NGHIÊN CỨU THU NHẬN COLLAGEN TỪ GÂN VÀ DA BÒ BẰNG COLLAGENASE TỪ VI SINH VẬT VÀ THỰC VẬT, ĐỊNH HƯỚNG ỨNG DỤNG TRONG BĂNG GẠC ĐIỀU TRỊ VẾT THƯƠNG HỞ

Trong y học, vật liệu sinh học rất cần thiết khi điều trị cho bệnh nhân cần phẫu thuật, bệnh nhân tổn thương da do bỏng hoặc do nhiều nguyên nhân khác, giúp người bệnh được tiếp cận phương pháp chữa bệnh an toàn, rút ngắn thời gian chờ đợi, tạo tâm lý dễ chịu. Loại vật liệu sinh học có tiềm năng ứng dụng lớn trong điều trị các vết thương hở là collagen. Sử dụng băng gạc có bổ sung collagen đã phân cắt thành dạng kích thước nhỏ, hòa tan, sẽ giúp phóng thích collagen làm mau lành vết thương, giảm đáng kể nguy cơ xuất hiện sẹo. Đó là do collagen, đặc biệt là loại hòa tan, mạch ngắn, là thành phần chính trong lớp hạ bì và mạch máu, có chức năng chính là tăng tính đàn hồi và phục hồi các liên kết các mô tế bào. Collagen từ bò được chứng minh là có thành phần gần gũi với collagen từ con người, ít gây phản ứng miễn dịch trong quá trình điều trị, do vậy chủ yếu được nghiên cứu và sử dụng trong điều trị hơn so với collagen từ lợn và cá. Do collagen sản xuất bằng phương pháp vật lý, hóa học sẽ làm mất các chức năng sinh học của collagen, thời gian phân cắt kéo dài, nên phương pháp được quan tâm hiện nay là cắt liên kết các sợi collagen bằng collagenase, làm tăng các đoạn có kích thước nhỏ, rút ngắn thời gian, hiệu suất thu và sản phẩm collagen có tính hòa tan cao hơn, bảo toàn đặc điểm sinh học, thân thiện môi trường. Collagenase từ vi khuẩn có khả năng cắt hầu hết các loại collagen và tại nhiều vị trí trên sợi collagen. Các collagenase này hầu hết đều có nguồn gốc từ vi sinh vật gây bệnh cho người do vậy vẫn mang một đoạn protein của virus có khả năng làm loét rộng vết thương. Collagenase từ L. sphaericus vi khuẩn không gây bệnh cho người chưa được nghiên cứu rộng rãi ngoài thông tin công bố trình tự gene mã hóa collagenase trong hệ gen, nhưng không mang trình tự mã hoá của virus. Đây là một ưu điểm khi sử dụng enzyme từ vi khuẩn này tạo sản phẩm collagen không chứa các tác nhân gây miễn dịch hoặc dị ứng. Bên cạnh đó việc phối hợp protease từ thực vật như dứa hay đu đủ, giúp phân cắt các liên kết nội phân tử collagen sau khi bó sợi bị cắt bởi collagenase sẽ rút ngắn thời gian tạo các đoạn collagen ngắn, hòa tan. Nghiên cứu enzym để phân cắt các phụ phẩm như da và gân bò được công bố tập trung nhiều collagen hòa tan chưa có tại Việt Nam. Vì những lý do trên, đề tài “Nghiên cứu thu nhận collagen từ gân và da bò bằng collagenase từ vi sinh vật và thực vật, định hướng ứng dụng trong băng gạc điều trị vết thương hở” được đề xuất thực hiện. Mục đích đề tài là tìm ra quy trình thu nhận collagen từ phân cắt gân và da bò bằng enzyme đạt hiệu suất cao, đơn giản, phù hợp với điều kiện Việt Nam, thân thiện môi trường, biến các phụ phẩm chế biến trở thành nguồn nguyên liệu có giá trị

