Hình 4 .5 So sánh tỷ lệ nhiễm Salmonella trong nguồn nước uống
Hình 4.14 & 4.15 Mổ khám chuột chết sau khi tiêm canh trùng Salmonella
Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………………… 56
Kết quả ở bảng 4.10 cho các chủng nghiên cứu gấy chết 100% chuột nhắt trắng. Thời gian gây chết chuột thí nghiệm sớm nhất là 10 giờ sau tiêm (đối với
S. typhimurium và S .anatum) và gây chết muộn nhất ở 26 giờ sau tiêm (ñối với
S.ruzizi). Những chuột chết được mổ khám, lấy máu tim, ni cấy phân lập vi khuẩn Salmonella. Tất cả các mẫu máu từ chuột chết ñều phân lập ñược vi khuẩn Salmonella. Kết quả tiêm truyền động vật thí nghiệm cho thấy các chủng
Salmonella phân lập được đều có độc lực khá cao chứng tỏ vi khuẩn Salmonella
là một nguyên nhân quan trọng gây tiêu chảy trên các ñàn lợn tại các trang trại thuộc nghiên cứu này.
4.8. Kết quả xác ñịnh một số yếu tố gây bệnh của các chủng vi khuẩn Salmonella
phân lập ñược
Chúng tơi đã tiến hành xác định gen quy định ñộc tố (Salmonella toxin; Stn) và yếu tố xâm nhập (Invation A; InvA) bằng phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction). Ưu ñiểm của phương pháp này là ñộ nhạy và độ đặc hiệu cao, có thể thực hiện với số lượng mẫu lớn và cho kết quả nhanh, chính xác trong thời gian ngắn.
Các cặp mồi thích hợp được sử dụng trong phản ứng PCR ñể xác ñịnh một số yếu tố ñộc lực của các chủng vi khuẩn Salmonella bao gồm (1) Stn – F (mồi xi) và Stn – R (mồi ngược) dùng để xác ñịnh gen sản sinh ñộc tố đường ruột Stn (cho kích cỡ sản phẩm là 259 bp), (2) InvA – F (mồi xuôi) và InvA – R (mồi ngược) ñể xác ñịnh gen quyết ñịnh yếu tố xâm nhập InvA (cho kích cỡ sản phẩm là 521 bp). Các bước tiến hành phản ứng PCR như đã mơ tả ở phần phương pháp nghiên cứu. Kết quả xác ñịnh các gen quy định độc tố được trình bày ở bảng 4.11.
Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………………… 57
Bảng 4.11. Kết quả kiểm tra một số yếu tố gây bệnh của các chủng vi khuẩn Salmonella phân lập ñược vi khuẩn Salmonella phân lập ñược
Yếu tố gây bệnh Stn InvA TT Serotyp Số chủng kiểm tra (+) (%) (+) (%) 1 S.agona 5 4 80,00 5 100,00 2 S.meleagridis 2 1 50,00 2 100,00 3 S.ruzizi 2 1 50,00 1 50,00 4 S.typhimurium 16 16 100,00 16 100,00 5 S.anatum 6 5 83,33 6 100,00 Tổng 31 27 87,10 30 96,77 0 20 40 60 80 100
S.agonaS.meleagridisS.ruziziS.typhimuriumS.anatumAverage
80 5050 100 83,33 87,1 100100 50 100100 96,77 T ỷ l ỷ % Serotyp Stn InvA
Hình 4.16. So sánh tỷ lệ dương tính với một số yếu tố gây bệnh của vi khuẩn
Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nơng nghiệp …………………………… 58
Hình 4.17. Sản phẩm PCR xác định gen sản sinh ñộc tố ñường ruột và yếu tố xâm nhập với ñối chứng tương ứng ở giếng 5 (259 bp và 521 bp); các ñối chứng âm (giếng 6&7); các mẫu dương tính với Stn (giếng 1,3,4) và với InvA (1,2,3,4); giếng 8,
thang chuẩn 1000bp
Kết quả ở bảng 4.11 cho thấy trong tổng số 31 chủng Salmonella được kiểm tra, có 27 chủng mang gen Stn (chiếm tỷ lệ 87,10%); 30 chủng mang gen InvA (chiếm 96,77%).
- Tất cả các chủng thuộc serotyp S. typhimurium được kiểm tra có mang cả hai gen Stn và InvA.
