- Thời gian: Từ tháng 06/2013 đến 06/
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Phương pháp nghiên cứu vi khuẩn gây bệnh thối nhũn khoai tây
Erwinia carotovora subsp. carotovora
2.3.1. 1. Điều tra và thu thập mẫu bệnh
Mẫu khoai tây bị bệnh thối nhũn được thu thập từ các chợ đầu mối trên
địa bàn Hà Nội và trên các cánh đồng trồng khoai tây khu vực Thường Tín, Đông
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 22
Các mẫu bệnh được thu dựa trên triệu chứng thối nhũn điển hình: mô bệnh bị thối, có màu kem đến màu nâu, ướt, nhũn. Quá trình thối bắt đầu trên bề mặt củ và ăn sâu vào bên trong. Ranh giới giữa mô bệnh và khỏe rõ ràng bởi đường viền tối màu hoặc đen (Hình 2.1). Thường thối nhũn không có mùi trong giai
đoạn đầu phân hủy, nhưng khi có sự xâm nhiễm thứ cấp có mùi rất khó chịu.
Hình 2.1. Mẫu khoai tây bị bệnh thu thập được
Mẫu bệnh thu thập được để riêng biệt trong túi báo, bảo quản ở nhiệt độ
15-200C cho đến khi phân lập vi khuẩn gây bệnh.
2.3.1.2. Phân lập vi khuẩn gây bệnh
Phân lập vi khuẩn gây bệnh được tiến hành theo phương pháp của Furuya
và cộng sự (2002)
• Các bước tiến hành:
- Rửa mẫu dưới vòi nước. - Xịt cồn 70% trên toàn mẫu.
- Cắt những miếng nhỏ (1x1cm) giữa vùng bị bệnh và vùng không bị bệnh trên 3 điểm khác nhau của mẫu bệnh, sau đó đặt vào đĩa Petri đã khử trùng.
- Nhỏ 1ml nước cất đã khử trùng vào sau đó nghiền nát để lấy dịch gốc. - Chuẩn bị 6 ống eppendorf 1.5ml, mỗi ống chứa 900µl nước cất khử trùng. - Hút 100µl dịch gốc nhỏ vào ống 1 trộn đều, tiếp tục hút 100µl dịch từống 1
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 23
nhỏ sang ống 2 và làm lần lượt cho đến ống thứ 6 đểđược các nồng độ pha loãng.
- Lấy 100µl từ các ống eppendorf với 6 nồng độ đã được pha loãng nhỏ
lần lượt vào các đĩa môi trường YPDA và trang đều trên bề mặt đĩa. - Để mẫu trong tủ 280C, sau 24 giờ kiểm tra khuẩn lạc.
- Mô tả đặc điểm của các khuẩn lạc trên đĩa, sau đó chuyển cấy vào môi
trường YPDA mới.
- Bảo quản các chủng vi khuẩn đã phân lập được trong sữa tách béo 10%
ở -20oC để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo.
2.3.1.3. Đánh giá độc tính của tác nhân gây bệnh trên củ khoai tây trong phòng thí nghiệm
Đánh giá độc tính của các tác nhân gây bệnh trong phòng thí nghiệm bằng
phương pháp lây nhiễm trực tiếp lên lát cắt củ khoai tây (Nguyễn Thanh Hà và cs., 2013)
* Các bước tiến hành:
- Các chủng vi khuẩn phân lập được sẽ được lây nhiễm lại trên củ khoai tây sạch bệnh đểđánh giá độc tính của chúng:
- Củ khoai tây được rửa sạch dưới vòi nước chảy. - Xịt cồn 70% lên bề mặt của củ.
- Củ khoai tây được cắt thành những lát có chiều dầy khoảng 1cm và đặt trong đĩa petri.
- Dùng đầu tăm nhọn đã khử trùng lấy nguồn khuẩn nhiễm đã được cấy trên YPDA sau 24 giờ, đâm đều xung quanh lát cắt khoai tây, mỗi lần lấy nguồn khuẩn nhiễm sử dụng cho 2-3 lỗ châm.