SỞ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO HÀ NỘI TRƯỜNGTHPT NGUYỄN THỊ MINH KHAI - QUẬN BẮC TỪ LIÊM

- Đơn vị công tác: Viện Công nghệ sinh

học – Viện Hàn lâm KH & CN VN

TÁC GIẢ:

Trần Minh Tâm Lớp: 11B12 Trường: THPT Nguyễn Thị Minh Khai

Hà Nội, tháng 11 năm 2014

MỤC LỤC

Trang

PHẦN II TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU VÀ

ĐIỂM MỚI, SÁNG TẠO CỦA ĐỀ TÀI

3PHẦN III QUÁ TRÌNH NGHIÊN CỨU VÀ KẾT QUẢ 4

III.2 Nghiên cứu điều kiện nuôi cấy thích hợp để thu nhận

collagenase từ chủng vi khuẩn Lysinibacillus sphaericus

VN3

5

III.3 Nghiên cứu thu nhận collagenase từ L sphaericus VN3 10III.4 Nghiên cứu thu nhận protease từ đu đủ và dứa 12

III.5 Nghiên cứu khả năng phân cắt collagen của enzym từ L

sphaericus VN3, dịch chiết đu đủ và dứa

gian chờ đợi, tạo tâm lý dễ chịu Loại vật liệu sinh học có tiềm năng ứng dụnglớn trong điều trị các vết thương hở là collagen Sử dụng băng gạc có bổ sungcollagen đã phân cắt thành dạng kích thước nhỏ, hòa tan, sẽ giúp phóng thíchcollagen làm mau lành vết thương, giảm đáng kể nguy cơ xuất hiện sẹo Đó là

do collagen, đặc biệt là loại hòa tan, mạch ngắn, là thành phần chính trong lớp

hạ bì và mạch máu, có chức năng chính là tăng tính đàn hồi và phục hồi các liênkết các mô tế bào Collagen từ bò được chứng minh là có thành phần gần gũi vớicollagen từ con người, ít gây phản ứng miễn dịch trong quá trình điều trị, do vậychủ yếu được nghiên cứu và sử dụng trong điều trị hơn so với collagen từ lợn và

cá Do collagen sản xuất bằng phương pháp vật lý, hóa học sẽ làm mất các chứcnăng sinh học của collagen, thời gian phân cắt kéo dài, nên phương pháp đượcquan tâm hiện nay là cắt liên kết các sợi collagen bằng collagenase, làm tăng cácđoạn có kích thước nhỏ, rút ngắn thời gian, hiệu suất thu và sản phẩm collagen

có tính hòa tan cao hơn, bảo toàn đặc điểm sinh học, thân thiện môi trường

Collagenase từ vi khuẩn có khả năng cắt hầu hết các loại collagen và tại nhiều vịtrí trên sợi collagen Các collagenase này hầu hết đều có nguồn gốc từ vi sinhvật gây bệnh cho người do vậy vẫn mang một đoạn protein của virus có khả

năng làm loét rộng vết thương Collagenase từ L sphaericus - vi khuẩn không

gây bệnh cho người - chưa được nghiên cứu rộng rãi ngoài thông tin công bốtrình tự gene mã hóa collagenase trong hệ gen , nhưng không mang trình tự mã

hoá của virus Đây là một ưu điểm khi sử dụng enzyme từ vi khuẩn này tạo sản

phẩm collagen không chứa các tác nhân gây miễn dịch hoặc dị ứng Bên cạnh đóviệc phối hợp protease từ thực vật như dứa hay đu đủ, giúp phân cắt các liên kếtnội phân tử collagen sau khi bó sợi bị cắt bởi collagenase sẽ rút ngắn thời giantạo các đoạn collagen ngắn, hòa tan Nghiên cứu enzym để phân cắt các phụphẩm như da và gân bò được công bố tập trung nhiều collagen hòa tan chưa cótại Việt Nam Vì những lý do trên, đề tài “Nghiên cứu thu nhận collagen từ gân

