Nghiên cứu thu nhận, tinh sạch enzyme glucoamylase từ nấm mốc aspergillus kawasaki trên môi trường lên men bán rắn, ứng dụng enzyne cố định trên chất mang alginate và chitosan

 Ưu điểm: Nuôi cấy vi sinh vật bằng phương pháp này enzyme thu được có nồng độ và hoạt tính cao, chế phẩm dễ sấy khô, ít bị giảm hoạt tính, dễ vận chuyển và sử dụng, không cần thiết bị

SV: Nguyễn Quốc Đạt

Lớp: 06DSH

MSSV:106111019

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

1.1 Giới thiệu sơ lược về enzyme:

1.1.1 Khái quát chung về enzyme:

Hầu hết các phản ứng hóa học xảy ra trong hệ thống sống đều do các protein đặc biệt xúc tác, các protein này gọi là enzyme hay fecment ( ferment ) Enzyme là những protein có cấu tạo phức tạp và đóng vai trò xúc tác sinh học Dưới tác dụng của enzyme các phản ứng hóa sinh trong cơ thể xảy ra rất nhanh không cần các điều kiện nhiệt độ,

áp suất cao và nồng độ acid hay kiềm đặc

Enzyme có trong mọi tế bào sống, vì vậy cũng được gọi là chất xúc tác sinh học (nhằm phân biệt với chất xúc tác có nguồn gốc từ hóa học) Trong tế bào sinh vật, enzyme chiếm 80 % - 90 % thành phần protein tế bào

Tuy nhiên, không những xúc tác cho các phản ứng xảy ra trong hệ thống sống mà sau khi tách ra khỏi hệ thống sống chúng vẫn có thể xúc tác cho các phản ứng ở ngoài

tế bào (invitro)

Tóm lại, có thể nói enzyme là là những protein có khả năng xúc tác đặc hiệu cho các phản ứng hóa học, là chất xúc tác sinh học

1.1.2.Tính chất ưu việt của enzyme:

 Enzyme hoạt động xúc tác trong điều kiện “nhẹ nhàng”: nhiệt độ thường trong khoảng 20 – 45oC, áp suất thường, pH acid yếu, kiềm yếu hay trung tính

 Enzyme có tính đặc hiệu cao hơn hẳn các xúc tác khác chỉ tác dụng lên những

cơ chất nhất định và xúc tác theo một kiểu nhất định

 Vận tốc phản ứng do enzyme xúc tác có thể dễ dàng điều chỉnh thậm chí ngừng phản ứng bằng các yếu tố tác động như: nhiệt độ, pH, các chất kìm hãm, chất hoạt hóa…

 Enzyme thường có cường lực xúc tác rất cao nên chỉ cần một lượng nhỏ enzyme

có thể chuyển hóa thành một lượng lớn cơ chất, trong khoảng thời gian ngắn

1.1.3 Nguồn nguyên liệu thu nhận enzyme:

Hiện nay người ta khai thác và thu nhận enzyme từ ba nguồn cơ bản:

 Từ động vật: đã từ lâu, loài người đã biết sừ dụng renin của dạ dày bê (nghé) để sản xuất phô mai hoặc thu nhận pepsin từ dạ dày của động vật Tuy nhiên, các enzyme

từ nguồn động vật ít được khai thác vì bị hạn chế về số lượng nguyên liệu

 Từ thực vật: ta có thể khai thác và thu nhận enzyme amylase từ malt, papain từ nhựa cây đu đủ hoặc bromelin từ trái dứa hay thân dứa

Tuy nhiên, trong cơ thể động vật và thực vật, quá trình sinh tổng hợp enzyme gắn liền với sự trao đổi chất của tế bào Số lượng enzyme cần tổng hợp gắn liền với nhu cầu sống của tế bào, hơn nữa các bộ phận sống trong cơ thể có số lượng enzyme không đồng nhất Vì vậy, chỉ có một số bộ phận mới có thể sản xuất enzyme được Muốn thu nhận enzyme phải phá bỏ cơ quan chiết rút Như vậy việc dùng động vật, thực vật làm nguồn nguyên liệu sản xuất enzyme là rất hạn chế, không kinh tế và không thể đáp ứng nhu cầu ngày càng cao về enzyme

Nguồn vi sinh vật được khai thác và thu nhận nhiều nhất vì ưu điểm vượt trội sau:

 Vi sinh vật có chu kỳ sinh trưởng và phát triển ngắn

 Hệ enzyme của vi sinh vật vô cùng phong phú, trong đó có những enzyme mà động vật, thực vật không tổng hợp được

 Vi sinh vật có cường độ sinh sản cực kỳ mạnh, hoạt tính enzyme rất cao, do vậy chỉ cần sử dụng một lượng rất nhỏ enzyme có thể chuyển hóa một lượng cơ chất lớn

 So với động vật và thực vật, thì việc cải tạo giống vi sinh vật dễ dàng hơn, thời gian ngắn hơn

 Vi sinh vật không đòi hỏi nghiêm ngặt về môi trường dinh dưỡng

 Có thể điều khiển các điều kiện tối ưu trong quá trình nuôi cấy để có thể thu được hiệu suất cao trong sản xuất

Năm 1835, Anselme và Jean Persoz đã tinh chế được amylase có từ đại mạch, đồng thời đặt tên là diastase ( xuất phát từ chữ Hy Lạp có nghĩa là “ phân giải ” )

