lập ñược vi khuẩn Salmonella cao nhất ở hạch màng treo ruột và ñoạn hồi tràng (83,33%), sau đó là ở hạch hạnh nhân khẩu cái (amidan) (66,67%). Tỷ lệ phân lập ñược vi khuẩn này thấp nhất từ các mẫu lách và gan (50%).
Theo Wilcock và Schwatz (1992), chỉ 2 giờ sau khi gây nhiễm,
Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nơng nghiệp …………………………… 46
thì 24 giờ sau, vi khuẩn cũng ñã xuất hiện ở hạch màng treo ruột và hạch amidan.
ðỗ Trung Cứ và cs (2001) đã tìm thấy vi khuẩn Salmonella ở 9/9 loại phủ tạng gồm chất chứa ruột non, ruột già, hạch màng treo ruột, hạch amidan, gan, lách, thận, máu tim, phổi của lợn từ 2 – 4 tháng tuổi bị tiêu chảy. Trong đó, tỷ lệ cao nhất là hạch màng treo ruột (94,59%), ở gan (91,89%) và thấp nhất là ở thận (27,08%). Tỷ lệ phân lập Salmonella trong theo dõi của chúng tôi phù hợp với quy luật phân bố vi khuẩn này trong các cơ quan nội tạng của lợn bị tiêu chảy do
Salmonella.
4.4. Kết quả giám ñịnh một số đặc tính ni cấy và sinh hóa của các chủng
Salmonella phân lập được
Mỗi lồi vi khuẩn có một đặc tính sinh học khác nhau như: tính chất ni cấy trên các môi trường thông thường, môi trường đặc biệt, tính chất chuyển hóa các loại ñường, khả năng sản sinh các hợp chất sinh học trung gian trong q trình trao đổi chất vào môi trường nuôi cấy....
ðể khẳng ñịnh vi khuẩn phân lập ñược từ 31 mẫu (19 mẫu phân và 12 mẫu phủ tạng) ñã phân lập được có phải là vi khuẩn Salmonella hay không, chúng tơi đã tiến hành giám định một số đặc tính sinh học về hình thái, tính chất bắt màu, đặc tính ni cấy của chúng trên các môi trường: BPW, RV, thạch DHL, thạch CHROMTM Salmonella, thạch TSI, thạch LIM và Malonate. Kết quả được trình bày ở bảng 4.6
Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………………… 47
Hình 4.10: Khuẩn lạc Salmonella trên mơi trường CHROM
Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………………… 48
Bảng 4.6. Kết quả xác định hình thái, tính chất bắt màu, đặc tính ni cấy của các chủng vi khuẩn Salmonella phân lập ñược
STT Chỉ tiêu kiểm traSố chủng
kiểm traKết quả (+)Tỷ lệ (%)
1 Di ñộng 31 31 100,0 2 Nhuộm Gram 31 31 100,0 3 BPW 31 31 100,0 4 RV 31 31 100,0 5 Thạch DHL 31 31 100,0 6 Thạch CHROM TM Salmonella 31 31 100,0 7 Thạch TSI 31 31 100,0 8 Thạch LIM 31 31 100,0 9 Malonate 31 31 100,0
Kết quả ở bảng 4.6 cho thấy cả 31 mẫu vi khuẩn khi nhuộm bằng phương pháp nhuộm Gram ñều bắt màu Gram âm (màu ñỏ). Vi khuẩn quan sát ñược ñều là những trực khuẩn ngắn, hai đầu trịn. Trong các môi trường tăng sinh như BPW và R , tất cả các chủng vi khuẩn ñều mọc tốt, có khả năng di động, làm đục mơi trường, có cặn dưới đáy ống nghiêm sau 24 giờ, tạo màng mỏng trên bề mặt môi trường nuôi cấy. Tất cả các chủng vi khuẩn (31/31) khi nuôi cấy trên môi trường thạch DHL tạo khuẩn lạc ở giữa màu ñen, xung quanh trong suốt hoặc khuẩn lạc trong suốt không màu. Trên môi trường thạch CHROMTM
Salmonella, khuẩn lạc có màu tím hồng, dạng S.