và da bò bằng collagenase từ vi sinh vật và thực vật, định hướng ứng dụng trongbăng gạc điều trị vết thương hở” được đề xuất thực hiện Mục đích đề tài là tìm

ra quy trình thu nhận collagen từ phân cắt gân và da bò bằng enzyme đạt hiệusuất cao, đơn giản, phù hợp với điều kiện Việt Nam, thân thiện môi trường, biếncác phụ phẩm chế biến trở thành nguồn nguyên liệu có giá trị

PHẦN II TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU VÀ ĐIỂM MỚI, SÁNG

TẠO CỦA ĐỀ TÀI

Trong y học, collagen thủy phân sản xuất từ bò đã được công nhận là mộtloại thuốc uống và thuốc tiêm an toàn dùng cho con người Từ năm 1981, hai

thương mại là Zyderm và Zyplast đã được sử dụng rộng rãi cho điều trị các bấtthường đường viền mô mềm Hiện nay, collagen tinh khiết từ bò được sử dụngtrong ngành công nghiệp thẩm mỹ như da và răng và điều trị các bệnh khớp, gân

và sụn, được đánh giá hiệu quả trong điều trị phục hồi các vết bỏng sâu và rộng.Collagen chiếm 6 % thể trọng của gân, khoảng 70% cấu trúc da và được phân bốchủ yếu ở lớp hạ bì của da Đã có 29 loại collagen được công bố, collagen hòatan loại I là phổ biến nhất và thường ở trong các mô liên kết như da, xương, gân.Collagen này có khả năng làm tăng tính đàn hồi và phục hồi các liên kết ở các

mô tế bào Collagenase là enzyme phân cắt liên kết peptide trên bó sợi collagentạo collagen hòa tan Collagenase từ vi khuẩn có tính ưu việt là phân cắtcollagen hòa tan và không hòa tan, cắt hầu hết các loại collagen và nhiều vị trí

trên sợi collagen Collagenase từ Clostridium histolyticum được nghiên cứu và sản xuất từ năm 1958 cho đến nay Các collagenase từ Pseudomonas aeruginosa (1975), từ vi sinh vật biển Vibrio sp và Achromobacter iophagus (1996), hầu

hết đều là vi sinh vật gây bệnh cho người, vẫn mang một đoạn protein của virut

có khả năng làm mở rộng vết loét của vết bỏng Lysinibacillus sphaericus là vi

khuẩn có lợi và được xem như tác nhân diệt muỗi sinh học dùng trong kiểm soát

dịch sốt xuất huyết, sốt rét Collagenase từ L sphaericus chưa được nghiên cứu

rộng rãi ngoài thông tin công bố trình tự gene mã hóa collagenase trong hệ gencủa vi khuẩn này, nhưng không mang đoạn gen mã hóa của virus Khi sử dụngenzyme từ vi khuẩn này tạo sản phẩm collagen mạch ngắn, hòa tan sẽ khôngchứa các tác nhân gây miễn dịch hoặc dị ứng

Điểm mới, sáng tạo của đề tài: Sử dụng nguồn vật liệu giá thành rẻ, dồi

dào ở Việt Nam là gân và da bò để tạo collagen mạch ngắn, nhờ phân cắt bằng

collagenase từ L sphaericus, là vi khuẩn không gây bệnh cho người, chưa có nghiên cứu nào liên quan đến hoạt tính collagenase của vi khuẩn này Sử dụng

thêm một số enzyme từ thực vật rẻ tiền, sẵn có (dứa, đu đủ) nâng cao khả năngphân cắt collagen, rút ngắn thời gian, thân thiện với môi trường hơn con đườngphân cắt bằng hóa học Tạo quy trình sản xuất collagen khép kín, vô trùng đemlại hiệu quả kinh tế cao và an toàn, phù hợp với điều kiện trong nước, tận dụng

và nâng cao giá trị của các phụ phẩm chế biến Đây là một hướng nghiên cứumới tại Việt Nam, có ý nghĩa khoa học và thực tiễn, có tiềm năng ứng dụng cao

PHẦN III QUÁ TRÌNH NGHIÊN CỨU VÀ KẾT QUẢ

Nội dung nghiên cứu

 Nghiên cứu điều kiện nuôi cấy thích hợp để thu nhận collagenase từ

chủng vi khuẩn L sphaericus VN3.