- Tất cả 6 chủng thuộc serotyp S.anatum mang gen InvA nhưng chỉ có 5 chủng mang gen Stn (83,33%)
- Trong số 5 chủng thuộc serotyp S.agona, 4 chủng mang gen Stn (80,00%) nhưng tất cả các chủng mang gen InvA.
- Cả hai chủng thuộc serotyp S.meleagridis mang gen InvA trong đó 1 chủng chứa gen Stn.
Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………………… 59
- Trong số 2 chủng S.ruzizi được kiểm tra thì 1 chủng có chứa gen Stn và 1 chủng có gen InvA.
Từ kết quả này cho thấy: Hầu hết các chủng Salmonella mang gen mã hóa yếu tố xâm nhập (tỷ lệ chung mang gen này tới 96,77%, chỉ có một chủng thuộc serotyp S.ruzizi khơng mang gen này). Các chủng thuộc serotyp S. typhimurium ñều mang gen quy ñịnh ñộc tố. Tỷ lệ các chủng mang gen quy ñịnh ñộc tố cao ở serotyp S.anatum và S.agona. ðối với các serotyp khác, có thể do số chủng nghiên cứu chưa ñủ lớn nên tỷ lệ mang các yếu tố ñộc lựcvà yếu tố xâm nhập có thể chưa cao. Kết quả xác định gen quy ñịnh yếu tố xâm nhập và gen quy ñịnh ñộc tố cho thấy khả năng gây bệnh cao của Salmonella tại các cơ sở chăn nuôi. ðặc biệt với S.typhimurium, serotyp có tỷ lệ phát hiện, tỷ lệ mang yếu tố ñộc lực và yếu tố xâm nhập cao.
4.9. Kết quả một số phác ñồ ñiều trị tiêu chảy do Salmonella
Dựa trên kết quả kiểm tra kháng sinh ñồ của Salmonella, chúng tơi đã lựa chọn kháng sinh và hóa dược điều trị theo 4 phác ñồ. Nguyên tắc ñiều trị là ức chế, tiêu diệt vi khuẩn, chống mất nước và ñiện giải, kết hợp với vệ sinh chăm sóc tốt.
Chúng tơi tiến hành điều trị thử nghiệm ở 14 trang trại, mỗi trang trại 40 con chia 4 lơ với 4 phác đồ, các phác đồ kết hợp dùng kháng sinh ñiều trị và bổ xung muối, ñiện giải như ñã nêu ở phần phương pháp thí nghiệm.
Ba loại kháng sinh chính được sử dụng là Norfloxacin, Colistin, Apramicin. Các kháng sinh này có tác dụng mạnh với các vi khuẩn gram (-) và theo kết quả kháng sinh ñồ mẫn cảm nhất với Salmonella: Apramicin (58,06%), Norfloxacin (51,61%), Colistin (48,39%).
Norfloxacin là một kháng sinh thuộc nhóm Fluoroquinolin, cơ chế tác dụng của Norfloxacin là ức chế enzyme DNA-gyrase (enzyme tham gia quá trình tổng hợp nhân của vi khuẩn) ức chế sự nhân lên của vi khuẩn. Thuốc có tác dụng hiệp đồng với nhóm Aminoglucozid và nhóm Polymycin.
Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………………… 60
Phác đồ 3 chúng tơi sử dụng kết hợp Norfloxacin với Colistin. Colistin là một kháng sinh thuộc nhóm Polymycin, cơ chế tác dụng của Colistin là phá màng vi khuẩn. Kết hợp này có tác dụng cộng hưởng làm tăng tác dụng lẫn nhau.
Phác đồ 4 chúng tơi sử dụng kết hợp Norfloxacin với Apramicin. Apramicin là một kháng sinh thuộc nhóm Aminoglucozid, cơ chế tác dụng của nó là ức chế tổng hợp protein của vi khuẩn. Hai kháng sinh này có tác dụng hiệp đồng.
