3.4. Phương pháp nghiên cứu
3.4.6.Xác ñịnh một số yếu tố gây bệnh (ñộc tố ñường ruột (Stn), yếu tố xâm
nhập (InvA)) của các chủng Salmonella bằng phương pháp PCR
* Tách DNA:
Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………………… 33
máu ở 37oC trong 24 giờ.
- Lấy 1 – 2 khuẩn lạc hịa vào 300 µl nước khử ion vơ trùng.
- ðun cách thủy ở 100oC/15 phút, ly tâm 10.000 vòng/phút/10 phút. - Hút phần dịch nổi có chứa DNA để làm phản ứng PCR.
* Primer (mồi):
Trình tự các các cặp mồi và kích thước các sản phẩm PCR dùng để xác ñịnh ñộc tố ñường ruột (Stn), yếu tố xâm nhập (InvA) của Salmonella dựa trên các nghiên cứu đã được cơng bố của các tác giả: Cloeckaert và cs. (2006); Cortez và cs. (2006); Skyberg và cs. (2006).
Bảng 3.2. Trình tự các cặp mồi và kích thước sản phẩm xác định một số yếu tố gây bệnh của các chủng Salmonella phân lập được
Ký hiệu primer Trình tự primer Kính thước sản phẩm (bp) Stn- F Stn- R 5’- CTTTGGTCGTAAATAAGGCG- 3’ 5’- TGCCCAAAGCAGAGAGATTC- 3’ 259 InvA- F InvA- R 5’- TTGTTACGGCTATTTTGACCA- 3’ 5’- CTGACTGCTACCTTGCTGATG- 3’ 521 * Hỗn hợp phản ứng PCR bao gồm các thành phần: 5µl PCR buffer 5x 750mM Tris-HCl (pH 8.8) 200mM (NH4)2SO4, 0,1% Tween 20) (ABgene) 2mM MgCl2,200µM của mỗi loại dNTP] 1 µl mỗi loại primer (3,2 µM /µl).
0,05 µl Taq DNA Polymerase ( 5 units/µl) (Abgene). Nước cất vừa đủ 25 µl cho một phản ứng.
Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………………… 34
• Giai đoạn tiền biến tính : 94oC - 5 phút – 1 chu kỳ • Giai đoạn biến tính : 94oC - 1 phút
Giai ñoạn bắt cặp mồi : 50oC - 1 phút – 30 chu kỳ Giai ñoạn tổng hợp :72oC - 1 phút
• Giai đoạn kéo dài : 72oC - 7 phút – 1 chu kỳ * Chạy ñiện di:
Sản phẩm PCR thu ñược sau chu trình phản ứng được nhuộm với chất nhuộm mẫu (loading dye) theo tỉ lệ 1:5. Sau đó chạy điện di trên Gel Agarose 2% trong dung dịch ñệm TAE (Tris- Acetate- EDTA) với hiệu ñiện thế 100V trong 30 phút.
* Nhuộm gel và ñọc kết quả:
Gel sau khi chạy ñiện di ñược nhuộm bằng chất nhuộm màu huỳnh quang Ethidium Bromide (1 µl/ml) trong vịng 15 phút; chụp ảnh với hệ thống Gel Doc 2000 dưới đèn UV (300 nm). Kích thước các băng DNA được so với DNA chuẩn (DNA marker).