- Đối chứng dương được sử dụng là chủng vi khuẩn Erwinia carotovora
subsp. carotovora ATCC175713T (Ecc), gây bệnh thối nhũn điển hình. Đối chứng âm được sử dụng với nước cất khử trùng.
- Mẫu khoai tây sau khi nhiễm được đặt trên giấy thấm ẩm trong đĩa Petri và ủ ở 280C. Quan sát triệu chứng và mức độ biểu hiện bệnh sau 24h, 48h. Mỗi chủng vi khuẩn được lây nhiễm trên 3 lát cắt. Thí nghiệm được lặp lại 3 lần.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 24
2.3.1.4 Xác định khả năng sản sinh AHLs
Xác định khả năng sản sinh AHLs của vi khuẩn gây bệnh theo phương pháp đồng nuôi cấy của Molina và cộng sự (2003) với một số thay đổi.
Xác định khả năng sản sinh AHLs chuỗi ngắn
• Các bước tiến hành:
- Chủng vi khuẩn chỉ thị CV026 và Ecc được cấy trên môi trường LB và
YPDA tương ứng và ủở 28oC trong 48 giờ.
- Các chủng vi khuẩn nghiên cứu được cấy trên môi trường YPDA và ủ ở
28oC trong 24 giờ.
- Các chủng vi khuẩn được cấy vạch thành một đường trên môi trường LB, kèm sát bên phải là chủng vi khuẩn chỉ thị CV026 cũng được cấy vạch thành một đường, tạo thành 2 đường cấy song song.
- Đối chứng dương gồm hai chủng Ecc và CV026 cấy sát nhau.
- Đối chứng âm là chủng Ecc và chủng CV026 được cấy riêng biệt. - Mẫu được để trong tủ 280C.
- Thí nghiệm được làm nhắc lại 3 lần và kết quảđược thể hiện sau 24 giờ.
• Cách đọc kết quả:
- Dương tính (+): vạch cấy của chủng vi khuẩn chỉ thị CV026 chuyển màu tím. - Sản sinh AHLs yếu (±): vạch cấy của chủng vi khuẩn chỉ thị CV026 có màu tím nhạt hơn.
- Âm tính (-): vạch cấy của chủng vi khuẩn chỉ thị CV026 không chuyển màu tím (màu của khuẩn lạc vi khuẩn).
Xác định khả năng sản sinh AHLs chuỗi dài
Làm tượng tự như với thí nghiệm xác định khả năng sản sinh AHLs chuỗi ngắn, với một số thay đổi:
- Chủng đối chứng Bg thay cho chủng Ecc ở thí nghiệm trước. - Chủng chỉ thị VIR07 thay cho chủng CV026 ở thí nghiệm trước. - Thí nghiệm được làm nhắc lại 3 lần và kết quảđược thể hiện sau 24h.
• Cách đọc kết quả:
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 25
- Sản sinh AHLs yếu (±): vạch cấy của chủng vi khuẩn chỉ thị VIR07 có màu tím nhạt hơn.
- Âm tính (-): vạch cấy của chủng vi khuẩn chỉ thị VIR07 không chuyển màu tím (màu của khuẩn lạc vi khuẩn).
Hình 2.2. Thí nghiệm thử khả năng sản sinh AHLs của vi khuẩn
2.3.2. Phương pháp nghiên cứu vi khuẩn nội sinh
2.3.2.1. Vật liệu nghiên cứu
Tổng số 25 mẫu củ khoai tây sạch bệnh thu thập từ các chợ đầu mối trên
địa bàn Hà Nội và các vùng trồng khoai tây ở Thường Tín, Đông Anh.