Các phác đồ được trình bày ở bảng 4.12
Bảng 4.12. Các phác ñồ thử nghiệm ñiều trị tiêu chảy do Salmonella
Phác ñồ Chế phẩm Hoạt chất Liều dùng Cách dùng Nor-100 Nofloxacin 1ml/6kg thể trọng Tiêm bắp
1lần/ngày 1 Noptress Muối và ñiện giải 1g/20kg thể trọng Hòa nước cho uống Ampisure Ampicillin + colistin 1ml/10kg thể trọng Tiêm bắp 1lần/ngày 2 Noptress Muối và ñiện giải 1g/20kg thể trọng Hòa nước cho uống Nor-100 Nofloxacin 1ml/6kg thể trọng Tiêm bắp 1lần/ngày Colistin- sunfat Colistin 5mg/1kg thể trọng Hòa nước cho uống 3 Noptress Muối và ñiện giải 1g/20kg thể trọng Hòa nước cho uống Nor-100 Nofloxacin 1ml/6kg thể trọng Tiêm bắp 1lần/ngày Apralan Apramicin 15mg/1kg thể trọng Hòa nước
cho uống 4 Noptress Muối và ñiện giải 1g/20kg thể trọng Hòa nước cho uống
Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nơng nghiệp …………………………… 61
Do khó khăn trong việc bố trí thí nghiệm nên chúng tơi chỉ tiến hành thử nghiệm ñiều trị và theo dõi kết quả ñiều trị trong 3 ngày. Những con lợn ñược ñiều trị sau 3 ngày khơng khỏi sẽ được điều trị bằng một phác ñồ khác phù hợp. Kết quả điều trị được trình bày ở bảng 4.13
Bảng 4.13. Kết quả thử nghiệm một số phác ñồ ñiều trị tiêu chảy do Salmonella ñiều trị tiêu chảy do Salmonella
Kết quả cho thấy phác ñồ 4 cho hiệu quả ñiều trị tốt nhất, tỷ lệ lợn khỏi sau 3 ngày là 85,71% và tỷ lệ chết cũng thấp nhất 2,86%. Kết quả này cũng phù hợp với kết quả kháng sinh đồ của chúng tơi. Hiện nay có thể do chúng tơi mới đưa Apramicin vào ñiều trị nên khả năng kháng lại Apramicin của Salmonella
chưa mạnh như với các kháng sinh khác, do đó khả năng điều trị tốt hơn. Phác ñồ 4 kết hợp cho uống chế phẩm Apralan(50%) liều 30mg/1kg thể trọng, kết hợp với tiêm kháng sinh Norfloxacin (chế phẩm Nor-100) liều 1ml/8kg thể trọng, ñồng thời bổ xung muối và ñiện giải cho lợn bệnh thì thu được kết quả tốt nhất. Phác đồ 3 có sự kết hợp của Norfloxacin và Colistin cho kết quả tốt thứ hai; tỷ lệ khỏi sau 3 ngày là 85,71%. Nếu chỉ dung riêng 1 loại kháng sinh như ở phác ñồ 1 và phác đồ 2 thì hiệu quả điều trị khỏi sau 3 ngày thấp hơn, chưa ñến 60%.
Kết quả ñiều trị sau 3 ngày Tỷ lệ (%) Phác đồ Số trại thí nghiệm Số lợn điều trị Khỏi Chết Chưa khỏi Khỏi Chết Chưa khỏi 1 14 140 78 13 49 55,71 9,29 35,00 2 14 140 82 10 48 58,57 7,14 34,29 3 14 140 113 5 22 80,71 3,57 15,72 4 14 140 120 4 16 85,71 2,86 11,43
Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………………… 62
Phần V
KẾT LUẬN VÀ ðỀ NGHỊ
5.1. Kết luận:
1.Tại các trang trại chăn nuôi lợn quy mơ cơng nghiệp vẫn có hiện tượng vật ni mắc hội chứng tiêu chảy. Tỷ lệ phân lập ñược Salmonella spp từ mẫu phân của lợn tiêu chảy ở các trang trại trung bình là 40,63%.
2. Tỷ lệ phát hiện Salmonella trong mẫu nước uống của các trang trại không dùng chlorine xử lý nước cao (36,36%) so với các trại có dùng chlorine (0%). Dùng chlorine xử lý nước uống cho lợn có tác dụng hạn chế nhiễm khuẩn
Salmonella trong nước.
3. Tỷ lệ phát hiện S.typhimurium là cao nhất (51,61%) tại các trang trại lợn thịt nuôi theo hướng công nghiệp ở miền Bắc.