Sau này theo đề nghị của Duclo, enzyme phân giải tinh bột được đặt tên là amylase Amylase đầu tiên được sản xuất ở qui mô công nghiệp năm 1894, nó có nguồn gốc

từ nấm mốc và được sử dụng như một loại dược phẩm để chữa bệnh tiêu hóa

1.2.2 Giới thiệu chung về enzyme amylase

 Hệ enzyme amylase là một trong những hệ enzyme được sử dụng rộng rãi nhất công nghiệp, y học và lĩnh vực kinh tế quốc dân khác

 Amylase thủy phân tinh bột, glycogen, và dextrin thành glucose, maltose, và dextrin giới hạn

 Hệ enzyme này có trong nước bọt, dịch tiêu hóa của người, động vật và trong hạt nảy mầm, nấm mốc, nấm men và vi khuẩn

 Hiện nay, amylase được thu chủ yếu từ canh trường vi khuẩn, nấm mốc và một

số loài như nấm men

1.2.3 Đặc điểm và cơ chế tác dụng

 Amylase là hệ enzyme rất phổ biến trong thế giới sinh vật Các enzyme này thuộc nhóm thủy phân (hydrolase), xúc tác sự phân giải các liên kết 0 - glucoside nội phân tử trong polysaccharide với sự tham gia của nước:

R-R’ + H-OH  RH + R’OH

 Phương trình thủy phân tinh bột là:

( C6H12O6 ) n  n (C6H12O6)

 Hiện nay, người ta biết rõ có 6 loại enzyme amylase:

1 -amylase, thủy phân liên kết  - 1,4 - glucoside và các polysaccharid đồng loại

2 -amylase, thủy phân liên kết  - 1,4 - glucoside và các polysaccharid đồng loại

3 -amylase ( hay glucoamylase ) thủy phân liên kết  -1,4 glucoside và các polysaccharid đồng loại

4 Dextrin – 6 - glucanhydrolase thủy phân các liên kết  - 1,6 - glucoside trong polysaccharide và các dextrin cuối

5 Amylasepectin - 6- glucanhydrolase thủy phân các liên kết  - 1,6 - glucoside trong polysaccharide và các dextrin cuối

6 Oligodextrin - 6- glucan hydrolase (hay dextrinase) thủy phân các liên kết  - 1,6 - glucoside trong polysaccharide và các dextrin cuối

Trong đó,  - amylase và glucoamylase là hai loại enzyme được tạo ra nhiều chủ yếu ở nấm mốc và được sử dụng hiệu quả trong công nghệ sản xuất rượu, sử dụng làm thức ăn gia súc

Hình 1.1 :Sự thủy phân tinh bột bởi enzym amylase

glucoamylase, glucozil transferase

 Từ vi khuẩn: Bac distaticus; Bac subtilis; Bac mesentercus; Bac amylosolvens… thường để thu  - amylase chịu nhiệt cao, dùng trong công nghiệp dệt

để tách hồ tinh bột trên vải

1.2.5 Ứng dụng enzyme amylase

Chế phẩm amylase (dạng thô hay tinh khiết ) được ứng dụng khá rộng rãi trong công nghiệp - đặc biệt là trong công nghiệp thực phẩm Sau đây là một số ứng dụng của nó:

 Trong công nghệ sản xuất rượu – bia

 Trong sản xuất mật, tinh bột, maltose, glucose

 Trong công nghiệp nhẹ ( rũ hồ ), ngành dệt, công nghiệp giấy

 Trong sản xuất bánh mỳ

 Trong y học, chăn nuôi

 Trong công nghiệp thực phẩm khác như: bánh kẹo, nước giải khát, đồ hộp và nước ép trái cây, sản xuất tương, chao…

1.2.6 Phân loại enzyme amylase

1.2.6.1 Enzyme -amylase (  - 1,4 glucan – 4 – glucanhydrolase, EC 3.2.1.1)

 Đặc điểm:

Tính chất -amylase dễ tan trong nước, trong các dung dịch muối và rượu loãng Protein của  - amylase có tính chất acid yếu và tính chất cua globulin Điểm đẳng điện nằm trong vùng pH 4.2 – 5.7 ( Bernfeld.P.1951)

 - amylase là một metaloenzyme ( enzyme kim loại ) Các  - amylase đều chứa từ

1 đến 30 nguyên tử gam Ca / mol, song không ít hơn 1 đến 6 Khi tách hoàn toàn Ca khỏi phân tử enzyme thì  - amylase mất hết khả năng thủy phân cơ chất

Đối với tác dụng của acid thì  - amylase của nấm mốc bền vững đối hơn là  - amylase của malt và vi khuẩn

Đối với nhiệt thì  - amylase bền nhiệt hơn các amylase khác

Tất cả  - amylase đều bị kìm hãm bởi kim loại nặng ( Cu2+, Ag+, Hg2+…)  - amylase có nguồn gốc khác nhau thì có thành phần acid amin khác nhau

 Cơ chế tác dụng:

 - amylase của nấm mốc cắt đút được tất cả liên kết  -1,4 glucoside nằm phía trong mạch polysaccharid một cách ngẫu nhiên, không theo một trật tự nào Vì thế, người ta gọi nó là enzyme nội phân (endoamylase), trừ điểm phân nhánh trong amylopectin để tạo thành maltose và dextrin giới hạn Như vậy, chúng có khả năng chuyển 80-82% tinh bột thành maltose

 - amylase không chỉ thủy phân hồ tinh bột nguyên thủy mà còn thủy phân hạt tinh bột nguyên lành, song với tốc độ chậm

Phản ứng thủy phân tinh bột bằng  - amylase thường xảy ra hai giai đọan:

- Giai đoạn đầu (giai đoạn dextin hóa): chỉ một số liên kết trong phân tử bị thủy

phân, tạo thành một lượng lớn dextrin phân tử thấp ( - dextrin ) và độ nhớt của hồ tinh bột giảm nhanh

- Giai đoạn thứ hai (giai đoạn đường hóa ): các dextrin phân tử thấp vừa được

tạo thành bị thủy phân tiếp tục tạo ra các mantotriose, mantose, glucose và còn lại một phần dextrin phân tử thấp không cho màu với Iốt

- Tính chất đặc trưng của  - amylase là khả năng dextrin hóa cao, do đó làm cho phản ứng màu của tinh bột với Iốt bị biến đổi nhanh chóng Vì vậy, người ta gọi  - amylase là  - amylase dextrin hóa hay amylase dịch hóa

 Điều kiện hoạt động:

- Ở 70oC,  - amylase của nấm mốc bị mất 50% hoạt lực Trong dung dịch đệm

pH 4.7, -amylase của Asp oryzae rất nhạy cảm với nhiệt độ cao, thậm chí ở 40oC trong 3h, hoạt động dextrin hóa của nó chỉ còn 22 - 29 % và hoạt lực đường hóa còn 27

- 85 % Ở 500C trong 2h, amylase của Asp oryzae bị vô hoạt hoàn toàn

- PH tối thích cho hoạt động của  - amylase nấm mốc là 4,5 – 4,8 ( có thể tốt trong vùng pH 4,5 – 5,8 )

- Nhiệt độ tối thích cho  - amylase nấm mốc là 50 0C

1.2.6.2 Enzyme  - amylase ( - 1,4 glucan – 4 – maltohydrolase )(EC 3.2.1.2)

 - amylase có pH tối ưu cao hơn của  - amylase và nó không cần Ca2+ để ổn định

và tăng hoạt tính Việc chứng minh sự tồn tại của  - amylase ở nấm mốc vẫn chưa được khẳng định

 Cơ chế tác dụng:

 - amylase là một exo -  - amylase, nó xúc tác thủy phân từ đầu không khử của mạch amylose và amylopectin và glucogen, chúng cắt lần lượt các liên kết glucoside tạo ra maltose ( dạng  - anomeric ) Do enzym này không thủy phân được liên kết  - 1,6 - glucoside ở amylose nên kết quả thủy phân cuối cùng thường gồm 50 – 60 % maltose dạng  - anomeric và  - detrin giới hạn, cho màu tím đỏ với iốt

1.2.6.3 Enzyme glucoamylase (1,4 -  - D – glucan glucohydrolase (EC.3.2.1.3)

 Tên gọi:

Glucoamylase có các tên gọi khác nhau:  - amylase, amyloglucosidase, taka - amylase Bac, maltulase,  - 1,4:1,6 - glucan - 4:6 – glucohydrolase,…

 Tính đặc hiệu:

- Glucoamylase xúc tác thủy phân các liên kết  - 1,4 - glucoside lẫn  - 1,6 - glucoside, đồng thời cả liên kết và  -1,3 - glucoside đã đưa glucoamylase lên vị trí hàng đầu về sự thủy phân tinh bột

- Glucoamylase là enzyme ngoại phân

( exoenzyme ) có khả năng thủy phân khá

mạnh Nó thủy phân hoàn toàn tinh bột,

glycogen, amylodextrin cuối, panose,

isomaltose, bắt đầu từ đầu không khử của

amylose, và tách dần từng đơn vị phân tử

đường glucose Sản phẩm cuối của

glucoamylase có thể là glucose, maltose và

một lượng nhỏ dextrin

- Điểm đẳng điện của glucoamylase từ

các nguồn khác nhau cũng không đồng nhất, nhưng theo số liệu thống kê thì nằm trong khoảng 6.5 – 7.5

OH H

H O2O H

OH H O

+ H + 2

H O OH_

O O

CH OH2O

OH H H

OH

O

OH H

H H

 Cơ chế tác dụng:

Khi nghiên cứu các cơ chế của sự thủy phân tinh bột một số oligosaccharide và polysacchaide bằng glucoamylase của nấm mốc, Backer và cộng tác viên cho thấy rằng sự thủy phân tinh bột được thực hiện theo cơ chế “ đa mạch ” mà không theo

cơ chế “ đơn mạch ” ( Barker et al 1957 ) như là Kerr và đồng sự giả định:

Sơ đồ thủy phân glucid bởi glucoamylase có thể biểu diễn như sau:

Sơ đồ 1.1: Khả năng thủy phân glucid của enzyme glucoamylase

Điều kiện hoạt động:

- pH hoạt động tối thích của glucoamylase từ các nguồn khác nhau cũng không giống nhau Đa số các glucoamylase đã biết đều thuộc loại glucoamylase “ acid ”, thể hiện hoạt lực ở vùng pH 3.5 – 5.5 Nếu phân loại glucoamylase theo pH tối ưu thì chỉ gồm 2 loại là: glucoamylase “acid” và glucoamylase “ trung tính ”

Glucoamylase “ acid” có pH tối ưu là 4.0 –5.0

Glucoamylase “ trung tính ” có pH tối ưu là 6.0 –7,5

Tuy nhiên, pH hoạt động tối thích của glucoamylase còn thay đổi theo nhiệt độ và thời gian tác dụng