 Nghiên cứu thu nhận collagenase từ chủng vi khuẩn L sphaericus

VN3

 Nghiên cứu thu nhận protease từ đu đủ và dứa

 Nghiên cứu khả năng phân cắt collagen của enzym thô từ L.

sphaericus VN3 và dịch chiết đu đủ, dứa.

 Nghiên cứu điều kiện phân cắt gân và da bò bằng enzym từ L.

sphaericus VN3 và đu đủ, dứa.

 Nghiên cứu tách chiết collagenase từ chủng L sphaericus VN3 và

protease từ đu đủ, dứa

 Nghiên cứu điều kiện thích hợp cho tạo màng collagen

 Lựa chọn các thành phần bổ sung thích hợp cho màng collagen dùngtrong điều trị bỏng

 Thử nghiệm màng collagen trên thỏ đã gây bỏng thực nghiệm

 Xây dựng quy trình thu nhận collagen khép kín vô trùng, đơn giản

III.1 Chuẩn bị vật liệu collagen

III.1.1 Dụng cụ, thiết bị và hóa chất

- Dụng cụ: cốc đong 1000 ml nhựa, hộp nhựa đựng da/gân bò, bình thủy tinhđựng hỗn hợp dịch collagen thô

- Thiết bị: tủ lạnh Toshiba (Nhật), máy xay thịt (Việt Nam), máy ly tâm (Sorvall,Mỹ) , máy đo pH (Mettler Toledo, Anh)

- Hóa chất: nước cất, dung dịch Na2HPO4 0,05M (17,907 g/L), acetic acid 0,5M(30,025 g/L), EDTA 5mM (1,861 g/L), cồn 70o

III.1.2 Tạo vật liệu collagen

Vật liệu collagen dùng trong các thí nghiệm được chuẩn bị như sau:

- Bước 1: Rửa sạch da/ gân bò bằng nước cất, sau đó bằng cồn 70o, ngâm gân/datrong cồn 70o Vệ sinh dụng cụ và máy xay bằng cồn 70o

- Bước 2: Ngâm da/gân bò đã xay trong Na2HPO4 0,05M ở pH 8,7-9,1 ở 4oCtrong 24 giờ, thay dịch ngâm 2 đến 3 lần trong quá trình ngâm

- Bước 3: Loại bỏ dịch ngâm và thay bằng acetic acid 0,5M + EDTA 5mM

- Bước 4: Ly tâm loại bỏ cặn (phần collagen không bị cắt/ phần protein khôngphải collagen) thu được hỗn hợp dịch collagen thô

- Bước 5: Thu dịch keo collagen thô và bảo quản trong tủ lạnh 4oC để dùng chocác thí nghiệm

Hình 1 Gân và da bò Hình 2 Keo collagen thô

III.2 Nghiên cứu điều kiện nuôi cấy thích hợp để thu nhận collagenase từ

chủng vi khuẩn Lysinibacillus sphaericus VN3

III.2.1 Lựa chọn môi trường thích hợp cho sinh trưởng và sinh collagenase của chủng L sphaericus VN3

Dụng cụ, thiết bị và hóa chất:

- Dụng cụ: bình tam giác dung tích 250 ml (8 cái), que cấy đầu tròn (1 cái)