2.3.2.2. Phương pháp phân lập vi khuẩn nội sinh
Phân lập VKNS được tiến hành theo phương pháp của Furuya và cộng sự
(2002) với một số thay đổi như sau:
Vi khuẩn nội sinh được phân lập và tuyển chọn từ những mẫu khoai tây ngoài tự nhiên. Mẫu thu về được rửa sạch dưới vòi nước để phục vụ cho việc
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 26
phân lập. Ngâm mẫu trong cồn 70% khoảng 3 phút và dung dịch Sodium
hypochlorite (3% Cl-) trong 5 phút. Sau đó rửa 3 lần bằng nước cất vô trùng. Nghiền mẫu trong đĩa petri khử trùng. Nhỏ 1ml nước cất đã khử trùng vào dịch nghiền và trộn đều để tạo dịch gốc. Chuẩn bị 6 ống efpendorf 1.5ml, mỗi ống chứa 900µl nước cất khử trùng. Hút 100µl dịch gốc nhỏ vào ống 1 trộn đều, tiếp tục hút 100µl dịch từống 1 nhỏ sang ống 2 và làm lần lượt cho đến ống thứ 6 để được các nồng độ pha loãng. Lấy 100µl từ các ống pendorf với 6 nồng độ đã
được pha loãng nhỏ lần lượt vào các đĩa môi trường YPDA và trang đều trên bề
mặt đĩa. Để mẫu trong tủ 280C, sau 24h kiểm tra khuẩn lạc. Mô tả đặc điểm của các khuẩn lạc trên đĩa, sau đó chuyển cấy vào môi trường YPDA mới. Bảo quản các chủng VKNS phân lập được trong sữa tách béo 10% ở -20oC để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo.
2.3.3. Tuyển chọn các chủng vi khuẩn nội sinh có khả năng phân huỷ AHLs
trong điều kiện in vitro và in vivo.
2.3.3.1. Vật liệu nghiên cứu
- Tập hợp các chủng VKNS phân lập từ củ khoai tây sạch bệnh.
- Chủng gây bệnh thối nhũn sản sinh AHLs: Erwinia carotovora subsp.
carotovora (Ecc).
- Chủng vi khuẩn chỉ thị Chromobacterium violaceum CV026/VIR 07 có
khả năng phản ứng với các phân tử AHLs và hình thành sắc tố màu tím.
- Môi trường nuôi cấy YPDA (nuôi cấy VKNS) và LB (nuôi cấy chủng
chỉ thị).
2.3.3.2. Phương pháp nghiên cứu
Xác định khả năng phân hủy AHLs của vi khuẩn gây bệnh theo phương
pháp đồng nuôi cấy của Molina và cộng sự (2003) với một số thay đổi.
- Chủng vi khuẩn chỉ thị CV026 và Ecc được cấy trên môi trường LB và
YPDA tương ứng và ủở 28oC trong 48h.
- Các chủng Vi khuẩn nội sinh được cấy trên môi trường YPDA và ủ ở
28oC trong 24h.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 27
đồng nuôi cấy.
- Các chủng VKNS được cấy vạch thành một đường trên môi trường, kèm
sát hai bên là chủng vi khuẩn Ecc và chủng vi khuẩn chỉ thị CV026 cũng được
cấy vạch thành một đường, tạo thành 3 đường cấy song song.
- Đối chứng dương chỉ gồm hai chủng Ecc và CV026 cấy sát nhau - Đối chứng âm là chủng Ecc và chủng CV026 được cấy riêng biệt - Mẫu được để trong tủ 280C.
Lưu ý: Thí nghiệm được làm nhắc lại 3 lần và kết quảđược thể hiện sau 24h. Cách nhận biết:
Dương tính (+): vạch cấy của chủng vi khuẩn chỉ thị CV026 không có
màu tím sẫm;
Phân hủy AHLs một phần (±): vạch cấy của chủng vi khuẩn chỉ thị
CV026 có màu tím nhạt;
Âm tính (-): vạch cấy của chủng vi khuẩn chỉ thị không màu (màu của khuẩn lạc vi khuẩn) (Hình 2.3).
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 28