3.4. Phương pháp nghiên cứu
3.4.3. Phương pháp giám ñịnh vi khuẩn Salmonella phân lập ñược
3.4.3.1. Kiểm tra hình thái học
Dùng phương pháp nhuộm Gram - Vi khuẩn Gram dương bắt màu tím - Vi khuẩn Gram âm bắt màu ñỏ
3.4.3.2. Kiểm tra khả năng di ñộng
+ Kiểm tra di ñộng bằng phương pháp cấy vi khuẩn vào môi trường thạch bán cố thể
+ Phương pháp tiến hành: Dùng que cấy đầu nhọn vơ trùng lấy vi khuẩn sau đó cấy chích sâu vào giữa ống thạch bán cố thể, ñến gần ñáy ống thì rút ra, để tủ ấm 37oC trong vòng 24 giờ.
+ ðọc kết quả: Nếu vi khuẩn có khả năng di động thì dọc theo đường cấy vi khuẩn sẽ mọc lan ra.
3.4.3.3. Phản ứng chuyển hóa đường
+ Thành phần:
Nước cất :1000 ml Peptone :15 g Andrade :10 ml
+ Cách pha: Trộn ñều hỗn hợp trên, khuấy cho tan hết rồi cho vào mỗi ống nghiệm ñã có sẵn 1 ống duyn – ham 5ml. Hấp vơ trùng 121oC trong 15 phút, ñể nguội. Pha các loại ñường: glucose, saccarosea, lactose, galactose, maltose, mannit, manitol, fructose, oxylose, aribinose với nồng ñộ cuối cùng là 10%, hấp ướt 110oC trong 30 phút hoặc 100oC trong 30 phút/ngày ( hấp 3 ngày liên tiếp).
+ Tiến hành: Dùng pipet vơ trùng nhỏ vào mỗi ống 100µl đường (mỗi ống 1 loại đường). Kiểm tra vơ trùng trong tủ ấm ở 37oC trong 24 giờ. Sau đó, nhỏ 100µl canh trùng, để tủ ấm 370C/24 giờ.
+ ðọc kết quả: Nếu vi khuẩn lên men sinh hơi thì phần mơi trường trong ống duyn – ham sẽ bị đẩy ra ngồi.
Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………………… 28
Nếu vi khuẩn lên men đường, mơi trường ñổi sang màu hồng ñậm. Nếu vi khuẩn khơng lên men đường, mơi trường khơng ñổi màu.
3.4.3.4. Phản ứng sinh Indol
+ Phương pháp làm: Cấy vi khuẩn vào môi trường nước thịt, nuôi cấy ở 37oC trong 4 – 6 giờ. Nhỏ 0,5 ml thuốc thử Kovac’s vào.
+ ðọc kết quả: Phản ứng dương tính khi quan sát thấy một vịng màu đỏ ở trên mặt môi trường. Nếu trên bề mặt mơi trường khơng có màu đỏ đậm thì phản ứng sinh Indol âm tính.
3.4.3.5. Phản ứng sinh H2S
+ Nguyên lý: Một số vi khuẩn có khả năng phân giải axitamin có chứa lưu huỳnh và làm sản sinh H2S. ðể xác ñịnh khả năng sinh H2S người ta cấy vi khuẩn vào trong mơi trường có chứa Pb(CH3COO)2.
Pb(CH3COO)2 + H2S PbS + 2CH3COOH Có màu đen
+ Phương pháp làm: Dùng que cấy đầu nhọn vơ trùng lấy vi khuẩn sau đó cấy chích sâu vào mơi trường thạch TSI để tủ ấm 37 oC trong 24 giờ.
+ Kết quả: Nếu vi khuẩn sinh H2S thì dọc theo đường cấy sẽ xuất hiện màu ñen.
3.4.3.6. Phản ứng Oxidaza:
+ ðược tiến hành trên giấy có tẩm dung dịch 1% Tetramethyl – P. phenylene diamine hydrochloride.
+ Phương pháp làm: Dùng que cấy lấy khuẩn lạc từ môi trường thạch chà sát lên mặt giấy ñã thấm thuốc thử.
+ ðọc kết quả: Nếu chỗ ñược chà sát sau 30 giây xuất hiện màu tím đen là phản ứng dương tính. Nếu khơng xuất hiện màu tím đen hoặc khơng đổi màu là phản ứng âm tính.
Trường ðại học Nơng Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………………… 29
3.4.3.7. Phản ứng Catalaza:
+ Phương pháp làm: Lấy 1 phiến kính sạch, dùng que cấy lấy khuẩn lạc từ mơi trường thạch đặt lên trên 1 phiến kính đó, nhỏ 1 giọt dung dịch H2O2 3% (Hydrogen peroxidaza).
+ ðọc kết quả: Nếu có hiện tượng sủi bọt là phản ứng dương tính. Nếu khơng thấy có hiện tượng sủi bọt là phản ứng âm tính.