- Nhiệt độ hoạt động tối thích của glucoamylase loại bền acid là 500C

- Có lẽ glucoamylase là enzyme duy nhất có khả năng chuyển hóa hoàn toàn tinh bột thành glucose Tuy nhiên, khi nồng độ  - glucose trong môi trường tăng lên do sự

thủy phân các mạch  - glucan thì amyloseglucoside có thể xúc tác ngưng tụ nhiều đối với glucose ( tác động transglucodase ) để tạo ra maltose và isomaltose

- So với  - amylase, glucoamylase bền đối với acid hơn, nhưng lại kém bền hơn dưới tác dụng của rượu etylic, aceton

- Fukumoto đề nghị chia glucoamylase của vi sinh vật làm hai loại theo khả năng thủy phân tinh bột của chúng

 Vi sinh vật sản xuất glucoamylase:

Bảng 1.1 Glucoamylase từ các loài nấm mốc khác nhau:

Kiểu

% tinh bột thủy phân

Rhizopus

delemar

Rh delemar

Rh delemar Asp awamori Asp niger

-

Glucoamylase Glucoamylase Amylase “deebraanding”

Amyloglucosidase Glucoamylase

-amylase “glucogenase”

Amyloglucosidase Amyloglucosidase Taka - amylase Amylase - sacarogenase Amyloglucosidase Amyloglucosidase

Các chế phẩm glucoamylase từ các nguồn khác nhau tuy có những tính chung, song

cũng khác nhau ở nhiều điểm Ngay cả các chế phẩm tách ra từ các Aspergillus cũng

khác nhau về một loạt các tính chất lý hóa học như phân tử lượng, thành phần acid amin, tính đặc hiệu cơ chất và điều kiện họat động … Glucoamylase vi sinh vật thuộc các loài khác nhau thì khác nhau mức độ thủy phân tinh bột

1.3 Cơ chất của enzyme amylase:

Cơ chất của enzyme amylase là tinh bột và glycogen

1.3.1 Tinh bột :

1.3.1.1 Đặc điểm

Tinh bột là polysaccharid tiêu biểu, được dự trữ và có nhiều trong thực vật (ngũ cốc) 60 – 80 %, có chủ yếu ở các loại củ như khoai lang, khoai tây, khoai mỳ… là chất dinh dưỡng chủ yếu của con người

Mặc dù tinh bột lấy từ các nguồn khác nhau không hoàn toàn giống nhau, song ngay từ năm 1940, Meyer đã cho biết rằng tinh bột mọi nguồn đều cấu tao từ amymo

Tỉ phần của amylose và amylopectin trong các loại tinh bột khác nhau thì không giống nhau Tuy nhiên, đa phần các loại tinh bột đều gồm 20 – 30% amylose và 70 –

80 % amylopectin

 Amylose:

 Cấu tạo mạch thẳng, chiều dài cực đại 7.000  gồm những đơn vị  - glucose ( 300 – 1000 gốc ) liên kết với nhau qua liên kết 1,4 – O – glucoside tạo xoắn theo kiểu lò xo được ổn định nhờ liên kết hydrogen nối giữa các nhóm -

OH tự do, mỗi vòng xoắn gồm 3 gốc glucose và có chiều dài 10,6 

 Nhưng trong dung dịch, mạch xoắn co lại, vòng xoắn lớn lên và gồm 6 gốc glucose

 Amylose tạo màu xanh khi kết hợp với iốt ( I2 )

 Dễ tan trong nước ấm tạo độ nhớt không cao M = 3 x 105 – 1 x 106

 Nó hầu như không có khả năng khử vì trong mỗi phân tử amylose chỉ có một nhóm andehit tự do

Hình 1.4 Cấu tử Amylose và Amylopectin

Khác amylase, amylasepectin không tan trong nước sôi, nhưng trương lên và tạo thành hồ, cho màu tím với iốt

 Amylosepectin:

Amylopectin có cấu trúc phân nhánh Ở điểm phân nhánh, có mặt liên kết  - 1,6 - glucoside Có nghĩa là nó có cả liên kết  - 1,4 glucoside và  - 1,6 – glucoside, tạo thành một mạch có nhiều nhánh

Cấu trúc của nó gồm 1 mạch thẳng trung tâm, chứa liên kết  - 1,4 - glucoside, từ mạch này phát ra các nhánh phụ dài chừng vài chục gốc glucose, (21 – 27 gốc hoặc những trường hợp chỉ có 15 – 18 gốc )

1.3.2 Glycogen:

Glycogen là polysaccharid, dạng dự trữ chính có ở động vật và người

Đăc điểm :

Phân tử có cấu tạo mạch nhánh giống như amylopectin

Các đoạn mạch phía trong và ngoại vi của glycogen ngắn hơn amylopectin Chiều dài trung bình của các đọan mạch nhánh chỉ có 12 – 14 gốc glucose

Khác với tinh bột, nó dễ tan trong nước nóng, trong nước nóng cho màu từ đỏ đến tím, tím nâu với iốt

Ở động vật và người, glycogen chủ yếu tập trung ở gan và hàm lượng của nó phụ thuộc vào chế độ dinh dưỡng

1.4 Tổng quan về nấm mốc Aspergillus Kawasaki:

Loài: Aspergillus kawasaki

Nấm kawasaki là loại nấm mốc phát triển rất nhanh, khả năng tồn tại trong môi

trường cao.nhưng hiện tại rất ít được biết đến ở Việt Nam, chỉ những năm gần đây do đặc tính tạo glucoamylase với hiệu suất cao nên đang được nghiên cứu ở các viện nghiên cứu