Tất cả 31 chủng Salmonella ñều mọc và phát triển tốt trên môi trường TSI, có hoặc khơng sản sinh H2S, khơng làm chuyển màu mơi trường LIM (mơi trường LIM vẫn có màu tím), có nghĩa là dương tính đối với phản ứng Lysine (thủy phân Lysine) và không làm chuyển màu môi trường Malonate. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………………… 49
Hình 4.12. Vi khuẩn Salmonella trên mơi trường TSI và môi trường LIM
Sau khi xác ñịnh ñặc tính ni cấy của các chủng vi khuẩn Salmonella
trên, chúng tơi đã tiến hành kiểm tra một số đặc tính sinh hóa của chúng. Kết quả được trình bày ở bảng 4.7.
Kết quả cho thấy 31 chủng kiểm tra ñều lên men sinh hơi các ñường Glucoze, Mantol, Sorbitol, Dextroze, Galactoze, Manitol, Arabinoze...nhưng khơng lên men đường Lactoza, Sucroze. Tất cả các chủng Salmonella phân lập được đều khơng sản sinh Indol, phản ứng Oxidaze âm tính, Catalaze dương tính, 100% số chủng có khả năng di động, 74,19% các chủng sinh H2S.
Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………………… 50
Bảng 4.7. Kết quả giám định một số đặc tính sinh hố của các chủng vi khuẩn Salmonella phân lập ñược
STT Chỉ tiêu kiểm tra Số lượng mẫu Kết quả (+) Tỷ lệ (%)
1 Indol 31 0 0 2 Oxidaze 31 0 0 3 Catalaza 31 31 100,0 4 H2S 31 23 74,19 5 Glucoza 31 31 100,0 6 Mantol 31 31 100,0 7 Lactoze 31 0 0 8 Sorbitol 31 31 100,0 9 Dextroze 31 31 100,0 10 Sucroze 31 0 0 11 Galactoze 31 31 100,0 12 Manitol 31 31 100,0 13 Arabinoze 31 31 100,0
Như vậy, đặc tính sinh vật hoá học của các chủng Salmonella phân lập ñược mang ñặc ñiểm chung của giống Salmonella và phù hợp với những ñặc điểm về hình thái, ni cấy, đặc tính sinh hố của vi khuẩn này theo như mô tả của Quinn và cs. (2002) cũng như của các tác giả khác như Nguyễn Vĩnh Phước (1970); Phùng Quốc Chướng (1995); Cù Hữu Phú và cs (2000), ðỗ Trung Cứ (2001).
4.5. Kết quả xác ñịnh serotyp của các chủng vi khuẩn Salmonella phân lập ñược
Trong nghiên cứu này, chúng tơi đã tiến hành xác ñịnh serotyp của các chủng Salmonella phân lập ñược bằng các phản ứng ngưng kết trên phiến kính và trong ống nghiệm sử dụng kháng huyết thanh chuẩn (do hãng Denka Seiken Co., Ltd. Tokyo, Nhật Bản cung cấp) ñối với kháng nguyên thân O và kháng
Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………………… 51
nguyên lông H của vi khuẩn Salmonella và ñối chiếu theo bảng phân loại của Kauffmann and White (Popoff, 2001). Kết quả được trình bày ở bảng 3.7.
