Nghiên cứu sử dụng vi khuẩn bacillus để phân giải protrin gây dị ứng trong khô dầu đậu nành với phương pháp lên men bán rắn

HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG VI KHUẨN BACILLUS ĐỂ PHÂN GIẢI PROTEIN GÂY DỊ ỨNG TRONG KHÔ DẦU ĐẬU NÀNH VỚI PHƯƠNG PHÁP LÊN MEN BÁN RẮN Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Ch

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP HỒ CHÍ MINH

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG VI KHUẨN BACILLUS

ĐỂ PHÂN GIẢI PROTEIN GÂY DỊ ỨNG

TRONG KHÔ DẦU ĐẬU NÀNH VỚI PHƯƠNG PHÁP LÊN MEN BÁN RẮN

Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Giảng viên hướng dẫn : TS Phạm Huỳnh Ninh Sinh viên thực hiện : Lê Huỳnh Hoài Thương MSSV: 1311100732 Lớp: 13DSH03

LỜI CAM ĐOAN

Đồ án tốt nghiệp này là công trình nghiên cứu của bản thân tôi dưới sự hướng dẫn của TS Phạm Huỳnh Ninh Bộ môn Dinh dưỡng và Thức ăn chăn nuôi, Phân viện chăn nuôi Nam Bộ (IASVN)

Những kết quả có được trong đồ án này hoàn toàn không sao chép từ đồ án tốt nghiệp của người khác dưới bất kì hình thức nào Các số liệu trích dẫn trong đồ án này

là hoàn toàn trung thực Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về đồ án của mình

TP.HCM, ngày 16 tháng 7 năm 2017

Sinh viên thực hiện

Lê Huỳnh Hoài Thương

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành đồ án tốt nghiệp, em xin gởi lời tri ân chân thành đến TS Phạm Huỳnh Ninh đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo em trong suốt thời gian xây dựng đề cương

và hoàn thành đồ án Em xin cám ơn anh Lê Quang Trí và Vũ Minh đã động viên, giúp

đỡ và tạo mọi điều kiện tốt nhất cho em trong suốt quá trình thực hiện

Đồng thời, em cũng gởi lời cám ơn đến quý Thầy, Cô khoa Công nghệ sinh học – Thực phẩm – Môi trường đã tận tình truyền đạt kiến thức cho em trong suốt thời gian dài học tập Với những kiến thức mà em đã tiếp thu được không chỉ giúp cho em thực hiện đồ án tốt nghiệp mà còn là nền tảng kiến thức cho công việc sau này

Em xin gởi lời cám ơn sâu sắc đến gia đình đã luôn chăm sóc, tạo điều kiện cho

em đến trường theo đuổi ước mơ và là chỗ dựa vững chắc không chỉ về tinh thần mà cả vật chất cho em trong suốt những năm qua

Em cũng xin gởi lời cám ơn chân thành đễn các bạn cùng thực hiện đề tài trong phòng thí nghiệm CNSH – Phân viện chăn nuôi Nam Bộ - những người luôn động viên, sát cánh và giúp đỡ hết mình để em hoàn thành tốt đồ án tốt nghiệp này

Cuối cùng, em xin cám ơn các Thầy Cô trong hội đồng phản biện đã dành thời gian đọc và nhận xét đồ án này Em xin gửi đến quí Thầy Cô lời chúc sức khỏe

TP.HCM, ngày 16 tháng 7 năm 2017

Sinh viên thực hiện

Lê Huỳnh Hoài Thương

MỤC LỤC

MỤC LỤC i

DANH MỤC BẢNG iii

DANH MỤC ĐỒ THỊ iv

DANH MỤC HÌNH v

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT vi

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

1.1 Tổng quan về nghiên cứu sản xuất khô dầu đậu nành 4

1.1.1 Lên men khô dầu đậu nành để giảm thiểu chất gây dị ứng 4

1.1.2 Vấn đề sử dụng khô dầu nành lên men 5

1.2 Tổng quan về Bacillus 6

1.2.1 Vi khuẩn Bacillus 6

1.2.2 Vi khuẩn Bacillus subtilis 8

1.3 Tổng quan về protease 11

1.3.1 Khái niệm 11

1.3.2 Phân loại 11

1.3.3 Hoạt tính protease ở đậu nành 12

1.4 Giới thiệu về lên men bán rắn 13

1.4.1 Những vấn đề cơ bản của lên men bán rắn 13

1.4.2 Những ưu điểm của lên men bán rắn 13

1.4.3 Sự tạp nhiễm trong lên men bán rắn 14

1.4.4 Các giai đoạn của lên men bán rắn 15

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 17

2.1 Vật liệu 17

2.1.1 Nguyên vật liệu 17

2.1.2 Thiết bị và dụng cụ 17

2.2 Môi trường nghiên cứu 17

2.2.1 Môi trường phân lập và giữ giống Bacillus 17

2.2.2 Môi trường khảo sát hoạt tính protease của các chủng vi khuẩn 18

2.2.3 Hóa chất SDS-PAGE 19

2.3 Các phương pháp nghiên cứu 19

2.3.1 Phương pháp phân lập, giữ giống vi khuẩn Bacillus 19

2.3.2 Phương pháp định danh 22

2.3.3 Phương pháp khảo sát hoạt tính protease 27

2.3.4 Khảo sát các điều kiện thích hợp cho lên men khô dầu đậu nành 31

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 40

3.1 Phân lập và định danh các chủng Bacillus 40

3.2 Khảo sát hoạt tính protease của vi khuẩn 42

3.2.1 Xác định dựa trên vòng phân giải 42

3.2.2 Xác định dựa trên cơ chất khô dầu đậu nành 44

3.3 Khảo sát các điều kiện lên men 46

3.3.1 Khảo sát độ ẩm thích hợp cho lên men 46

3.3.2 Khảo sát nhiệt độ thích hợp cho lên men 48

3.3.3 Khảo sát độ dày thích hợp cho lên men cơ chất 50

3.3.4 Khảo sát thời gian lên men thích hợp 51

CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 54

4.1 Kết luận 54

4.2 Kiến nghị 54

TÀI LIỆU THAM KHẢO 55

PHỤ LỤC 1

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Thành phần hóa học và axít amin của khô dầu đậu nành tách vỏ Mỹ 5

Bảng 1.2 Đặc điểm sinh hóa của chủng Bacillus subtilis 9

Bảng 2.1 Trình tự bổ sung hóa chất để xây dựng đường chuẩn Tyrosine 29

Bảng 2.2 Các bước xác định hoạt tính enzyme protease 30

Bảng 3.1 Kết quả các thử nghiệm sinh hóa 41

Bảng 3.2 Kết quả vòng phân giải gelatin 42

Bảng 3.3 Hoạt tính enzyme protease (U/g) 44

Bảng 3.4 Kết quả tăng trưởng vi sinh vật qua các khung giờ ở các mức độ ẩm khác nhau 46

Bảng 3.5 Kết quả tăng trưởng vi sinh vật qua các khung giờ ở các mức nhiệt độ khác nhau 48

Bảng 3.6 Kết quả tăng trưởng vi sinh vật qua các khung giờ ở các mức độ dày khác nhau 50

Bảng 3.7 Kết quả tăng trưởng vi sinh vật qua các khung giờ khác nhau 52

DANH MỤC ĐỒ THỊ

Đồ thị 3.1 Biểu thị đường kính vòng phân giải gelatin 43

Đồ thị 3.2 Biểu thị hoạt tính enzyme sau các mốc thời gian 44

Đồ thị 3.3 Biểu thị sự tăng trưởng vi sinh vật qua các mốc thời gian ở các mức độ ẩm khác nhau 47