Kawasaki có màu vàng nâu, màu hoa cau…hệ sợi, khuẩn ty có vách ngăn, sinh sản

bằng bào tử, trên đầu mọc các cuống sinh bào tử đính Các bào tử đính xỏa ra như

những bông hoa, không có diệp lục tố, khả năng sinh độc tố chưa được biết tới nhưng cũng như bao loài mốc khác nó cũng gây hư hỏng các sản phẩm nông nghiệp

1.4.3 Đặc điểm sinh hóa:

Kawasaki có khả năng đồng hóa tốt đường glucose và maltose

Có khả năng tổng hợp các enzyme amylase ngoại bào nhưng nhiều nhất là glucoamylase để thủy phân rất tốt tinh bột thành dextrin và từ dextrin ra glucose

Nếu pH < 6 thì glucoamylase bị mất hoạt tính

1.4.4 Môi trường phát triển tối ưu:

Kawasaki phát triển tốt nhất trên môi trường chứa nhiều tinh bột mà nổi bật nhất là

môi trường cám bắp : cám mì (tỉ lệ 6:4) Độ ẩm môi trường 40 – 45%, cần oxy (thoáng khí), pH = 5, môi trường khoáng Czapeak

1.5 Các yếu tố ảnh hưởng tới sinh tổng hợp glucoamylase:

Mọi hoạt động sống của vi sinh vật đều liên quan chặt chẽ tới môi trường, các vi sinh vật không chỉ có nhu cầu về thành phần và số lượng các chất dinh dưỡng mà còn chịu ảnh hưởng của nhiều yếu tố khác như: nhiệt độ, độ ẩm, ánh sáng… của môi trường xung quanh Các yếu tố này có thể kích thích hoặc ức chế sinh tổng hợp thậm chí còn làm vi sinh vật bị tiêu diệt suốt thời gian bảo quản cả khi sử dụng

1.5.1 Ảnh hưởng của pH:

Mỗi loài vi sinh vật thích hợp với một giá trị nhất định của môi trường nuôi cấy Thậm chí cùng một chủng vi sinh vật thì pH thích hợp cho sự sinh trưởng cũng khác với pH cần cho sự sinh tổng hợp sản phẩm

Trong quá trình lên men, vi sinh vật tạo ra những sản phẩm trao đổi chất có tính acid hay kiềm làm pH của môi trường không thích hợp cho hoạt động sống Vì vậy việc chủ động điều chỉnh pH của môi trường luôn ở giá trị thích hợp trong suốt quá trình lên men là điều cần thiết

1.5.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ:

Nhiệt độ là yếu tố quan trọng ảnh hưởng rất lớn đến sự phát triển của vi sinh vật và hiệu quả lên men, nhiệt độ cao ảnh hưởng rất mạnh và trực tiếp đối với vi sinh vật, nhiệt độ từ 60 – 700C kéo dài trong 30phút có thể gây biến tính protein hoặc có thể làm

hệ enzyme không hoạt động được, vi sinh vật dễ dàng bị tiêu diệt khi hạ nhiệt độ xuống thấp không tác động mạnh lên vi sinh vật như khi tăng nhiệt độ lên cao, tuy không gây tiêu diệt nhưng sẽ ức chế mọi hoạt động sống của chúng

1.5.3 Ảnh hưởng của oxygen:

Phần lớn vi sinh vật tạo ra amylase là những vi sinh vật hiếu khí Khi nuôi cấy vi

sinh vật hiếu khí cần phải có tiếp xúc giữa chúng và oxy Oxy là một trong những yếu

tố cơ bản ảnh hưởng tới sự sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật hiếu khí, cũng như quá trình trao đổi chất trong tế bào Thiếu oxy ở một khu vực nào đó trong môi trường nuôi cấy sẽ đưa đến phá vỡ sự trao đổi chất trong tế bào Tuy nhiên nhu cầu oxy đối với sự sinh trưởng và tạo ra những sản phẩm trao đổi chất ở các vi sinh vật hiếu khí không phải bao giờ cũng giống nhau

1.5.4 Ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng:

Enzyme chia làm 2 nhóm:

 Nhóm 1: Là enzyme cảm ứng có nghĩa là sự tồn tại cơ chất của môi trường sẽ kéo theo sự tăng lên của enzyme trương ứng để thủy phân cơ chất đó Cơ chất nuôi

kawasaki để tổng hợp glucoamylase là tinh bột

 Nhóm 2: Là enzyme bản thể, được tạo thành trong cơ thể không phụ thuộc cơ chất có hay không có trong môi trường

Mg2+ có ảnh hưởng tới độ bền nhiệt của enzyme Nếu thiếu thành phần này sẽ có

ảnh hưởng xấu đến sự tổng hợp mọi enzyme amylase bởi nấm sợi khi đó sự tổng hợp

α – amylase bị ức chế hoàn toàn, còn hàm lượng glucoamylase bị giảm xuống hàng

chục lần

Thành phần môi trường cũng cần chứa các chất khoáng như: P, S, Mn2+, K, Na… Nếu không sẽ làm thay đổi đáng kể sự trao đổi chất trong tế bào vi sinh vật nhưng chỉ cần lượng cần thiết nhất định

1.5.5 Ảnh hưởng của độ ẩm:

Trong điều kiện sản xuất, độ ẩm ban đàu của môi trường là 35 – 60% đối với các

chủng nấm mốc như Aps Niger, Asp.awamori, Asp.flavus, Asp.oryzae và phải giữ cho

môi trường có độ ẩm đó trong suốt thời gian nuôi cấy, tùy vào đặc tính sinh lý của từng chủng Độ ẩm vượt quá 55 – 70% sẽ làm giảm độ thoáng khí, còn thấp hơn 40 – 55% thì kìm hãm sự sinh trưởng, phát triển và tạo enzyme của nấm mốc Khi nuôi trong điều kiện không được vô trùng tuyệt đối, thì độ ẩm môi trường sau khi cấy giống không vượt quá 60%, vì cao hơn nữa sẽ dể bị nhiễm khuẩn Tuy vậy, việc giữ được độ