Bảng 4.8. Kết quả xác ñịnh serotyp của các chủng vi khuẩn Salmonella
phân lập ñược
Hình 4.13. So sánh tỷ lệ các chủng Salmonella phân lập được
Cơng thức kháng ngun Kết quả KN H Số chủng kiểm tra Serotyp KN O Pha 1 Pha 2 Số chủng (+) Tỷ lệ (%) S.agona 4 i 1,6 5 16,14 S.meleagridis 3,10 e,h L,w 2 6,45 S.ruzizi 3,10 1 z6 2 6,45 S.typhimurium 4 i 1,2 16 51,61 n=31 S.anatum 3,10 e,h 1,6 6 19,35
Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………………… 52
Kết quả ở bảng 3.6. cho thấy, 16 trong 31 chủng vi khuẩn Salmonella
nghiên cứu là S. typhimurium (chiếm 51,61%); 6 chủng là S.anatum (chiếm 19,35%); 5 chủng là S agona (16,14%); 2 chủng là S.meleagridis (6,45%) và 2 chủng là S.ruzizi (chiếm 6,45%). Như vậy, serotyp ñược phát hiện với tỷ lệ cao nhất là S.typhimurium, tiếp ñến là S.anatum, S.agona và ít gặp nhất là
S.meleagridis và S.ruzizi.
Kết quả nghiên cứu của Laval (2000), S.choleraesuis là tác nhân gây bệnh thể cấp tính (thể bệnh quan trọng nhất). Chủng này được tìm thấy với tỷ lệ cao nhất theo các nghiên cứu trước ñây tại Việt Nam. Theo Lê Văn Tạo và, Nguyễn Thị Vui (1994), Salmonella tìm thấy ở lợn chủ yếu là S. choleraesuis. Phân lập từ 75 mẫu phân ở một số vùng thuộc Ba Vì (Hà Tây cũ), Tạ Thị Vịnh và ðặng Khánh Vân (1996) cho biết S.choleraesuis chiếm tỷ lệ cao nhất (60%). Kết quả nghiên cứu của chúng tơi có sự sai khác so với nghiên cứu của các tác giả trên. Trong các mẫu thí nghiệm khơng phân lập được chủng S.cholerasuis mà thấy rằng tỷ lệ lưu hành của chủng S.typhimurium là cao nhất (51,61%).
Trên các ñối tượng khác, nghiên cứu của Phạm Hồng Ngân (2010) cho biết tỷ lệ phân bố các serotyp Salmonella spp ở bê ni hướng sữa đã có những sự thay đổi rõ rệt; tỷ lệ nhiễm cao nhất là S.dublin, tiếp theo là S.typhimurium, thay vì là S.enteritidis như trước kia.
Như vậy có thể cho rằng (1) thành phần chủng Salmonella tại các trang trại chăn ni lợn đã thay đổi hoặc (2) trong điều kiện chăn ni theo quy mơ công nghiệp, chủng Salmonella phổ biến nhất hiện nay là S.typhimurium chứ không phải S.choleraesuis.
4.6. Kết quả kiểm tra mức ñộ mẫn cảm của các chủng Salmonella phân lập ñược với một số loại kháng sinh một số loại kháng sinh
Chúng tôi cũng chọn ngẫu nhiên 31 chủng vi khuẩn Salmonella phân lập ñược ñể kiểm tra mức ñộ mẫn cảm với 14 loại kháng sinh và hóa dược thơng dụng, tiến hành kiểm tra và ñánh giá theo phương pháp của Kirby- Bauer
Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………………… 53
(1996). Các mẫu giấy thử kháng sinh dùng trong nghiên cứu do hãng OXOID sản xuất. Kết quả được trình bày ở bảng 4.9. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Bảng 4.9. Kết quả kiểm tra mức ñộ mẫn cảm với một số loại kháng sinh của các chủng vi khuẩn Salmonella phân lập được
Rất mẫn cảm Mẫn cảm trung bình Tỷ lệ mẫn cảm Kháng TT Tên kháng sinh Số chủng kiểm tra (+) (%) (1) (+) (%) (2) (1) + (2) (+) (%) 1 Gentamycin 31 1 3,22 10 32,26 35,48 20 64,52 2 Colistin 31 5 16,13 10 32,26 48,39 16 51,61 3 Tetracyclin 31 0 0,00 1 3,22 3,22 30 96,78 4 Kanamycin 31 0 0,00 9 29,03 29,03 22 70,97 5 Streptomycin 31 0 0,00 0 0,00 0,00 31 100,00 6 Sulfatrimethoprime 31 0 0,00 2 6,45 6,45 29 93,55 7 Norfloxacin 31 4 12,90 12 38,71 51,61 15 48,39 8 Amoxicillin 31 0 0,00 1 3,22 3,22 30 96,77 9 Ampicillin 31 0 0,00 1 3,22 3,22 30 96,77 10 Apramicin 31 8 25,80 10 32,26 58,06 13 41,94 11 Enrofloxacin 31 0 0,00 4 12,90 12,90 27 87,10
Kết quả bảng 4.9 cho thấy: Các chủng vi khuẩn Salmonella phân lập được đều kháng hồn tồn với Streptomycin. Tỷ lệ kháng Tetracyclin, Amoxicillin và Ampicillin là (96,77%) tỷ lệ kháng Sulfatrimethoprime cũng tới 93,55%.