Đồ thị 3.4 Biểu thị sự tăng trưởng vi sinh vật qua các mốc thời gian ở các nhiệt độ khác nhau 49

Đồ thị 3.5 Biểu thị sự tăng trưởng vi sinh vật qua các mốc thời gian ở các độ dày khác nhau 51

Đồ thị 3.6 Biểu thị sự tăng trưởng vi sinh vật qua các mốc thời gian khác nhau 53

DANH MỤC HÌNH

Hình 3.1 Khuẩn lạc vi khuẩn phân lập từ chế phẩm Natto 40

Hình 3.2 Hình dạng vi khuẩn dưới kính hiển vi 40

Hình 3.3 Đường kính vòng phân giải gelatin 42

Hình 3.4 Kết quả điện di SDS-PAGE các mẫu khô dầu nành lên men ở các mức độ ẩm

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

MỞ ĐẦU

❖ Đặt vấn đề

Khô dầu đậu nành, sản phẩm của quá trình tách chiết dầu từ hạt đậu nành, chủ yếu được sử dụng để chế biến thức ăn chăn nuôi gà và heo, chiếm khoảng 74% tổng sản lượng (Chen và ctv, 2010) Khô dầu đậu nành thường được sử dụng với tỷ lệ khoảng 10-20% trong khẩu cho heo và gà Đây là nguồn cung cấp protein rất tốt cho vật nuôi do có hàm lượng các axít amin không thay thế cao

Tuy nhiên, việc sử dụng khô dầu đậu nành trong khẩu phần thức ăn cho gia súc, gia cầm non (hệ tiêu hóa chưa hoàn thiện) bị hạn chế, hiệu quả không cao do khô dầu đậu nành chứa một số protein gây dị ứng

Hai protein gây dị ứng chủ yếu trong đậu nành là glycinin (globulin 11S) và conglycinin (globulin 7S) Chúng chiếm hơn 50% tổng lượng protein trong hạt đậu nành (Samoto và ctv, 2007) Glycinin là một protein với cấu trúc gồm 5 tiểu đơn vị mà mỗi một tiểu đơn vị gồm một chuỗi polypeptide mang tính axít (khối lượng phân tử 35-40 kDa) và một chuỗi polypeptide mang tính bazơ (22 kDa) liên kết với nhau bằng liên kết disulfua (Helm và ctv, 2000; Beardslee và ctv, 2000; Hou và ctv, 2004; Golubovic và ctv, 2005) Tổng lượng glycinin khoảng 20-70mg/g khô dầu đậu nành và chiếm đến 40% tổng khối lượng protein trong đậu nành (van Eys và ctv, 2004; Sun và ctv, 2008) Glycinin có khả năng bền nhiệt và kháng hầu hết các enzyme trong hệ tiêu hóa do có liên kết disulfua khá bền (Kuipers và ctv, 2007) Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng, glycinin gây dị ứng cho người và vật nuôi non do có khả năng gắn globulin miễn dịch E (IgE) vào chuỗi axít polypeptide của mình Nó làm tăng hàm lượng kháng thể glycinin-IgE trong huyết thanh và đây là nguyên nhân gây dị ứng (Sun và ctv, 2007) Mặt dù khá nhiều nghiên cứu cho thấy glycinin liên quan đến các triệu chứng của dị ứng như biến đổi hình dáng nhung mao, đảo lộn chức năng miễn dịch, tăng trưởng chậm và tiêu chảy

β-Tuy nhiên, cơ chế tác động của glycinin như thế nào hiện vẫn chưa được sáng tỏ Một vài nghiên cứu đề nghị rằng các tế bào phì hay dưỡng bào (mast cells) có liên quan trực tiếp đến tính nhạy cảm của vật nuôi đối với protein glycinin Các dưỡng bào này nằm trong các lông tơ của ruột non để thực hiện chức năng nhu động và các quy trình đáp ứng miễn dịch (Schneider và ctv, 2002) Các dưỡng bào này đóng vai trò chủ đạo trong các phản ứng nhạy cảm của cơ thể vật nuôi hay con người đối với phức hợp glycinin-IgE thông qua một chuỗi các hoạt động như kích thích sản xuất một lượng lớn histamine hay các cytokine miễn dịch (van Wijk và ctv, 2007) Tóm lại, glycinin trong khô dầu đậu nành gây kích ứng miễn dịch ở động vật con, làm tăng hàm lượng globulin miễn dịch (IgE, IgG), giải phóng histamine, làm tăng nhu động và sự bài tiết nước của ruột non, dẫn đến tăng tỷ lệ heo con bị tiêu chảy, giảm năng suất (Li và ctv, 1991; Zhao và ctv, 2008; Sun và ctv, 2008; Hao và ctv, 2009)

Trong khi đó β-conglycinin là phân tử protein chứa 3 tiểu đơn vị khác nhau α (72 kDa), α’ (72 kDa) và β (53 kDa) (Doyle và ctv, 1986) Khô dầu đậu nành chứa khoảng 3-40 mg/g β-conglycinin (van Eys và ctv, 2004) β-conglycinin có khả năng kháng lại các enzyme thủy phân so với các protein khác trong đậu nành Các tiểu đơn vị của β-conglycinin có thể kết tạo khối trong ruột non, giấu vị trí hoạt động (bám) đối với enzyme nên nó khó bị tiêu hóa trong hệ tiêu hóa (Kuipers và ctv, 2007) Tương tự như glycinin, β-conglycinin cũng làm giảm sinh trưởng ở heo con thông qua việc làm tăng hàm lượng globulin miễn dịch (IgE) trong huyết thanh, phá hủy tính toàn vẹn của ruột non, làm giảm khả năng hấp thụ các chất dinh dưỡng (Hao và ctv, 2009; Zhao và ctv, 2010) Tóm lại, tuy khô dầu đậu nành là nguồn protein rất tốt cho vật nuôi nhưng nó cũng chứa nhiều chất gây dị ứng Các chất này gây kích ứng miễn dịch, tiêu chảy, ức chế enzyme tiêu hóa, giảm tỷ lệ tiêu hóa, do đó làm giảm tăng trọng và năng suất của vật nuôi, đặc biệt

là vật nuôi giai đoạn non Việc loại bỏ các chất có ảnh hưởng tiêu cực đến sức khỏe của vật nuôi là một đòi hỏi của thực tế sản xuất nhằm nâng cao giá trị dinh dưỡng của nguyên liệu, góp phần giảm chi phí thức ăn

Từ những nhân định trên tôi thực hiện đề tài: “NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG VI

KHUẨN BACILLUS ĐỂ PHÂN GIẢI PROTEIN GÂY DỊ ỨNG TRONG KHÔ DẦU

ĐẬU NÀNH VỚI PHƯƠNG PHÁP LÊN MEN BÁN RẮN”

❖ Mục tiêu, phạm vi đề tài

Phân lập và tuyển chọn chủng vi khuẩn thuộc giống Bacillus có khả năng ngoại

tiết protease cao và ứng dụng chủng vi khuẩn này để lên men bán rắn nhằm loại bỏ các protein gây dị ứng trong khô dầu đậu nành (glycinin, beta-conglycinin)

