- Thời gian: Từ tháng 06/2013 đến 06/
d. Giải trình tự
Sản phẩm PCR sau khi kiểm tra trên gel agarose được tinh sạch và giải trình tự sử dụng cặp mồi phổ biến F27 và R1492 bởi Công ty Macrogen, Hàn Quốc.
e. Phân tích trình tự và xây dựng cây phát sinh chủng loại
Trình tự của vùng 16S rARN được phân tích bằng BLASTN trên
GenBank. Cây phát sinh chủng loại được xây dựng theo Kimura (1980) và sử
dụng phương pháp của Saitou và Nei (1987) sử dụng phần mềm MEGA 5.2.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 32
2.3.5.3. Phương pháp đánh giá độ an toàn sinh học của các chủng vi khuẩn nội sinh
Đánh giá độ an toàn sinh học của các chủng vi khuẩn nội sinh dựa trên
Phân nhóm Prokaryotes (Vi khuẩn và vi khuẩn cổ) thành các nhóm nguy cơ (risk
group) trong Các quy định kỹ thuật đối với tác nhân sinh học (Technical Rules for
Biological Agents-TRBA466) công bố bởi Ủy ban về các tác nhân sinh học của
Cộng hòa LB Đức (TRBA 466, 2010) và theo Hướng dẫn số 2000/54/EC của Hội
đồng và Nghị viện Châu Âu về bảo vệ người lao động khỏi nguy cơ khi tiếp xúc
với các tác nhân sinh học. (Directive 2000/54/EC of the European Parliament and
Council of 18.09.2000 on the protection of workers from risks related to exposure
to biological agents at work.). Theo Thông tư số 07 /TT-BYT ngày 14 tháng 5 năm
2012) Danh mục vi sinh vật gây bệnh truyền nhiễm theo nhóm nguy cơ và cấp độ
an toàn sinh học phù hợp kỹ thuật xét nghiệm.
Các loài vi khuẩn được phân thành 4 nhóm nguy cơ trong đó:
Nhóm 1: Không gây bệnh cho người
Nhóm 2: Có thể gây bệnh cho người nhưng không thể lan truyền trong cộng đồng, thường có biện pháp điều trị nếu nhiễm phải.
Nhóm 3: Có thể gây bệnh cho người và tiềm ẩn nguy cơ lan truyền trong
cộng đồng, có biện pháp điều trị nếu nhiễm phải.
Nhóm 4: Gây bệnh nặng cho người và có nguy cơ cao lan truyền trong cộng đồng, chưa có biện pháp điều trị thích hợp.
Dựa vào kết quả phân loại vi khuẩn ở trên, nếu xác định loài vi khuẩn
không thuộc nhóm nguy cơ nào hoặc thuộc nhóm 1 thì tiếp tục sử dụng cho các
nghiên cứu tiếp theo; nếu các loài vi khuẩn thuộc nhóm nguy cơ 2, 3 và 4 thì ngừng sử dụng và tiêu hủy các chủng này bằng khử trùng ở nhiệt độ cao 2 lần liên tiếp sau 24 giờ.
2.3.6. Đánh giá khả năng tồn tại của các chủng vi khuẩn nội sinh bên trong
mô cây chủ
2.3.6.1. Chuẩn bị củ khoai tây
- Rửa củ khoai tây dưới vòi nước chảy cho hết bùn đất và để ráo nước. - Khử trùng bề mặt củ khoai tây với cồn 70% trong 3 phút và tráng sạch
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 33
bằng nước cất khử trùng 3 lần.
- Để củ khoai tây khô tự nhiên.
- Đặt các củ khoai tây vào rổ nhựa lưới và đểở nhiệt độ phòng.
2.3.6.2. Chuẩn bị dịch vi khuẩn:
- Chuẩn bị 500ml dịch huyền phù vi khuẩn nội sinh (mật độ khoảng 106- 107 cfu/ml).
2.3.6.3. Lây nhiễm
- Đối chứng âm: củ khoai tây được ngâm trong 500ml nước cất vô trùng
trong 30 phút.
- Thí nghiệm: củ khoai tây được ngâm trong 500ml dịch khuẩn nội sinh
trong 30 phút.
- Mỗi chủng nội sinh sử dụng 3 củ khoai tây, đặt trong rổ nhựa lưới và giữ ở nhiệt độ phòng.
2.3.6.4. Đánh giá kết quả thí nghiệm
- Kiểm tra sự tồn tại của vi khuẩn nội sinh trong củ khoai tây sau khi lây nhiễm 1 tuần và 2 tuần.
- Mỗi củ khoai tây được khử trùng bề mặt bằng cồn 70% trong 3 phút và rửa 3 lần với nước cất vô trùng trong box cấy.
- Từ mỗi củ khoai tây cắt 3 miếng có kích thước 2.0 x 2.0 cm và cân trọng lượng của 3 lát cắt.
- Dùng dao mổ cắt thành từng miếng nhỏ trong 1ml nước cất vô trùng. - Chuẩn bị 3 ống eppendorf, mỗi ống cho 900µl nước cất vô trùng. Sau khi nghiền mẫu, hút 100µl dịch gốc nhỏ vào ống 1 trộn đều, tiếp tục hút 100µl dịch từống 1 nhỏ sang ống 2 và làm lần lượt cho đến ống thứ 3 đểđược các nồng
độ pha loăng. Lấy 100µl từ các ống eppendorf ở 3 nồng độ đã được pha loãng
nhỏ lần lượt vào các đĩa môi trường YPDA và trà đều trên bề mặt đĩa. Để mẫu trong tủ 280C, sau 48h kiểm tra và đếm số lượng khuẩn lạc.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 34
CHƯƠNG 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Vi khuẩn gây bệnh thối nhũn khoai tây