4.Chủng thuộc các serotyp mang gen quy ñịnh ñộc tố và yếu tố xâm nhập với tỷ lệ cao. ðặc biệt 100% số chủng S.typhimurium ñược phát hiện mang cả hai gen quy ñịnh ñộc tố và yếu tố xâm nhập. Cùng với tỷ lệ phát hiện cao, có thể nói cần chú ý đến S.typhimurium trong chăn ni lợn thịt theo quy trình cơng nghiệp.
5.Phác đồ điều trị có sự phối hợp của 2 loại thuốc kháng sinh uống và tiêm cho hiệu quả ñiều trị tốt hơn chỉ sử dụng một loại kháng sinh. Phác ñồ 4, dùng chế phẩm Nor-100 tiêm bắp và uống Apralan kết hợp uống ñiện giải cho hiệu quả ñiều trị tốt nhất, tỷ lệ khỏi sau 3 ngày ñiều trị là 85,71%.
5.2. ðề nghị:
Mở rộng ñối tượng nghiên cứu trên các lứa tuổi lợn.
Nghiên cứu xác ñịnh thêm một số yếu tố gây bệnh của Salmonella như: yếu tố bám dính, gen kháng kháng sinh DT04…
Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………………… 63
TÀI LIỆU THAM KHẢO
I. Tài liệu trong nước
1. Võ Thị Trà An, Nguyễn Ngọc Tuân, Lê Hữu Ngọc (2006), “Tình hình nhiễm Salmonella trong phân và thân thịt (bị, heo, gà) tại một số tỉnh phía Nam”, Tạp chí Khoa học kỹ thuật thú y, số 2, tr. 37-42.
2. Phùng Quốc Chướng (1995), Tình hình nhiễm Salmonella ở lợn tại vùng Tây Nguyên và khả năng phịng trị. Luận án PTS khoa học nơng nghiệp, Trường ðại học Nông nghiệp I Hà Nội.
3. ðỗ Trung Cứ, Trần Thị Hạnh, Nguyễn Quang Tuyên (2001), “ Kết quả phân lập và xác ñịnh một số yếu tố gây bệnh của vi khuẩn Salmonella spp
gây bệnh phó thương hàn lợn ở một số tỉnh miền núi phía Bắc”. Tạp chí Khoa học kỹ thuật thú y, số 3, tr. 10-17.
4. ðỗ Trung Cứ (2004), Phân lập và xác ñịnh yếu tố gây bệnh của Salmonella ở lợn tại một số tỉnh miền núi phía Bắc và biện pháp phịng trị. Luận án Tiến sỹ nơng nghiệp, Viện Thú y Quốc gia.
5. ðỗ ðức Diên (1999), Vai trò của E.coli và Salmonella trong hội chứng tiêu chảy lợn con ở Kim Bảng (Hà Nam) và thử nghiệm một số giải pháp phòng trị. Luận văn Thạc sỹ Nông nghiệp, Trường ðại học Nông nghiệp I, Hà Nội.
6. Trương Văn Dung, Yoshihara Shinobu (2002), Cẩm nang chẩn đốn tiêu chuẩn về các bệnh gia súc ở Việt Nam. Viện Thú y Quốc gia và Tổ chức hợp tác quốc tế Nhật Bản.
7. ðào Trọng ðạt, Phan Thanh Phượng, Lê Ngọc Mỹ (1995), Bệnh đường tiêu hóa ở lợn. NXB Nơng nghiệp, tr. 63- 96.
8. Trần Xuân Hạnh (1995), “Phân lập và giám ñịnh vi khuẩn Salmonella trên lợn ở tuổi giết thịt”. Tạp chí Khoa học kỹ thuật Thú y, số 3, tr. 89-93. 9. Nguyễn Bá Hiên (2001), Một số vi khuẩn ñường ruột thường gặp và biến
Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………………… 64
ñộng của chúng ở gia súc khỏe mạnh và bị tiêu chảy nuôi tại vùng ngoại thành Hà Nội. Luận án Tiến sĩ Nông nghiệp, Trường ðại học Nông nghiệp I, Hà Nội. 10. Laval A (2000), “Dịch tễ Salmonellosis”. Báo cáo tại hội thảo về bệnh lợn tại Viện Thú y – Hà Nội tháng 6/2000, Tài liệu dịch của Trần Thị Hạnh – Viện Thú y.