❖ Ý nghĩa đề tài

Phân lập được chủng vi khuẩn có đặc tính tốt trong sản sinh protease chuyển hóa protein đậu nành, ứng dụng trong lên men khô dầu đậu nành, phục vụ trong chăn nuôi, tiết giảm chi phí

❖ Địa điểm nghiên cứu

Phân viện chăn nuôi Nam Bộ, khu phố Hiệp Thắng, phường Bình Thắng, Dĩ An, Bình Dương

❖ Thời gian nghiên cứu

Từ ngày 17/4/2017 đến 16/7/2017

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Tổng quan về nghiên cứu sản xuất khô dầu đậu nành

1.1.1 Lên men khô dầu đậu nành để giảm thiểu chất gây dị ứng

Có khá nhiều phương pháp để giảm thiểu tác động hay phân hủy các chất trong

khô dầu đậu nành Trong đó, phương pháp lên men vi sinh vật (với Bacillus, Aspergillus

và Lactobacillus) nhằm loại bỏ các chất gây dị ứng trong đậu nành đã được nghiên cứu

và ứng dụng trong thực tiễn sản xuất trên thế giới Trong quá trình lên men, vi sinh vật phân hủy carbohydrate của khô dầu nành và sử dụng chúng để phát triển Việc giảm lượng vật chất khô và tăng mật độ vi sinh làm tăng lượng protein trong khô dầu đậu nành Thêm vào đó, các vi sinh vật dùng cho quá trình lên men còn có khả năng tiết ra môi trường amylase, protease, cellulase có khả năng phân hủy các protein, gây dị ứng và tăng tính dễ tiêu hóa của các chất dinh dưỡng trong khô dầu đậu nành

Chen và ctv (2010) cũng đã tiến hành lên men bán rắn khô dầu đậu nành với

Aspergillus oryzae và lên men kết hợp Aspergillus oryzae với Lactobacillus casei Cả 2

phương pháp lên men đều cho thấy kết quả tốt trong việc tăng cường tính hữu dụng của

protein với hàm lượng trichloroacetic cao, khả năng tiêu hóa protein in vitro cao

Lên men bán rắn khô dầu đậu nành sử dụng vi khuẩn thuộc giống Bacillus cũng

giúp loại bỏ các chất kháng dinh dưỡng, tăng cường các hoạt chất chống oxy hóa, tăng

tỷ lệ tiêu hóa ở heo (Wongputtisin và ctv, 2007; Feng và ctv, 2007a; Hu và ctv, 2010)

Phương pháp lên men sử dụng Bacillus subtilis tỏ ra có nhiều lợi thế hơn so với lên men bằng Aspergillus oryzae trong việc loại bỏ các protein gây dị ứng và cải thiện chất lượng thành phần các axít amin (Frias và ctv, 2007) Bào tử hay tế bào của vi khuẩn Bacillus

trong khô dầu đậu nành lên men còn được xem như nguồn cung cấp probiotic, có lợi cho sức khỏe đường ruột của vật nuôi

Phương pháp lên men sử dụng vi khuẩn Bacillus, Lactobacillus tỏ ra có nhiều lợi

thế hơn so với lên men với nấm mốc do sản phẩm có lượng protein hòa tan cao hơn, khả năng phân giải các protein gây dị ứng tốt hơn, sinh trưởng nhanh hơn (Mukherjee và ctv, 2016)

Bảng 1.1 Thành phần hóa học và axít amin của khô dầu đậu nành tách vỏ Mỹ Stt Thành phần % vật chất

1.1.2 Vấn đề sử dụng khô dầu nành lên men

Khá nhiều nghiên cứu ở ngoài nước đã tiến hành lên men khô dầu đậu nành bằng

vi sinh vật nhằm loại bỏ các chất gây dị ứng và đã sử dụng sản phẩm sau lên men cho nhiều đối tượng vật nuôi Khô dầu đậu nành lên men chứng tỏ có thể giúp tăng cường hoạt động của enzyme tiêu hóa và tăng tỷ lệ tiêu hóa protein, cải thiện tăng trọng và sức khỏe đường ruột, giảm tỷ lệ tiêu chảy ở heo và gà, đặt biệt là heo con và gà con (Mathivanan và ctv, 2006; Cho và ctv, 2007; Feng và ctv, 2007b; Liu và ctv, 2007; Song

và ctv, 2010; Cervantes-Pahm và Stein, 2010; Xu và ctv, 2012; Zhang và ctv, 2013; Kim

và ctv, 2014) Nghiên cứu của Gebru và ctv (2010) cho thấy, khi sử dụng 5% khô dầu

đậu nành lên men bằng Bacillus subtilis trong khẩu phần của heo con, lượng thức ăn ăn

vào và tăng trọng tương đương với heo cho ăn khẩu phần có bổ sung 100 mg/kg kháng

sinh cholotetracycline và cao hơn heo ở khẩu phần không sử dụng kháng sinh Tuy nhiên, hầu như không có bất kỳ nghiên cứu nào liên quan đến việc sản xuất chế phẩm khô dầu đậu nành lên men dùng cho chăn nuôi và có rất ít các nghiên cứu sử dụng sản phẩm khô dầu đậu nành lên men giàu protein này cho chăn nuôi ở nước ta được công bố

Hiện tại, có ít nhất 5 loại sản phẩm khô dầu đậu nành lên men đã được nhập khẩu

và phân phối đại trà tại Việt Nam (Soytide của công ty CJ-Hàn Quốc; P-up 50 và EPS

500 của Thái Lan; Supersoy và Dabomb-P của công ty Suchiang-Đài Loan) với giá bán

từ 19.000-21.000 đ/kg, so với giá khô dầu đậu nành (không lên men) chỉ khoảng 11.000 đ/kg Chúng ta thấy rằng giá bán của khô dầu đậu nành gần như tăng gấp đôi sau khi lên men Hiện tại có khá nhiều nhà máy chế biến thức ăn chăn nuôi tại Việt Nam đã

10.000-sử dụng khô dầu đậu nành lên men trong thức ăn cho heo con như thức ăn Delice B của Proconco, Comfeed651 của công ty Japfa, S1 primary diets của công ty spotlight và viên sữa H-10 của công ty RTD Với 3,9 triệu nái trong đàn lợn của Việt Nam, thì mỗi tháng lượng tiêu thụ khô dầu nành lên men là rất lớn, khoảng 20 ngàn tấn/tháng (> 200 ngàn tấn/năm)

Như vậy, nếu chúng ta có thể sản xuất khô dầu nành lên men từ 3 triệu tấn nguyên liệu này và cung cấp cho thị trường trong nước thì giá trị thặng dư sẽ rất lớn Đề tài thành công đồng nghĩa với việc khô dầu đậu nành lên men sẽ được sản xuất tại Việt Nam với giá cả cạnh tranh hơn sản phẩm ngoại nhập do tiết kiệm được chi phí nhập khẩu và vận chuyển, đồng thời giảm lệ thuộc vào công nghệ của nước ngoài

Bộ: Bacilliales

Họ: Bacilliaceae

Chi: Bacillus

Vi khuẩn thuộc chi Bacillus là nhóm vi sinh vật hiếu khí hay kỵ khí tùy nghi

Chúng phân bố hầu hết trong môi trường tự nhiên, phần lớn cư trú trong đất và rơm rạ,

cỏ khô Đất nghèo dinh dưỡng ở vùng sa mạc, đất hoang thì sự hiện diện của chúng rất hiếm