- Thiết bị: tủ ấm nuôi vi sinh vật (Friocell, Đức), nồi khử trùng (ALP, Nhật),máy quang phổ (Labomed, Tây Ban Nha)

- Hóa chất: collagen (Sigma, Mỹ), các hoá chất có trong thành phần môi trường

Thí nghiệm:

- Chuẩn bị môi trường nuôi cấy:

+ Môi trường LB lỏng: chuẩn bị 2 loại có bổ sung và không bổ sung collagen

+ Chuẩn bị 100 ml dung dịch muối vi lượng

- Cấy giống: lấy một vòng que cấy sinh khối chủng vi khuẩn L sphaericus VN3

từ ống thạch nghiêng chuyển vào môi trường lỏng trong bình tam giác đã được

để nguội Chuyển các bình tam giác đã cấy chủng vào máy lắc tốc độ 220 vòng/phút, nuôi ở 37oC trong 24 giờ

- Kiểm tra kết quả: Khi kết thúc nuôi cấy tiến hành đánh giá mức độ sinh trưởngbằng cách đo OD dịch nuôi cấy trên máy quang phổ ở bước sóng 600 nm và sựsinh tổng hợp collagenase Môi trường cho giá trị OD và hoạt tính collagenasecao nhất sẽ được lựa chọn để dùng trong các thí nghiệm tiếp theo

+ Cách đo giá trị OD 600 nm: rửa cuvet bằng nước cất, úp miệng cuvet xuốnggiấy thấm cho hút hết nước, dùng pipet bơm 1 ml nước cất vào cuvet, đặt vàomáy, đợi màn hình hiện lên giá trị đo nhấn O/T để đưa về giá trị 0; đổ nước ra và

úp miệng cuvet xuống giấy thấm như trên, bơm 1 ml dịch cần đo độ hấp phụ, đặtvào máy, ghi lại giá trị hiển thị trên màn hình

+ Phương pháp xác định hoạt tính collagenase [7]:

Hoạt tính collagenase được xác định bằng cách đo lượng Leucine giải phóng ra

từ cơ chất collagen qua quá trình ủ với dịch enzyme thô Một đơn vị hoạt tínhenzyme được định nghĩa là lượng enzyme cần để giải phóng ra 1µmol Leucine

từ cơ chất collagen trong điều kiện thí nghiệm Sử dụng ninhydrin và L-Leucine(pha ở các nồng độ 0,2; 0,4; 0,6; 0,8; 1; 1,2 µmol/ml) xây dựng đường chuẩn

Hình 3 Đường chuẩn Leucine

vi khuẩn L sphaericus VN3 chứa enzyme thô ở 37oC trong 2 giờ Ly tâm 7000vòng/phút trong 15 phút và thu dịch nổi Hút 0,5ml dịch nổi vào ống effpendofsau đó bổ sung 0,2ml ninhydrin 4% (w/v) và đo độ hấp thụ ánh sáng ở bướcsóng 570nm

Hoạt độ collagenase được xác định theo công thức sau:

Hoạt độ enzyme E = (y*0,7)/(0,7*0,25) (u/ml)

cấy chủng L sphaericus VN3 cho sinh collagenase Môi trường LB được lựa

chọn là môi trường nhân giống tạo sinh khối cho lên men collagenase

Bảng 1 Sinh trưởng và sinh tổng hợp collagenase của chủng L sphaericus

VN3 trên các môi trường khác nhau

Môi trường Khả năng sinh trưởng

III.2.2 Lựa chọn pH, nhiệt độ và nồng độ NaCl thích hợp cho sinh trưởng

và sinh collagenase của chủng L sphaericus VN3

Dụng cụ, thiết bị và hóa chất:

- Dụng cụ: bình tam giác dung tích 250 ml (6 cái), que cấy đầu tròn (1 cái)

- Thiết bị: tủ ấm nuôi vi sinh vật (Friocell, Anh), nồi khử trùng (ALP, Nhật)