11. Hồ Văn Nam, Nguyễn Thị ðào Nguyên, Trương Quang, Phùng Quốc Chướng, Chu ðức Thắng, Phạm Ngọc Thạch (1997), ” Bệnh viêm ruột ỉa chảy ở lợn”, Tạp chí khoa học kỹ thuật thú y, số 2, tr.39-45
12. Phạm Hồng Ngân (2010), Nghiên cứu một số ñặc tính gây bệnh của vi khuẩn Escherichia coli, Salmonella gây tiêu chảy ở bê sữa nuôi tại ngoại thành Hà Nội và biện pháp phòng trị. Luận án tiến sĩ nông nghiệp, Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội.
13. Nguyễn Thị Nội, Nguyễn Ngọc Nhiên, Cù Hữu Phú (1989), “Enterobacteria in diarrhoea pig”. Kết quả 20 năm nghiên cứu của Viện Thú y (1969 – 1989), Hà Nội, tr. 43.
14. Nguyễn Thị Oanh (2003), Tình hình nhiễm và một số yếu tố gây bệnh của vi khuẩn Salmonella ở vật ni (lợn, trâu, bị, nai, voi) tại ðăk Lăk. Luận án Tiến sỹ Nông nghiệp, Trường ðại học Nông nghiệp I, Hà Nội.
15. Cù Hữu Phú, Nguyễn Ngọc Nhiên, Vũ Bình Minh, ðỗ Ngọc Thuý (2000), “Phân lập vi khuẩn E.coli và Salmonella ở lợn mắc bệnh tiêu chảy, xác định một số đặc tính sinh vật hố học của các chủng vi khuẩn phân lập được và biện pháp phịng trị”. Kết quả nghiên cứu Khoa học kỹ thuật thú y (1996-2000), NXB Nông nghiệp, Hà Nội, tr. 171-176.
16. Nguyễn Vĩnh Phước (1970), Vi sinh vật học thú y. NXB ðại học và trung học chuyên nghiệp Hà Nội.
17. Hoàng Thị Phi Phượng, Trần Thị Hạnh (2005), “Nghiên cứu ảnh hưởng của thức ăn gây nhiễm E.coli và Salmonella ñối với lợn con sau cai sữa”,
Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………………… 65
18. Phan Thanh Phượng (1988), Phịng và chống bệnh phó thương hàn lợn. NXB Nông thôn, Hà Nội.
19. Lê Văn Tạo (1993), “Phân lập, ñịnh danh vi khuẩn Salmonella gây bệnh cho lợn”. Báo cáo khoa học mã số KN 02 – 15, NXB Nông nghiệp, Hà Nội.
20. Lê Văn Tạo, Nguyễn Thị Vui (1994), “Phân lập và ñịnh typ vi khuẩn
Salmonella gây bệnh cho lợn”. Tạp chí Nơng nghiệp và cơng nghiệp thực phẩm,
số 11, tr. 430- 431.
21. Nguyễn Như Thanh, Nguyễn Bá Hiên, Trần Thị Lan Hương 2001. Vi sinh vật Thú y. NXB Nông nghiệp, Hà Nội.
22. Tô Liên Thu (2005), Nghiên cứu tình trạng ơ nhiễm một số vi khuẩn vào thịt lợn, thịt gà sau giết mổ ở Hà Nội và một số phương pháp làm giảm sự nhiễm khuẩn trên thịt. Luận án Tiến sỹ Nông nghiệp, Viện Thú y Quốc gia Hà Nội.
23. Nguyễn Quang Tuyên (1996), Nghiên cứu đặc tính của một số chủng Salmonella gây bệnh tiêu chảy ở bê nghé và biện pháp phòng trị. Luận án PTS Khoa học Nông nghiệp, Viện thú y quốc gia Hà Nội.
24. Tạ Thị Vịnh, ðặng Khánh Vân (1996), “Bước đầu thăm dị và xác ñịnh
E.coli và Salmonella trên lợn bình thường và lợn mắc hội chứng tiêu chảy tại Hà Tây và Hà Nội”. Tạp chí Khoa học kỹ thuật thú y, số 1, tr. 41- 44.
II. Tài liệu nước ngoài
25. Asai T, Otagiri Y, Osumi T, Namimatsu T, Hirai H and Sato S (2002), “Isolation of Salmonella from Diarrheic Feces of Pig”. J. Vet. Med. Sci.
64, 2, p. 159- 160.