Vi khuẩn thuộc chi Bacillus là trực khuẩn nhỏ, hai đầu tròn, bắt màu tím Gram

(+), kích thước 0,5 – 0,8µm x 1,5 – 3µm, đơn lẻ hoặc thành chuỗi ngắn thường có 8 –

12 lông, sinh bào tử hình bầu dục nhỏ hơn nằm giữa hoặc lệch tâm tế bào, kích thước từ 0,8 – 1,8µm Bào tử phát triển bằng cách nảy mầm do sự nứt của bào tử, không kháng

xạ, áp suất, chất sát trùng

Các loài vi khuẩn này lên men các loại đường như: glucose, maltose, manitol,

Vi khuẩn Bacillus đã được ứng dụng rất nhiều trong thực tế sản xuất từ lên men sản xuất

các sản phẩm truyền thống phục vụ cho con người (đậu natto, nước mắm, cá hộp…) đến lên men sản xuất các sản phẩm trong lĩnh vực y dược, da giày, chăn nuôi Một ứng dụng

khác của vi khuẩn thuộc Bacillus là thành phần của thuốc trừ sâu sinh học Chủng vi khuẩn thường được sử dụng trong các sản phẩm dạng này là Bacillus thuringiensis Enzym protease tách chiết từ môi trường nuôi cấy vi khuẩn Bacillus (chủ yếu từ Bacillus

subtilis và Bacillus licheniformis) được sử dụng rộng rải trong bột giặt, kem đánh răng,

giày da

Một số các protease mạnh nhất được sản xuất từ Bacillus licheniformis, B

subtilis, B.amyloliquefaciens và B mojavensis Việc sản xuất protease của vi sinh thường

chịu tác động bởi sự biến động nguồn carbon và nitơ, sự thay đổi trong tỷ lệ C/N, sự hiện

diện của một số loại đường dễ dàng chuyển hóa, chẳng hạn như glucose Một số yếu tố vật lý như nhiệt độ, pH… cũng có ảnh hưởng đến sản xuất protease

1.2.2 Vi khuẩn Bacillus subtilis

1.2.2.1 Lịch sử phát hiện

Bacillus subtilis được phát hiện lần đầu tiên vào năm 1835 do Christion Erenberg

và tên của loài vi khuẩn này lúc bấy giờ là “Vibrio subtilis” Gần 30 năm sau, Casimir Davaine đặt tên cho loài vi khuẩn này là “Bacteridium” Năm 1872, Ferdimand Cohn xác định thấy loài trực khuẩn này có đầu vuông và đặt tên là Bacillus subtilis

Năm 1941, Bacillus subtilis được phát hiện trong phân ngựa bởi tổ chức y học

Nazi của Đức Lúc đầu, chúng được dùng chủ yếu để phòng bệnh lị cho các binh sĩ Đức chiến đấu ở Bắc Phi Năm 1949 – 1957, Henry và cộng sự tách được các chủng thuần

khiết của Bacillus subtilis Gần đây, Bacillus subtilis đã được nghiên cứu, sử dụng rộng

rãi trên thế giới Từ đó, thuật ngữ “Subtilis therapy” ra đời Bacillus subtilis được sử dụng ngày càng phổ biến và được xem như sinh vật phòng và trị các bệnh về rối loạn đường tiêu hóa, các chứng viêm ruột, viêm đại tràng, tiêu chảy…Ngày nay, Bacillus subtilis đã và đang được nghiên cứu rộng rãi với nhiều tiềm năng và ứng dụng hiệu quả trong chăn nuôi, công nghiệp, xử lý môi trường…

1.2.2.2 Đặc điểm sinh thái học và phân bố trong tự nhiên

Chúng phân bố hầu hết trong môi trường tự nhiên, phần lớn cư trú trong đất và rơm rạ,

cỏ khô nên được gọi là “trực khuẩn cỏ khô”, thông thường trong đất trồng trọt có khoảng

chúng rất hiếm Ngoài ra, chúng còn có mặt trong các nguyên liệu sản xuất như bột mì

(trong bột mì vi khuẩn Bacillus subtilis chiếm 75 – 79% vi khuẩn tạo bào tử), bột gạo,

trong các thực phẩm như mắm, tương, chao… Bacillus subtilis đóng vai trò đáng kể về

mặt có lợi cũng như mặt gây hại trong quá trình biến đổi sinh học

1.2.2.3 Đặc điểm hình thái

Bacillus subtilis là trực khuẩn Gram dương, hai đầu tròn, kích thước nhỏ 3 – 5 x

0,6 µm, tế bào thường nối với nhau thành chuỗi hoặc đứng riêng rẽ, có khả năng di động, gồm 8 – 12 lông, có bào tử hình elip nhỏ hơn tế bào sinh dưỡng, kích thước 0,8 – 1,8

µm Vị tró của bào tử trong tế bào sinh dưỡng không theo bất cứ một nguyên tắc chặt chẽ nào, có thể lệch tâm hoặc gần tâm nhưng không chính tâm

Bacillus subtilis là khả năng tạo bào tử trong những điều kiện nhất định, mỗi tế

bào sinh dưỡng sinh ra một bào tử Bacillus subtilis có khả năng hình thành bào tử trong

chu trình phát triển tự nhiên hoặc khi vi khuẩn gặp điều kiện bất lợi Bào tử là một khối nguyên sinh chất đặc, có chứa các thành phần hóa học cơ bản như ở tế bào sinh dưỡng nhưng có một vài điểm khác về tỉ lệ giữa các thành phần và có thêm một số thành phần

mới Bacillus subtilis phát triển bằng cách nảy mầm do sự nứt bào tử, không kháng acid,

có khả năng chịu nhiệt, chịu ẩm, tia tử ngoại, tia phóng xạ

1.2.2.4 Đặc điểm sinh hóa

Bacillus subtilis là vi khuẩn hiếu khí nhưng có khả năng phát triển trong môi

lên men không sinh khí các loại đường: Glucose, maltose, manitol, saccharose, xylose, arabinose và một số hoạt tính khác được liệt kê trong bảng sau

Bảng1.2 Đặc điểm sinh hóa của chủng Bacillus subtilis

Phản ứng Kết quả

1.2.2.5 Đặc điểm nuôi cấy

Vi khuẩn Bacillus subtilis phát triển trong điều kiện hiếu khí, tuy nhiên vẫn phát

– 7,4

Vi khuẩn Bacillus subtilis phát triển hầu hết trên các môi trường dinh dưỡng cơ bản:

Trên môi trường thạch đĩa Trypticase Soy Agar (TSA): khuẩn lạc dạng tròn, rìa răng cưa không đều, màu vàng xám, đường kính 3 – 5 mm, sau 1 – 4 ngày bề mặt nhăn nheo, màu hơi nâu

Trên môi trường canh Trypticase Soy Broth (TSB): vi khuẩn phát triển làm đục môi trường, tạo màng nhăn, lắng cặn, kết lại như vẩn mây ở đáy, khó tan khi lắc đều

Trên môi trường giá đậu – peptone: khuẩn lạc dạng tròn lồi, nhẵn bóng, đôi khi lan rộng, rìa răng cưa không đều, đường kính 3 – 4 cm sau 72 giờ nuôi cấy

Nhu cầu dinh dưỡng: chủ yếu cần các nguyên tố C, H, O, N và một số nguyên tố

vi lượng khác Vi khuẩn phát triển tốt trong môi trường cung cấp đủ nguồn carbon (như glucose) và nitơ (như peptone)