ẩm tối ưu (phòng ngừa và hạn chế sự hỏng khô canh trường) trong suốt quá trình sinh trưởng của nấm sợi lại còn có ý nghĩa to lớn hơn đối với sự tạo thành enzyme

Môi trường được chuẩn bị với các thông số về điều kiện nuôi cấy tương tự như trong các thí nghiệm nêu trên

1.5.6 Ảnh hưởng của thời gian thu nhận:

Thời gian nuôi cấy để có lượng amylaza cực lớn được xác định bằng thực nghiệm

Tùy thuộc vào tính chất sinh lý của chủng vi sinh vật và sự tổng hợp enzyme mà thể ngừng sinh trưởng của nấm mốc vào bất kì lúc nào cần thiết Đối với đa số nấm mốc sự tạo bào tử là hiện tượng không mong muốn vì như thế thường làm giảm hoạt lực enzyme Trong điều kiện sản xuất thoáng khí tốt, thời gian nuôi cấy để có thể tích lũy

amylaza cực đại đối với từng loại nấm sợi khác nhau cũng khác nhau

1.6 Phương pháp nuôi cấy vi sinh vật sản xuất enzyme:

Hiện nay có 2 phương pháp đang được áp dụng để nuôi cấy vi sinh vật thu nhận enzyme gồm: Nuôi cấy bề mặt và nuôi cấy chìm

1.6.1 Phương pháp nuôi cấy bề mặt:

Là phương pháp nuôi cấy mà vi sinh vật sẽ mọc trên bề mặt của môi trường, môi trường thường dùng là các nguyên liệu tự nhiên như: Cám mì, cám gạo, cám bắp…Tùy theo đối tượng vi sinh vật và mục đích nuôi cấy khác nhau mà bổ sung thêm các chất cảm ứng và một số thành phần khác cho thích hợp

 Ưu điểm:

Nuôi cấy vi sinh vật bằng phương pháp này enzyme thu được có nồng độ và hoạt tính cao, chế phẩm dễ sấy khô, ít bị giảm hoạt tính, dễ vận chuyển và sử dụng, không cần thiết bị phức tạp, tiêu thụ năng lượng ít nên thích hợp với nhiều vùng sản xuất

 Nhược điểm:

Tuy nhiên, phương pháp này lại cần mặt bằng lớn và chi phí lao động cao cơ giới hóa trong sản xuất khó

1.6.2 Phương pháp nuôi cấy chìm:

Khác với phương pháp nuôi cấy bề mặt, phương pháp nuôi cấy chìm ta cho vi sinh vật phát triển trong môi trường lỏng Thành phần dinh dưỡng của môi trường lỏng thích hợp với mỗi chủng vi sinh khác nhau là khác nhau

Tuy nhiên phương pháp này lại đòi hỏi đầu tư nhiều chi phí cho thiết bị

1.7 Phương pháp thu nhận enzyme từ môi trường lên men bán rắn:

1.7.1Quá trình trích ly:

Enzyme có trong tế bào vi sinh vật số lượng không nhiều so với các thành phẩn khác Khi chiết rút enzyme từ canh trường ta thu được không chỉ có enzyme hòa tan trong nước mà thu được rất nhiều sản phẩm thủy phân từ cơ chất môi trường và cả chất màu của chính nấm mốc tạo ra

Enzyme có bản chất là protein, rất dễ bị biến tính khi bị tác động bởi các yếu tố bên ngoài như nhiệt độ Do đó, việc thu nhận enzyme là không dễ dàng

Để tách chiết enzyme từ môi trường bán rắn, ta thường dùng nước cất hoặc các dung dịch đệm thích hợp hoặc các muối trung tính Trong đó, nước cất thường được sử dụng nhất vì sự thuận tiện và kết quả của nó mang lại cao

Enzyme từ môi trường khuếch tán vào nước do sự chênh lệch nồng độ Nước có thể tách từ 90 – 95% enzyme trong môi trường nước dùng để chiết thường có nhiệt độ từ

25 – 280C

Trong quá trình nấm mốc sinh trưởng trên môi trường nuôi cấy, các vật chất khô trong môi trường sẽ hòa tan và có tới 33 – 35% tinh bột được thủy phân hoàn toàn, phần đường không được vi sinh vật sử dụng sẽ còn lại trong môi trường này

1.7.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến kết quả trích ly:

 Ảnh hưởng của tỉ lệ nước hoặc đệm để trích ly:

Canh trường khô cần nhiều nước để trích ly enzyme hơn canh trường ẩm Với các tỉ

lệ (đệm : canh trường) nuôi cấy khác nhau sẽ trích ly được lượng enzyme khác nhau Thường lượng nước dùng trích ly gấp 3 - 3,5 lần so với canh trường nuôi cấy nấm mốc Hoặc tỷ lệ đệm gấp 2 – 2,5 lần canh trường

 Ảnh hưởng của thời gian trích ly:

Enzyme thủy phân dễ hòa tan vào nước, thời gian trích ly kéo dài thì khả năng trích

ly được nhiều enzyme hơn nhưng làm tăng hàm lượng tạp chất trong dịch chiết và làm giảm hoạt tính của enzyme

 Ảnh hưởng của nhiệt độ và pH:

Khi nhiệt độ trích ly tăng dẫn đến vận tốc trích ly tăng và tăng hàm lượng tạp chất trong dịch chiết nên hiệu suất thu nhận enzyme và hoạt tính enzyme thu được bị giảm

đi Nhiệt độ tối ưu cho quá trình trích ly là 20 – 300C Trong công nghiệp thường dùng nước có pH = 7,8 để trích ly enzyme

1.8 Tinh sạch chế phẩm enzyme:

Việc làm sạch enzyme chính là việc loại các protein không phải enzyme, nước, các thành phần khác không phải tế bào ra khỏi enzyme Công việc này hoàn toàn không dễ dàng Để tinh sạch enzyme người ta phải dùng đến nhiều phương pháp khác nhau Rất

ít khi, với một bước hay một phương pháp duy nhất mà có thể thu được chế phẩm enzyme tinh khiết Tùy theo nguồn cho enzyme, loại enzyme, mục đích sử dụng enzyme và điều kiện phòng thí nghiệm mà ta lựa chọn những phương pháp để đem lại hiệu quả cao nhất dưới đây là những phương pháp thường dùng để tinh sạch enzyme

1.8.1 Phương pháp kết tủa enzyme:

Kết tủa là phương pháp được sử dụng rộng rãi trong các nghiên cứu enzyme trong phòng thí nghiệm và sản xuất enzyme trong quy mô sản xuất công nghiệp

Phương pháp kết tủa dựa trên nguyên tắc: enzyme là một phức hợp protein có khả năng tạo kết tủa với một số dung môi Trong quá trình kết tủa, người ta phân biệt hai dạng thuật ngữ: kết tủa âm và kết tủa dương

Kết tủa âm là sự kết tủa protein tạp Phần protein cần thiết nằm trong dung dịch Kết tủa dương thì hoàn toàn ngược lại, các protein cần thiết lại nằm trong phần kết tủa còn prtein tạp nằm trong dung dịch

 Phương pháp tủa bằng muối: muối nồng độ cao tác dụng với phân tử nước

bao quanh protein enzyme và làm chuyển hóa điện tích, làm thay đổi tính hòa tan của enzyme

Có thể dùng các loại muối sau để tủa enzyme: (NH4)2SO4, NaCl, Na2SO4, MgSO4… Trong công nghiệp enzyme hiện nay, người ta thường sử dụng muối (NH4)2SO4 Ưu điểm của muối này là do muối này có mức độ hòa tan rất cao trong nước (có thể đạt tới 720g/l, ở nhiệt độ 250C), ít làm mất hoạt tính enzyme, thậm chí còn có tác dụng làm bền enzyme Một ưu điểm nữa của muối (NH4)2SO4 là khả năng kết tủa chọn lọc protein, do đó sẽ loại bỏ được nhiều protein không mong muốn trong dịch chiết

Hạn chế của phương pháp sử dụng muối (NH4)2SO4 là mất nhiều thời gian, ly tâm ở tốc độ cao và nhiệt độ thấp, sau đó cần loại muối khỏi chế phẩm khi chuyển sang bước tinh sạch khác

 Phương pháp tủa enzyme bằng dung môi hữu cơ:

Thường dùng ethanol, acetone hay izopropanol…Phương pháp này hiện nay được

sử dụng rộng rãi vì dễ tiến hành, hóa chất đơn giản, hiệu suất thu hồi tốt, hoạt tính enzyme cao

Người ta thường tiến hành kết tủa enzyme bằng dung môi hữu cơ ở nhiệt độ từ 3 –

50C, làm lạnh cả dung môi hữu cơ và enzyme, do enzyme rất nhạy cảm với nhiệt độ khi có mặt dung môi hữu cơ

Tỷ lệ và nồng độ các dung môi hữu cơ dùng để kết tủa enzyme được xác định bằng thực nghiệm cho từng loại enzyme và từng nồng độ enzyme có trong dung dịch enzyme

Khi cho dung môi hữu cơ vào dung dịch enzyme sẽ làm giảm khả năng tan của nước bao quanh enzyme Hiện tượng này xảy ra là do sự giảm hằng số điện ly của dung môi, đẩy một lượng nước lớn Các phân tử nước sắp xếp trật tự xung quanh các đoạn kỵ nước trên bề mặt enzyme có thể được thay thế bằng phân tử của dung môi hữu

cơ Các enzyme có tính kỵ nước mạnh sẽ có khả năng tan hoàn toàn trong dung môi hữu cơ

 Kết tủa enzyme bằng polymer:

Polyethylene glycol là một polymer cao phân tử được ứng dụng rộng rãi trong kết tủa protein enzyme Nhiều tác giả cho rằng phương pháp lắng của chúng gần giống dung môi hữu cơ

Ưu điểm của phương pháp này là có thể thực hiện quá trình kết tủa ở nhiệt độ thường và luongj polyethylene glycol cần sử dụng để kết tủa không nhiều ( khoảng 5 – 15%)

Cơ chế tạo kết tủa của các polymer với enzyme giống như cơ chế tạo kết tủa của các dung môi hữu cơ với enzyme Trong công nghiệp, thường sử dụng nồng độ polymer khoảng 15 – 20% để kết tủa enzyme