- Hóa chất: các hoá chất có trong thành phần môi trường ISP9

Thí nghiệm:

Để xác định khả năng sinh trưởng của vi khuẩn L sphaericus VN3 ở các

điều kiện khác nhau, vi khuẩn được nuôi cấy trên môi trường ISP9 lỏng ở 37oC

có bổ sung 1% collagen không hòa tan và nồng độ NaCl tăng dần từ 1 - 10 %,hoặc nuôi ở nhiệt độ (4oC; 10oC; 20oC; 30oC; 37oC và 45oC) và pH khác nhau (từ

pH 4,0 - 10,0) Quan sát sự phát triển và xác định khả năng sinh collagenase của

vi khuẩn trên môi trường sau 1 - 3 ngày nuôi cấy

Bảng 2 Ảnh hưởng của pH, nhiệt độ và nồng độ NaCl đến sự sinh trưởng

và sinh collagenase của chủng L sphaericus VN3

Điều kiện nuôi cấy Sinh trưởng (OD600) Hoạt tính collagenase (U/ml)

-Qua quá trình thí nghiệm cho thấy (Bảng 2, Hình 6) chủng vi khuẩn VN3

là chủng ưa ấm, phát triển ở nhiệt độ từ 20oC đến 37oC, và phát triển tốt ở 37oC

Ở 4oC và 10oC chủng vi khuẩn không phát triển, khi nhiệt độ lên tới 45oC chủng

vi khuẩn ngừng phát triển Chủng vi khuẩn VN3 không phát triển ở pH axit, ở

pH từ 6 đến 10 chủng có khả năng phát triển, phát triển tốt ở khoảng pH từ 7 đến

8 Khi pH tăng lên 10 khả năng sinh trưởng của chủng VN3 giảm mạnh Ở nồng

độ NaCl thấp khả năng sinh trưởng của chủng tốt, khi nồng độ % NaCl trongmôi trường tăng lên, khả năng sinh trưởng của chủng giảm dần Tại nồng độ trên

7%, chủng bị ức chế sinh trưởng Như vậy lựa chọn điều kiện nuôi cấy chủng vi

khuẩn L sphaericus VN3 là ở 37oC, NaCl ≤ 5% và pH=7

A B C Hình 6 Chủng VN3 sinh trưởng trên môi trường ISP9 có nồng độ NaCl (A), pH (B), nhiệt độ (C) khác nhau

III.3 Nghiên cứu thu nhận collagenase từ L sphaericus VN3

III.3.1 Dụng cụ, thiết bị và hóa chất

- Dụng cụ: bình tam giác dung tích 1000 ml (3 cái), que cấy đầu tròn (1 cái), ốngnghiệm 18x180 mm (5 cái)

- Thiết bị: tủ ấm nuôi vi sinh vật, nồi khử trùng, máy lắc ổn nhiệt (CPT, HànQuốc)

- Hóa chất: các hoá chất có trong thành phần môi trường ISP9

III.3.2 Thí nghiệm

- Nhân giống vi khuẩn cho lên men

Chủng vi khuẩn L sphaericus VN3 từ ống nghiệm thạch nghiêng được

hoạt hóa bằng cách cấy sang ống nghiệm mới nuôi 24 giờ, rồi được cấy vào môitrường LB, nuôi ở 37o C trong thời gian 24 giờ trên máy lắc tốc độ 220vòng/phút Mật độ giống vi khuẩn đạt 108 CFU/ml

- Phương pháp lên men

Cấy giống vi khuẩn vào bình tam giác 1000ml lên men với tỉ lệ 10%(v/v), nuôi trên máy lắc tốc độ 220 vòng/phút ở 37 o C trong thời gian 30 giờ.Môi trường lên men sử dụng là ISP9 + 1% collagen thô, pH = 7 Trong quá trìnhlên men lấy 10 ml mẫu định kỳ mỗi 3 giờ để xác định sự sinh trưởng (giá trị