1.3 Tổng quan về protease

1.3.1 Khái niệm

Protease hay peptide hydrolase là những enzyme xúc tác sự thủy phân liên kết peptide (-O-NH-) trong phân tử protein và các polypeptide Sản phẩm của quá trình thủy phân này có thể là acid amine, các polypeptide chuỗi ngắn Nhiều enzyme protease còn

có thể xúc tác phản ứng thủy phân liên kết ester, liên kết amide và phản ứng chuyển vị gốc acid amin

1.3.2 Phân loại

Các nhà khoa học đã phân loại protease của vi sinh vật thành 4 nhóm sau:

Protease serin: là những protease có chứa nhóm (-OH) của serin trong trung tâm hoạt động Các protease serin thường hoạt động ở pH kiềm và có tính đặc hiệu tương đối rộng

Protease thiol: là những protease có chứa nhóm thiol (-SH) của axít amin cystein trong trung tâm hoạt động Nhóm (-SH) có khả năng phản ứng cao, tham gia nhiều biến đổi hóa học như: axít hóa, phosphoryl hóa, oxy hóa Các protease thiol thường hoạt động mạnh ở pH trung tính và có tính đặc hiệu rộng

Protease axít: là những protease chứa nhóm (-COOH) trong trung tâm hoạt động

của mạch polypeptide Các protease axít thường hoạt động ở vùng pH axít Chúng có tính đặc hiệu đối với axít amin có vòng thơm hoặc kỵ nước ở hai phía của liên kết peptide

bị phân hủy

Metallo protease: là những protease trong trung tâm hoạt động của chúng có các ion kim loại Các protease kim loại thường hoạt động mạnh nhất ở vùng pH trung tính, chúng có thể tác động lên các peptide chứa nhóm (-NH-) của các axít amin kỵ nước hoặc các liên kết peptide tạo thành từ các các axít amin có phân tử thấp

1.3.3 Hoạt tính protease ở đậu nành

Hoạt tính protease thô, ngoại tiết trong nghiên cứu của Rajes (2005) là 2,43 U/ml

ở dòng Bacillus mojavensis Saores và ctv (2005) đã tiến hành lên men bán rắn với cơ chất là bánh đậu nành với vi khuẩn Bacillus subtilis 22, kết quả cho thấy hoạt tính tối đa

của protease ngoại tiết lên đến 960 IU/g canh trường Trong khi đó, Khan và ctv (2011)

xác định hoạt tính protease ở chủng Bacillus CEMB 10370 là 0,7 IU/ml Trên loài

Bacillus subtilis, Yang và ctv (2013) đã tiến hành lên men bán rắn khô dầu đậu nành

bằng chủng Bacillus subtilis GA15 và hoạt tính protease thô trong nghiên cứu của tác

giả này lên đến 1.249 IU/g canh trường khi tiến hành với cơ chất chứa 45% ẩm, chiều dày cơ chất là 1,5 cm và lên men trong 60 giờ Cũng trong trời gian này, Imtoaz và ctv

cũng đã tiến hành lên men bán rắn với cơ chất chủ yếu là đậu nành với Bacillus subtilis

IH72, tuy nhiên kết quả về hoạt tính tối đa của protease chỉ đạt 126,8 IU/g canh trường

Ở Việt Nam, hoạt tính protease ngoại tiết của các chủng vi khuẩn phân lập từ tự nhiên thường dao động từ 0,6- 2 IU/ml (Võ Hồng Thi và ctv, 2012; Quyền Đình Thi và ctv, 2013) Trong nghiên cứu của Phượng và ctv (2012), hoạt tính của protease ngoại tiết lên đến hơn 560 IU/g canh trường khi tiến hành lên men bán rắn trên cơ chất đậu nành với

chủng vi khuẩn Bacillus spp NP3 Nghiên cứu của Hùng và ctv (2013) khi nuôi cấy 15 chủng Bacillus subtilis trên môi trường bán rắn cám bắp- bã đậu nành thì hoạt tính

protease chỉ đạt từ 5 đến 19,64 IU/g canh trường Khi nuôi trên quy mô 70kg/mẻ trên

môi trường bột bắp:bã đậu nành ép dầu với tỷ lệ 8:2, pH dịch khoáng 6,8 và thời gian nuôi cấy là 72 giờ Hoạt tính protease đạt khoảng 15 IU/g canh trường Trong một nghiên

cứu khác, Bacillus pumilus DBF1227 được phân lập từ mẫu đất thu tại lò giết mổ gia súc

và bãi rác bời Hà và ctv (2014) lại cho hoạt tính enzyme ngoại tiết khá thấp 3,15 IU/ml

1.4 Giới thiệu về lên men bán rắn

1.4.1 Những vấn đề cơ bản của lên men bán rắn

Lên men trên môi trường bán rắn hay lên men trên cơ chất rắn là một quá trình trong đó sự sinh trưởng của vi sinh vật (VSV) và sự hình thành sản phẩm diễn ra trên bề mặt của nguyên liệu gần như không có mặt của nước tự do, cơ chất chứa ẩm dưới dạng hấp phụ trong mạng chất rắn Hoạt động sống của VSV diễn ra chủ yếu trên bề mặt rắn

Sự trao đổi nhiệt và khí hầu như là trực tiếp giữa pha rắn hay pha khí không qua chất lỏng trung gian Các phản ứng sinh học và sự chuyển hóa thực hiện trực tiếp giữa tế bào VSV và cơ chất tại nơi tiếp xúc

1.4.2 Những ưu điểm của lên men bán rắn

Lên men bán rắn có những ưu điểm vượt trội so với lên men trong môi trường lỏng Đó là việc không cần khuấy đảo hay thông khí, đặc biệt là thành phần môi trường nuôi cấy đơn giản, rẻ tiền Chẳng hạn, các cơ chất dùng trong lên men bán rắn thường là các phế liệu của ngành nông nghiệp hay công nghiệp thực phẩm, tất cả đều là cơ chất rẻ tiền và ổn định nên có tiềm năng sử dụng để sản xuất enzyme ở quy mô lớn

Những ưu điểm khác so với lên men trong môi trường lỏng là nồng độ cơ chất cao hơn, ít bị nhiễm tạp, giảm năng lượng và lượng nước sản xuất đầu vào, lên men bán rắn không cần sử dụng nhiều thiết bị phức tạp, chủ yếu nuôi trên khay và buồng nuôi, chỉ cần giữ ở nhiệt độ và độ ẩm thích hợp Do đó, việc vận hành cũng như việc đầu tư vừa đơn giản vừa ít tốn kém Sau quá trình nuôi cấy, canh trường nuôi cấy bề mặt dễ dàng sấy khô, chế phẩm khô dễ bảo quản, nghiền nhỏ hoặc sử dụng trực tiếp nếu không

cần khâu tách và làm sạch enzyme Lượng enzyme được tạo ra từ lên men bán rắn thường cao hơn rất nhiều so với nuôi cấy lỏng

1.4.3 Sự tạp nhiễm trong lên men bán rắn

Có rất nhiều nguyên nhân gây ra sự tạp nhiễm trong suốt quá trình lên men bán rắn Sự tạp nhiễm trong lên men bán rắn có thể đến từ môi trường nuôi cấy bị nhiễm (do không được khử trùng kỹ, quy trình vô trùng không chuẩn, phòng vô trùng không đạt mức vệ sinh cần thiết); dụng cụ lên men không được vô trùng tốt; vô trùng không khí không hiệu quả

