3.4. Phương pháp nghiên cứu
3.4.4. Phương pháp xác ñịnh serotyp của vi khuẩn Salmonella
Xác ñịnh serotyp của các chủng Salmonella phân lập ñược bằng các phản ứng ngưng kết trên phiến kính và trong ống nghiệm bằng kháng huyết thanh chuẩn (hãng Denka Seiken Co., Ltd. Tokyo, Nhật Bản) ñối với kháng nguyên thân O và kháng nguyên lông H. Trên cơ sở kết quả thu ñược, tiến hành ñịnh danh chủng vi khuẩn kiểm tra dựa vào bảng phân loại Kauffmann và White (Popoff, 2001).
3.4.4.1. Xác định nhóm kháng ngun O bằng kháng huyết thanh đa giá nhóm O
Sử dụng phản ứng ngưng kết nhanh trên phiến kính (Rapid Slide Aglutination) để xác định nhóm kháng ngun O của vi khuẩn Salmonella. ðây là phản ứng giữa kháng nguyên và kháng thể ñược sử dụng rất phổ biến trong phịng thí nghiệm để chẩn đốn và giám định các loại vi khuẩn.
- Chuẩn bị:
+ Khuẩn lạc vi khuẩn được ni cấy vào thạch TSI hoặc thạch thường ñể tủ ấm 37oC trong 24 giờ.
+ Kháng huyết thanh chuẩn ña giá. - Tiến hành:
+ Chia 1 phiến kính sạch làm 2 phần: 1 phần làm ñối chứng, và 1 phần làm thí nghiệm. Nhỏ vào mỗi bên phiếm kính một giọt nước sinh lý.
+ Lấy một ít khuẩn lạc Salmonella cần định typ ñã ñược cấy trên thạch TSI hoặc thạch thường, hòa với mỗi giọt nước muối sinh lý đã nhỏ sẵn ở hai bên phiến kính thành huyễn dịch kháng nguyên.
Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………………… 30
+ Nhỏ tiếp vào bên thí nghiệm 1 giọt kháng huyết thanh ña giá nhóm O, cịn bên đối chứng âm, nhỏ thêm một giọt nước muối sinh lý. Trộn ñều, lắc nhẹ phiến kính trong khoảng 30 – 60 giây.
+ ðọc kết quả: Phản ứng dương tính khi có cụm ngưng kết kiểu hạt xuất hiện, huyễn dịch xung quanh trong. Bên ñối chứng âm huyễn dịch vẫn ñục ñều.
3.4.4.2. Xác ñịnh kháng nguyên O bằng kháng huyết thanh đơn giá nhóm O
Các chủng cho kết quả dương tính với kháng huyết thanh O đa giá, tiếp tục ñược xác ñịnh với các kháng huyết thanh ñơn giá. Cách làm tương tự như phương pháp đã được trình bày ở phần 2.4.4.1.
3.4.4.3. Xác ñịnh kháng nguyên H của vi khuẩn Salmonella
Sau khi ñã xác ñịnh kháng nguyên O của vi khuẩn Salmonella, tiếp tục tiến hành xác ñịnh kháng nguyên H của chúng.
3.4.4.3.1 Xác ñịnh kháng nguyên H của vi khuẩn Salmonella (pha 1)
- Chuẩn bị:
+ Các chủng vi khuẩn Salmonella cần định typ được cấy trên mơi trường thạch TSI hoặc thạch thường, ủ ở tủ ấm 37oC trong 24 giờ.
+ Chọn những khuẩn lạc riêng rẽ, cấy vào môi trường nước BHI (5ml) ñể tủ ấm 37oC trong 2 giờ hoặc qua đêm ở nhiệt độ phịng. Sau đó, thêm vào canh trùng 5 ml dung dịch nước muối sinh lý có bổ sung Formalin (nước sinh lý + 1% Formalin) nhằm mục đích là để cố định kháng nguyên H.
+ Kháng huyết thanh nhóm H gồm: Ha, Hb, Hc, Hd, He,h, HG, Hi, Hk, HL, Hr, Hy, He,n, H1
- Tiến hành:
+ Nhỏ 2 giọt kháng huyết thanh từ Ha ñến H1 vào mỗi ống nghiệm. + Dùng Micropipet, hút 450 µl canh trùng Salmonella ñã sử lý ở trên và cho vào ống nghiệm đã có chứa kháng huyết thanh.
+ Lắc nhẹ ñể trộn ñều canh trùng và kháng huyết thanh trong ống nghiệm, sau đó đặt vào bể ủ nhiệt ở nhiệt ñộ 50oC trong 1 giờ.
+ ðọc kết quả: Phản ứng dương tính thì có ngưng kết kiểu ñám mây, các cụm ngưng kết tương ñối lỏng lẻo. Phản ứng âm tính thì dung dịch
Trường ðại học Nơng Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nơng nghiệp …………………………… 31
trong ống nghiệm đục đều.
3.4.4.3.2 Xác ñịnh kháng nguyên H của vi khuẩn Salmonella (pha 2)
Sau khi có kết quả xác ñịnh kháng nguyên H pha 1 của các chủng
Salmonella, chúng tơi tiến hành xác định tiếp kháng nguyên H pha 2 của chúng. + Hút 3,5 ml mơi trường nước thịt HI hoặc BHI có chứa 0.25% thạch vào trong 1 ống nghiệm có nút vặn, có chứa sẵn 1 ống thủy tinh nhỏ hở 2 ñầu.
+ ðể ống nghiệm đó vào bể ủ nhiệt ở 50oC trong 15 phút, sau đó nhỏ 50 µl kháng huyết thanh tương ứng với kết quả của pha 1 vào ống nghiệm.
+ Dùng que cấy thẳng, lấy 1 khuẩn lạc của chủng vi khuẩn cần ñịnh typ, cấy thẳng vào phía trong của ống thủy tinh nhỏ sâu khoảng 1-1,5cm. Sau đó ủ ở tủ ấm 37oC trong vòng 24 giờ.
+ Lấy 1 vòng que cấy của chủng vi khuẩn ñã phát triển trong mơi trường (chủng này có thể di chuyển qua thạch mà khơng bị ức chế), cấy vào 1 ống nghiệm có chứa 5 ml BHI, để nghiêng týp trong tủ ấm 37oC trong vòng 6 giờ.
+ Thêm vào đó 5 ml dung dịch nước muối sinh lý có bổ sung Formalin (nước muối sinh lý + 1% Formalin), để ở nhiệt độ phịng trong 2 giờ.
+ Nhỏ 2 giọt kháng huyết thanh tương ứng với kết quả của các chủng tạo pha 2 vào mỗi ống nghiệm.
+ Dùng Micropipet hút 450 µl canh trùng Salmonella ñã sử lý ở trên và cho vào ống nghiệm đã có chứa kháng huyết thanh.
+ Lắc nhẹ ñể trộn ñều canh trùng và kháng huyết thanh trong ống nghiệm, sau đó đặt vào bể ủ nhiệt ở nhệt ñộ 50oC trong 1 giờ.
+ ðọc kết quả: Phản ứng dương tính thì có ngưng kết kiểu ñám mây, các cụm ngưng kết tương ñối lỏng lẻo. Phản ứng âm tính thì dung dịch trong ống nghiệm ñục ñều.