OD600) và hoạt tính collagenase (U/ml), kết quả thu được cho thấy từ giờ thứ 12chủng bắt đầu sinh collagen và hoạt tính cao nhất tại 24 giờ, như vậy thời điểmthích hợp nhất để dừng lên men và thu collagenase là 24 giờ (Bảng 3)

Bảng 3 Biến động quá trình lên men sinh collagenase bởi chủng L sphaericus VN3

Thời gian (Giờ) Sinh trưởng (OD600) Hoạt tính collagenase (U/ml)

Dung dịch thuốc thử Bradford: dung dịch thuốc thử có thành phần trong 1lít như sau: Coomasie Brilliant Blue G250 cân 0,1 g và làm tan trong 50 mlmethanol, pha lõang với nước cất thành 500 ml để dược dung dịch (1), đựngtrong chai màu tối có nắp 100 ml H3PO4 85% pha lõang thành 500 ml đượcdung dịch (2) Khi cần sử dụng hòa 1 V (1) và 1V (2) rồi lọc lấy dịch trong.

- Tiến hành:

Chuẩn bị một loạt 8 ống theo số thứ tự 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 để xây dựng đườngchuẩn theo Bảng 4 và 1 ống effpendof chứa mẫu cần phân tích Đo độ hấp thụcủa dung dịch ở bước sóng 595 nm

- Tính kết quả:

Vẽ đường tuyến tính giữa nồng độ albumin với mật độ quang OD595 Dựa vàophương trình đường tuyến tính giữa nồng độ protein với mật độ quang OD595 ởtrên tính được hàm lượng protein ở trong mẫu phân tích

Bảng 4 Xây dựng đường chuẩn albumin

STT

Nồng độ albumin

(mg/ml)

Dung dịch BSA(ml)

8 0 0 2,0 ml

Hình 6 Đường chuẩn protein

Dựa vào phương trình đường chuẩn y= 1,565x – 0,052 tính được hàm lượngprotein trong dịch nuôi cấy chủng VN3 là 0,1 mg/ml, từ đó tính được hoạt tính

collagenase riêng của chủng VN3: 122,8 U/mg protein

III.4 Nghiên cứu thu nhận protease từ đu đủ và dứa

III.4.1 Dụng cụ, thiết bị và hóa chất

- Dụng cụ: rây để lọc, cốc đong 500 ml, 1000 ml

- Thiết bị: máy xay sinh tố (Philips, Malaysia), Cân Shimadzu AY220 Max 220gd=0.1mg

- Hóa chất: Cồn 70o, nước cất, đệm Tris HCl 0,5 M pH = 5 ( cân 36,342g Trisbase hòa tan trong 1 lít nước cất, chỉnh pH bằng dung dịch HCl 10N)

- Vật liệu: đu đủ xanh, cuống quả dứa

III.4.2 Thí nghiệm

Chiết enzym từ đu đủ và dứa:

Với mục đích rút ngắn thời gian phân cắt collagen thô bằng các nguồn enzym

rẻ tiền, sẵn có tại Việt Nam, enzym từ đu đủ và cuống quả dứa sẽ được thửnghiệm khả năng thủy phân vật liệu collagen Rửa đu đủ và cuống dứa bằngnước sạch, rửa lại bằng nước cất, sau đó bằng cồn 70o Vệ sinh máy xay, cácdụng cụ bằng cồn 70o, cho vào box cấy cùng dứa và đu đủ, bật đèn UV trong 30phút Cân đu đủ xanh hoặc cuống quả dứa, sau đó cho vào máy xay sinh tố,thêm đệm Tris HCl 0,5 M pH = 5 theo tỉ lệ 1:1 (ví dụ có 100 gram đu đủ + 100

ml đệm), xay nhuyễn, đổ ra cốc đong thủy tinh dung tích 1000 ml, lọc bằng rây