Kiểm soát sự tạp nhiễm

Trong lên men bán rắn, sự tạp nhiễm là điều không thể tránh khỏi, việc lên men đạt được hiệu quả nếu sự tạp nhiểm có thể được kiểm soát Các kiểm tra lý hóa truyền thống nguyên liệu cho lên men bán rắn được thực hiện bao gồm các chỉ tiêu ẩm độ, hoạt

độ nước, hoạt độ axít, tro toàn phần, thành phầm dinh dưỡng và các chỉ tiêu quy định khác Ngoài ra các chỉ tiêu khác trong quá trình lên men cũng cần được xác định như mật độ và số lượng vi sinh trong mẻ lên men, hàm lượng độc tố sản sinh ra trong quá trình trao đổi chất của vi sinh vật (mycotoxin) Bởi vì sự không đồng nhất trong qui trình lên men bán rắn, ngay cả khi đối với cùng một chủng vi sinh và cùng một quy trình lên men thì chất lượng các mẻ sản phẩm cũng sẽ khác nhau vì vậy quy trình sản xuất rất khác nhau; hoặc ngay khi trong cũng một mẻ lên men sản phẩm cũng sẽ khác nhau Do

đó, quy trình mẫu hay việc chuẩn hóa các nguyên liệu ban đầu phải dựa trên cơ sở đặc điểm thành phần nguyên liệu của lên men bán rắn

Việc kiểm soát tạp nhiễm trong lên men bao gồm: (1) kiểm soát hoạt độ nước trong chất nền; (2) tăng mật độ vi sinh cấy vào; (3) điều chỉnh giá trị pH (bằng các thêm vào acid acetic hoặc acid lactic vào môi trường có thể làm tăng khả năng kháng khuẩn của môi trường); (4) Việc làm lạnh cũng có thể được thực hiện (nếu vào mùa hè, nhiệt

độ cao, môi trường thường dễ bị nhiễm vi thế nhiệt độ ủ có thể điều chỉnh thấp hơn, đây cũng là một phương pháp cho thấy hiệu quả trong việc giảm sự nhiễm khuẩn cho lên men); (5) Bổ sung muối có thể làm tăng hiệu quả đối kháng khi muối được bổ sung ở nồng độ cao, nhưng ở nồng độ muối cao có thể gây ra ức chế hoạt động của enzyme

Xử lý sau lên men

Yêu cầu cuối cùng của lên men bán rắn là sản phẩm thường cần được sấy khô Sấy là một phương pháp lâu đời nhất để bảo quản sản phẩm và cho đến nay nó vẫn là một phương thức quan trọng trong một vài ngành công nghiệp hiện đại Dựa trên các sản phẩm khác nhau, phương pháp sấy được tóm tắt như sau: (1) sấy khô tự nhiên, (2) sấy bằng khí nóng, (3) sấy phun, (4) sấy chân không và (5) sấy đông lạnh Trong đó có ba nhân tố chính tác động đến tỉ lệ sấy: độ ẩm trong nguyên liệu, điều kiện sấy và thiết bị sấy

1.4.4 Các giai đoạn của lên men bán rắn

Quá trình lên men có thể chia thành 2 pha:

•Pha thứ 1 – pha sinh trưởng

Các tế bào vsv còn non, sinh trưởng nhanh và tăng sinh khối – là quá trình sinh tổng hợp protein và xây dựng tế bào Môi trường nuôi cấy trong pha này giàu nguồn Carbon, nitơ, phosphor Sản phẩm trao đổi chất của vi sinh vật ở thời kì này không có hoặc bắt đầu tích tụ với một lượng rất nhỏ và dần dần tăng lên đồng thời với sự phát triển của giống đến khi ổn định thì chuyển sang pha thứ 2

•Pha thứ 2 – pha tích tụ sản phẩm trao đổi chất:

Ở giai đoạn này, các tế bào vsv đã trưởng thành, sự phát triển sinh khối chậm lại hoặc ngừng hẳn, các sản phẩm trao đổi chất tích tụ chủ yếu trong pha này Trong môi trường nuôi cấy, các nguồn carbon, nitơ, phosphor còn rất ít hoặc cạn gần hết Thời kì

đầu của pha này, tế bào vsv có khả năng tổng hợp cao, tích tụ nhiều sản phẩm trong môi trường Ở cuối pha, lượng sinh khối bắt đầu giảm đi do tế bào bắt đầu tự phân và quá trình tích tụ bị chậm lại, đồng thời một số sản phẩm sẽ trở thành nguồn dinh dưỡng cho vsv Trong thực tế sản xuất, quá trình lên men thường được kết thúc trước điểm cuối pha thứ 2 để tránh tình trạng tự phân sẽ làm tăng độ nhớt gây khó khăn cho việc tách lọc (Võ Thị Xuyến (2006))

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.1 Vật liệu

2.1.1 Nguyên vật liệu

Chế phẩm natto của Nhật Bản bán tại Việt Nam

Chủng Bacillus ở phân viện chăn nuôi Nam Bộ: BI1, BI2, BI3, BI4, MN1, MN2,

Li, Yoi, Su, Ba

Nguyên liệu làm cơ chất: Khô dầu đậu nành

pH, tủ giữ giống (ESCO, Singapore), Máy điện di Cleaver-Anh Quốc

2.2 Môi trường nghiên cứu

2.2.1 Môi trường phân lập và giữ giống Bacillus

❖ Môi trường LB

Thành phần Nồng độ (g/l)

NaCl 10

2.2.2 Môi trường khảo sát hoạt tính protease của các chủng vi khuẩn

❖ Môi trường sản xuất Bacillus

❖ Đệm phosphate pH 7.0 (tách enzyme protease)

- Dung dịch (a) 36,14 g/l NaH2PO4.2H2O hòa vào nước và định mức tới 1000ml

- Dung dịch (b) 71,7 g/l Na2HPO4.12H2O hòa tan và định mức tới 1000 ml

- Dùng 39 ml dung dịch (a) cùng với 61 ml dung dịch (b) dẫn nước đến 200ml

❖ Dung dịch casein 1%: hòa tan 1g casein vào dung dịch sorensen pH 7,6 định mức tới 100ml

❖ Dung dịch Trichloacetic acid (TCA) 5%: hòa tan 5g TCA trong nước cất, định mức tới 100ml, lắc đều

❖ Dung dịch tyrosine 1mM (1 µmol/ml): cân 181,19 mg tyrosine tinh khiết hòa tan trong dung dịch HCl 0,2N và chuyển sang bình định mức 100ml, định mức tới vạch ta được dung dịch gốc 10 mM Khi sử dụng pha loãng dung dịch gốc 10 lần bằng HCl 0,2N được dung dịch tyrosine 1mM

❖ Thuốc thử Folin-Ciocalteu (gọi tắt là FC) (pha loãng 5 lần bằng nước cất: 1V FC gốc + 4V H2O)

2.2.3 Hóa chất SDS-PAGE

Tris Base, Acrylamide, N,N’ methylene-bis-acrylamide, ammonium persulfate, SDS, β-mercaptoethanol, Bromophenol blue, ethanol, methanol, acid acetic, TEMED,

commassie brillian blue

2.3 Các phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp phân lập, giữ giống vi khuẩn Bacillus

Phương pháp phân lập

• Nguyên tắc

- Tách rời các tế bào vi khuẩn

- Nuôi cấy các tế bào môi trường dinh dưỡng đặc trưng để cho khuẩn lạc riêng lẻ, tách biệt nhau