Các chủng Salmonella mẫn cảm cao nhất với Apramicin (58,06%) tiếp ñến là Norfloxacin (51,61%) và Colistin (48,39%). Tỷ lệ các chủng mẫn cảm với Gentamycin, Kanamycin, Enrofloxacin ñều dưới 40%.
Theo Phùng Quốc Chướng (1995), vi khuẩn Salmonella mẫn cảm nhất với Norfloxacin và Ciprofloxacin. Kết quả nghiên cứu của Tô Liên Thu (2005) cho biết Salmonella phân lập ñược từ thịt lợn mẫn cảm cao với Norfloxacin (90%), Ofloxacin (90%) và Gentamycin (90%). Nghiên cứu của chúng tôi cho thấy, nếu không xét riêng từng chủng vi khuẩn, đã có sự thay ñổi về tỷ lệ các chủng
Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………………… 54
Salmonella mẫn cảm với các loại kháng sinh (tỷ lệ mẫn cảm giảm so với các nghiên cứu đã được cơng bố). Như vậy có thể thấy tác dụng của nhiều loại kháng sinh ñối với vi khuẩn Salmonella ñã giảm.
4.7. Kết quả kiểm tra ñộc lực các chủng Salmonella phân lập ñược
Trong số 5 serotyp được phát hiện, mỗi serotyp chúng tơi chọn ngẫu nhiên 2 chủng ñể kiểm tra ñộc lực bằng phương pháp tiêm truyền qua chuột nhắt trắng (2ml canh trùng /chuột; tiêm phúc mạc); 2 chuột đối chứng (2ml mơi trường BHI /chuột; tiêm phúc mạc). Kết quả được trình bày ở bảng 3.9
Bảng 4.10. Kết quả kiểm tra ñộc lực các chủng Salmonella phân lập ñược bằng phương pháp tiêm truyền qua chuột nhắt trắng
Kết quả theo dõi
Serotyp Liều tiêm (ml) ðường tiêm Số chuột thử Thời gian chuột chết sớm nhất Thời gian chuột chết muộn nhất Số con chết Tỷ lệ Kết quả phân lập vi khuẩn từ chuột chết S.agona 0,2 Phúc mạc 4 13 17 4 100,00 + S.meleagridis 0,2 Phúc mạc 4 15 20 4 100,00 + S.ruzizi 0,2 Phúc mạc 4 16 20 4 100,00 + S.typhimurium 0,2 Phúc mạc 4 8 12 4 100,00 + S.anatum 0,2 Phúc mạc 4 10 14 4 100,00 + ðối chứng (BHI) 0,2 Phúc mạc 2 0 0 0 0,00
Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………………… 55
Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………………… 56
Kết quả ở bảng 4.10 cho các chủng nghiên cứu gấy chết 100% chuột nhắt trắng. Thời gian gây chết chuột thí nghiệm sớm nhất là 10 giờ sau tiêm (ñối với
S. typhimurium và S .anatum) và gây chết muộn nhất ở 26 giờ sau tiêm (ñối với
S.ruzizi). Những chuột chết được mổ khám, lấy máu tim, ni cấy phân lập vi khuẩn Salmonella. Tất cả các mẫu máu từ chuột chết ñều phân lập ñược vi khuẩn Salmonella. Kết quả tiêm truyền động vật thí nghiệm cho thấy các chủng
Salmonella phân lập được đều có độc lực khá cao chứng tỏ vi khuẩn Salmonella
là một nguyên nhân quan trọng gây tiêu chảy trên các ñàn lợn tại các trang trại thuộc nghiên cứu này.