• Cách tiến hành

- Lấy 1g natto của Nhật Bản cho vào môi trường LB lắc đều sau 24h

đến 10-5, 10-6

- Từ dịch pha loãng cấy trang vào đĩa petri có sẵn MT LB

vào ống thạch nghiêng

• Phương pháp làm thuần

- Lấy 1 khuẩn lạc riêng lẻ trên ống thạch nghiêng hòa vào nước cất vô trùng, trải trên đĩa lần 2 Nếu các dạng khuẩn lạc đồng đều màu sắc giống nhau, soi kính hiển vi chỉ có 1 dạng tế bào, chứng tỏ giống phân lập đã thuần khiết

- Sau đó chọn các khuẩn lạc riêng lẻ cấy chuyền sang ống thạch nghiêng để bảo quản

và nghiên cứu các đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa

Phương pháp giữ giống

Cho vào eppendorp 1,5ml nước muối sinh lý

Hút bỏ dịch trong, giữ lại cặn

Cho vào eppendorp 0,45ml glycerol + 1,05ml môi trường hoạt hóa giống

Vortex

Hút 1 ml môi trường lỏng nuôi vi sinh vào eppendorp 2ml

Ly tâm 7000 vòng/phút trong 5 phút

Hút bỏ dịch trong, giữ lại cặn

Cho vào eppendorp 1,5ml nước muối sinh lý

Vortex

Ly tâm 7000 vòng/phút trong 5 phút

Hút bỏ dịch trong, giữ lại cặn

Hình 2.1 Quy trình giữ giống

• Tiến hành

Lấy một vòng que cấy KL trên ống thạch nghiêng, gạt 3 – 4 lần trên mặt thạch (LB) ở một góc Quay đĩa thạch sang hướng khác và ria cấy từ một vạch thành 3 – 4 đường khác sao cho không trùng với các đường trước Lặp lại theo một hướng thứ ba để pha loãng hơn nữa phần vi khuẩn dính trên que cấy Chú ý không nhấc tay lên và không thay đổi hướng của vòng que cấy

Tiến hành quan sát các KL này từ các phía (từ trên xuống, từ bên cạnh), chú ý về hình dạng KL, hình dạng mép, bề mặt, độ dày, có núm hay không, độ trong, màu sắc (trên dưới, có khuếch tán ra môi trường không) (Trần Thị Bích Quyên, 2012)

Phương pháp nhuộm Gram

• Tiến hành

Làm vết bôi với vi khuẩn nuôi cấy từ 16-24h trên ống thạch nghiêng

Để khô vết bôi trong không khí hoặc cố định nhẹ trên đèn cồn

Đặt miếng giấy lọc trên vết bôi

Nhuộm tiêu bản bằng tím gentian qua giấy lọc trong 1 phút

Nhuộm lugol trong 1 phút

Rửa bằng nước cất

Tầy bằng cồn trong 30 giây, để nghiêng tiêu bản, nhỏ từ từ giọt cồng đến khi tan hết màu

Rửa bằng nước cất

Nhuộm bổ sung Fuchsin từ 10 – 30 giây

Rửa nước, làm khô và quan sát trên KHV với vật kính x100(Trần Thị Bích Quyên, 2012)

• Đọc kết quả: VK Gram âm sẽ bắt màu hồng, VK Gram dương sẽ bắt màu tím

Chọn các chủng Gram dương để tiếp tục nghiên cứu

2.3.2.2 Phương pháp sinh hóa

❖ Thử nghiệm Voges-Proskauer

• Nguyên tắc

Phát hiện khả năng vi sinh vật tạo thành một số sản phẩm trung tính acetylmethylcarbimol (acetoin) trong quá trình lên men glucose

• Cơ sở sinh hóa

Thử nghiệm VP nhằm mục đích phát hiện acetoin, một sản phẩm trung tính trong quá trình trao đổi glucose trong tế bào vi sinh vật Ở tế bào vi sinh vật, sự phân hủy glucose tạo ra sản phẩm trung gian là acid pyruvic, từ đó có thể chia vi sinh vật thành 2 nhóm theo 2 con đường chuyển hóa pyruvic khác nhau như sau: nhóm trao đổi không

tạo thành butanediol như E.Coli và nhóm VP(-), và nhóm trao đổi tạo thành

2,3-butanediol, như Klebsiella là nhóm VP (+) Tuy nhiên, phản ứng VP nhằm mục đích phát hiện acetoin là một tiền chất của 2,3-butanediol Vì acetoin là tiền chất của 2,3-butanediol nên trong quá trình nuôi cấy tích lũy rất ít Để dễ dàng cho quá trình phát hiện, vi sinh vật phải được nuôi trong điều kiện hiếu khí Quá trình chuyển hóa acetoin

và 2,3-butanediol là quá trình thuận nghịch

Để phát hiện acetoin trong môi trường nuôi cấy vi sinh vật, α-naphtol được sử dụng như một thuốc thử phát hiện trong môi trường kiềm mạnh được tạo ra KOH 40% được cho vào môi trường thử nghiệm

• Cách tiến hành

Cấy vi sinh vật vào trong môi trường glucose phosphate (MR-VP broth), ủ ở nhiệt

cồn và dung dịch KOH 40% với tỷ lệ 3:1 Quan sát phản ứng xảy ra trong 5 phút

• Đọc kết quả:

Thử nghiệm (+): xuất hiện màu đỏ trên bề mặt môi trường

Thử nghiệm (-): môi trường không đổi màu

❖ Thử nghiệm citrate

• Nguyên tắc

Nhằm xác định khả năng vi sinh vật sử dụng nitrate như là nguồn Carbon duy nhất

• Cơ sở sinh hóa

Sự biến dưỡng citrate thường thông qua sự kết hợp với actylCoA thành oxaloacetate để vào chu trình Krebs Sản phẩm biến dưỡng Citrate thay đổi tùy pH của

môi trường Khi pH tăng môi trường dần chuyển sang kiềm, lượng formate và acetate

còn ở pH acid, sản phẩm tạo ra chủ yếu là acetoin và lactate Như vậy, sự biến dưỡng

Mặt khác, các vi sinh vật có khả năng sử dụng citrate như là carbon duy nhất có

hóa môi trường

Như vậy, trong môi trường thử nghiệm khả năng sử dụng citrate như là nguồn carbonduy nhất chứa đạm ở dạng muối ammonium sẽ làm tăng pH của môi trường thể hiện qua sự đổi màu của chỉ thị pH trong môi trường

Thử nghiệm (+): môi trường chuyển sang màu xanh dương

Thử nghiệm (-): môi trường không đổi màu

❖ Thử nghiệm thủy phân gelatin

Gelatin là một protein có kích thước phân tử lớn Vì vi sinh vật muốn sử dụng protein này như một nguồn cung cấp năng lượng thì chúng phải có khả năng tổng hợp được các enzyme ngoại bào phân giải gelatin thành các phân tử nhỏ hơn hay monomer Các enzyme này thuộc nhóm gelatinase được tiết ra bên ngoài tế bào

• Cách tiến hành

Tương tự như thử nghiệm protease mục 2.3.3.1

❖ Thử nghiệm catalase

• Nguyên tắc

Thử nghiệm này nhằm xác định sự có mặt của enzyme catalase trong vi sinh vật

• Cơ sở sinh hóa

Enzyme catalase hiện diện trong hầu hết các vi sinh vật kị khí và hiếu khí có hệ thống cytochrome và những vi sinh vật không có hệ thốm cytochrome thì cũng không

để giải độc cho tế bào Trong phản ứng này, một phân tử hydroperoxide đóng vai trò là

phân tử

• Cách tiến hành

Hóa chất sử dụng là hydroperoxide 30% được giữ lạnh trong chai màu, tránh ánh sáng; dung dịch đệm phosphate pH 7.4

Có thể thực hiện phản ứng catalase theo cách khác:

Thử trên lame: dùng que cấy vòng lấy một ít sinh khối đặt lên lame Nhỏ một giọt

Thử trong ống nghiệm thạch nghiêng: nhỏ trực tiếp 1ml H2O2 30% lên sinh khối

vi sinh vật Ghi nhận lại sự sủi bọt

• Đọc kết quả:

Thử nghiệm (+): có hiện tượng sủi bọt khí

Thử nghiệm (-): không có hiện tượng sủi bọt

❖ Khả năng phát triển của vi khuẩn ở nồng độ muối 6,5% NaCl

• Cách tiến hành: Pha môi trường LB + 6,5% NaCl Cho 3ml môi trường vào mỗi

• Đọc kết quả:

Thử nghiệm (+): có hiện tượng đục môi trường

Thử nghiệm (-): môi trường không đổi

(Lê Thị Huyền, 2016; Phạm Minh Nhựt, 2016)

2.3.3 Phương pháp khảo sát hoạt tính protease

Định tính protease bằng phương pháp vòng phân giải

• Nguyên tắc

Enzyme tác động với cơ chất trong môi trường thạch, cơ chất bị phân hủy tạo thành vòng trong suốt xung quanh lỗ thạch Độ lớn MT trong suốt phản ánh hoạt tính của enzyme (Trần Ngọc Hùng, 2010)

• Cách tiến hành

Chuẩn bị các chủng vi khuẩn cần nghiên cứu và nuôi trên môi trường LB bổ sung 1% gelatine

Chuẩn bị môi trường Gelatine-agar

Dùng khoan nút chai (đường kính d = 0.8 cm) khoan thỏi thạch ở môi trường GA

20µl dịch nuôi cấy cho vào lỗ thạch

Kiểm tra hoạt tính protease: thuốc thử lugol (Merck) Nếu vi khuẩn có sinh protease sẽ tạo vòng phân giải quanh lỗ khoan, phần còn lại có màu trắng đục do phản ứng của lugol và gelatin

Đánh giá khả năng sinh protease bằng cách đo đường kính vòng phân giải D-d (mm)

Trong đó D: đường kính vòng phân giải (mm), d: đường kính lỗ thạch (mm)

• Đọc kết quả: Dùng thước đo đường kính vòng phân giải của vi khuẩn

Tiếp theo, 4 chủng có vòng phân giải lớn nhất được chọn ra và xác định hoạt lực protease với cơ chất là khô dầu đậu nành

Xác định hoạt lực protease bằng phương pháp Anson cải tiến

Khô dầu đậu nành được trộn nước cất theo tỉ lệ 1:1 (khối lượng/thể tích) (nước cất được sử dụng thay thế nước máy vì nước máy có thể chứa kim loại hoặc chất gây ô nhiễm có thể cản trở sự phát triển vi sinh vật)Sau đó, hộp khô dầu đậu nành với độ dày

phút Sau khi tiệt trùng, môi trường được làm mát ở nhiệt độ phòng và được cấy 5%

bằng phương pháp Anson sau 24 giờ, 40 giờ, 48 giờ

Giống được chuẩn bị như sau: giống từ đĩa thạch được cấy tăng sinh trong môi trường LB lắc 150 vòng/phút trong 24 giờ sau đó được cấy vào môi trường sản xuất Bacillus và lắc 150 vòng/phút trong 24 giờ

Xác định hoạt lực protease theo phương pháp Anson cải tiến (Nguyễn Hoài Hương,

2016)

• Nguyên tắc:

Phương pháp này dựa trên sự thủy phân protein casein bằng enzyme protease có trong dịch nghiên cứu, tiếp đó làm vô hoạt enzyme và kết tủa protein chưa bị thủy phân bằng dung dịch acid tricloacetic (TCA) Định lượng sản phẩm được tạo thành trong phản ứng thủy phân bằng phản ứng màu với thuốc thử Folin-Ciocalteu Dựa vào đồ thị chuẩn

Tyrosine để tính lượng sản phẩm do enzyme xúc tác tạo nên

Định nghĩa đơn vị Anson: một đơn vị Anson là lượng enzyme tối thiểu trong điều

TCA, phản ứng với thuốc thử Folin-Ciocalteu cho ta độ hấp thu OD ở bước sóng 750

nm tương ứng với 1 µmol tyrosine trong đường chuẩn

• Cách thực hiện

- Chuẩn bị hóa chất

Dung dịch enzyme: cân 5 g mẫu khô dầu nành lên men sau đó bổ sung 25 ml đệm

phosphate pH 7.0 và lắc 200 rpm trong 1 giờ Dịch enzyme thô được ly tâm 10000 rpm trong 30 phút, và dịch nổi được lọc qua giất lọc Dịch nổi sạch được coi như là enzyme thô.( Sumaya Ali Hmood, Ghazi Munim Aziz, 2016)

• Tiến hành:

- Dựng đường chuẩn tyrosine

Bảng 2.1 Trình tự bổ sung hóa chất để xây dựng đường chuẩn Tyrosine

Lắc đều, để yên ở 37oC/30 phút Đo độ hấp thu dung dịch ở 750nm lấy mẫu

đối chứng (ĐC) làm mẫu trắng (blank)

Vẽ đồ thị đường chuẩn dùng phần mềm excel, xác định phương trình đường

- Phản ứng xác định hoạt tính protease

Tiến hành theo hướng dẫn trong bảng 2.2

Bảng 2.2 Các bước xác định hoạt tính enzyme protease Hóa chất Ống thí nghiệm Ống đối chứng

Hàm lượng tyrosine được giải phóng do enzyme protease thủy phân được tính

ra) Hoạt tính enzyme được xác định theo công thức:

HT 0 (U/g) = 𝑿∗𝟓.𝟓∗𝑭∗𝑽

𝒗∗𝟐𝟎∗𝒎

X: nồng độ tyrosine suy ra từ đường chuẩn (µmol/ml)

5,5: tổng thể tích hỗn hợp phản ứng thủy phân (ml)

v: thể tích dịch lọc đem phản ứng tạo màu (1 ml)

20 thới gian phản ứng thủy phân cơ chất (phút)

F: hệ số pha loãng enzyme bằng dung dịch đệm trước khi xác định hoạt tính V: thể tích dung dịch toàn bộ enzyme thu được từ chế phẩm (ml)

m: khối lượng chế phẩm enzyme thô (g)

2.3.3.1 Định danh bằng phương pháp sinh học phân tử

Sau đó, chủng có hoạt lực protease cao nhất được chọn định danh Mẫu được gởi phân tích ở công ty Nam Khoa, địa chỉ 793/58, Trần Xuân Soạn, phường Tân Hưng, Quận 7, TP.HCM

2.3.4 Khảo sát các điều kiện thích hợp cho lên men khô dầu đậu nành

Phương pháp xác định độ ẩm khô dầu đậu nành

2.3.4.1 Nguyên tắc

Dựa trên nguyên lý làm khô mẫy đến khối lượng không đổi Khối lượng mẫu mất

đi khi sấy mẫu đến khối lượng không đổi là lượng nước có trong mẫu