4.8. Kết quả xác ñịnh một số yếu tố gây bệnh của các chủng vi khuẩn Salmonella
phân lập ñược
Chúng tơi đã tiến hành xác định gen quy định ñộc tố (Salmonella toxin; Stn) và yếu tố xâm nhập (Invation A; InvA) bằng phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction). Ưu ñiểm của phương pháp này là ñộ nhạy và ñộ ñặc hiệu cao, có thể thực hiện với số lượng mẫu lớn và cho kết quả nhanh, chính xác trong thời gian ngắn.
Các cặp mồi thích hợp ñược sử dụng trong phản ứng PCR ñể xác ñịnh một số yếu tố ñộc lực của các chủng vi khuẩn Salmonella bao gồm (1) Stn – F (mồi xi) và Stn – R (mồi ngược) dùng để xác ñịnh gen sản sinh ñộc tố ñường ruột Stn (cho kích cỡ sản phẩm là 259 bp), (2) InvA – F (mồi xi) và InvA – R (mồi ngược) để xác ñịnh gen quyết ñịnh yếu tố xâm nhập InvA (cho kích cỡ sản phẩm là 521 bp). Các bước tiến hành phản ứng PCR như đã mơ tả ở phần phương pháp nghiên cứu. Kết quả xác ñịnh các gen quy ñịnh ñộc tố được trình bày ở bảng 4.11.
Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………………… 57
Bảng 4.11. Kết quả kiểm tra một số yếu tố gây bệnh của các chủng vi khuẩn Salmonella phân lập ñược vi khuẩn Salmonella phân lập ñược
Yếu tố gây bệnh Stn InvA TT Serotyp Số chủng kiểm tra (+) (%) (+) (%) 1 S.agona 5 4 80,00 5 100,00 2 S.meleagridis 2 1 50,00 2 100,00 3 S.ruzizi 2 1 50,00 1 50,00 4 S.typhimurium 16 16 100,00 16 100,00 5 S.anatum 6 5 83,33 6 100,00 Tổng 31 27 87,10 30 96,77 0 20 40 60 80 100
S.agonaS.meleagridisS.ruziziS.typhimuriumS.anatumAverage
80 5050 100 83,33 87,1 100100 50 100100 96,77 T ỷ l ỷ % Serotyp Stn InvA
Hình 4.16. So sánh tỷ lệ dương tính với một số yếu tố gây bệnh của vi khuẩn
Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………………… 58 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Hình 4.17. Sản phẩm PCR xác định gen sản sinh ñộc tố ñường ruột và yếu tố xâm nhập với ñối chứng tương ứng ở giếng 5 (259 bp và 521 bp); các ñối chứng âm (giếng 6&7); các mẫu dương tính với Stn (giếng 1,3,4) và với InvA (1,2,3,4); giếng 8,
thang chuẩn 1000bp
Kết quả ở bảng 4.11 cho thấy trong tổng số 31 chủng Salmonella ñược kiểm tra, có 27 chủng mang gen Stn (chiếm tỷ lệ 87,10%); 30 chủng mang gen InvA (chiếm 96,77%).
- Tất cả các chủng thuộc serotyp S. typhimurium được kiểm tra có mang cả hai gen Stn và InvA.
- Tất cả 6 chủng thuộc serotyp S.anatum mang gen InvA nhưng chỉ có 5 chủng mang gen Stn (83,33%)
- Trong số 5 chủng thuộc serotyp S.agona, 4 chủng mang gen Stn