1.8.2 Phương pháp sắc ký:

Phương pháp sắc ký là phương pháp cơ bản quan trọng nhất để làm sạch enzyme Phương pháp sắc ký đã được ứng dụng theo quy mô công nghiệp vào những năm 1960 Nguyên tắc: chất được tách nhờ tương tác giữa hai pha (pha động và pha tĩnh) Pha động (ở dạng lỏng hoắc khí) vận chuyển chất càn tách qua pha tĩnh (dạng rắn hoặc lỏng) còn gọi là chất hấp phụ Phase này có khả năng liên kết khác nhau với các thành phần khác nhau cần tách có mặt trong phase động các thành phần này sẽ rửa trôi ra

khỏi ở các thời điểm khác nhau phụ thuộc vào mức độ liên kết của chúng với phase tĩnh Thành phần nào liên kết yếu sẽ bị rữa trôi trước Dưới đây là một số phương pháp sắc ký chủ yếu

Hình: tách các phân tử bằng lọc gel

 Sắc ký trao đổi ion:

Phương pháp sắc ký trao đổi ion đạ trên sự tích điện của phân tử protein Phương pháp này được sử dụng rộng rãi trong sản xuất enzyme theo quy mô công nghiệp tính chất tích điện của protein chịu ảnh hưởng rất nhiều bởi giá trị pH Từ đó, người ta chọn chất trao đổi là anion hay cation

Ngày nay, sắc ký ái lực được sử dụng rất phổ biến trong công nghệ tinh sạch enzyme Nhược điểm của phương pháp này là không tìm được chất gắn thích hợp

 Sắc ký kỵ nước:

Phương pháp này dựa trên sự tương tác của vùng kỵ nước của phân tử protein với nhóm kỵ nước trên chất nền, sự hấp phụ xảy ra ở nồng độ muối cao và quá trình phân đoạn với muối phương pháp này đặc biệt thích hợp đối với muối ammonium sulfate

 Sắc ký lọc gel hay còn gọi là sắc ký lọc rây phân tử:

Nguyên tắc của phương pháp này là dựa vào mức độ dịch chuyển khác nhau của các phân tử có kích thước khác nhau trong hệ thống mạng lưới rây phân tử của các gel sắc ký Gel thường dùng là sephadex, sepharose Ký hiệu của các gel này (sephadex G – 10, G – 15, G – 50, G – 100… hay sepharose 4B, 6B…) nói lên sự khác nhau về kích thước mắt lưới gel càng nhỏ Các mẫu khi đi qua một hệ thống các hạt gel và do đó thời gian đi qua cột gel sẽ lâu hơn các phân tử có kích thước lớn chỉ đi được vào khoảng trống giữa các hạt gel Theo nguyên tắc này, khi cho một hỗn hợp các phân tử

có kích thước khác nhau đi qua cột gel thì các phân tử có kích thước lớn sẽ chui ra trước, còn các phân tử có kích thước nhỏ sẽ chui ra sau Nhờ vậy, phương pháp cho phép phân chia các đại phân tử khác nhau về khối lượng hay kích thước phân tử

Nhược điểm của phương pháp này là không áp dụng được với thể tích mẫu lớn

1.8.3 Ý nghĩa của kỹ thuật tinh sạch trong công nghệ enzyme:

Chế phẩm enzyme thô thường chứa những thành phần cơ bản sau: nước, protein không có hoạt tính sinh học, các tạp chất từ tế bào hay từ môi trường nuôi cấy, enzyme (protein có hoạt tính sinh học)

Quá trình tinh sạch là quá trình loại bỏ phần đầu, chỉ nhận sản phẩm cuối cùng là protein có hoạt tính sinh học Việc loại bỏ được thực hiện theo nhiều giai đoạn khác nhua và sẽ thu nhận những giá trị quan trọng sau:

 Giảm khối lượng Có ý nghĩa cho việc đóng gói, vận chuyển và bảo quản

 Tăng hoạt tính enzyme Có ý nghĩa rất lớn trong quá trình vận chuyển sau này

 Tăng giá trị kinh tế thông qua giá thành sản phẩm

1.9 Phân tích protein bằng điện di trên gel polyacrylamide:

Phương pháp điện di là phương pháp nghiên cứu sự chuyển động của các phân tử mang điện trong điện trường Phương pháp này dùng để xác định trọng lượng phân tử của các protein

Nguyên tắc : Gel polyacrylamide là gel được tạo thành do sự polymer hóa các phân

tử acrylamide và N,N’- methylene-bis-acrylamide Quá trình polymer háo được xúc tác bởi hệ thống ammoniumpersulfate (APS), N,N,N’, N’- tetramethylethylenediamine (TEMED) Sự di chuyển của cá phân tử trên gel phụ thuộc vào điện trường và kích thước của lỗ gel Khả năng phân tách cũng như giới hạn trọng lượng phân tử của các phân tử sinh học mà gel có thể phân tách tùy thuộc vào nồng độ acrylamide và bis-acrylamide: nếu nồng độ thấp sẽ tạo ra lỗ gel lớn, cho page phân tách các các phân tử sinh học có kích thước lớn và ngược lại

SDS – PAGE (sodium Dodecyl Sulfate-polyacrylamide Gel Electrophoresis) là một

kỹ thuật điện di trên gel polyacrylamide khi có sự hiện diện của SDS, đây là một tác nhân làm biến tính và âm tính hóa các phân tử protein Trong kỹ thuật này protein được

xử lý với chất tẩy SDS và tác nhân khử cầu nối disulfite là mercaptoethanol hoặc dithiotheitol (DTT) Với các tác nhân này protein từ cấu trúc bậc 2,3,4 được biến đổi thành chuỗi polypeptide (bậc 1) và tất cả các protein đều được tích điện âm Nhờ đó, sự

di chuyển trong gel của các phân tử protein chỉ phụ thuộc vào kích thước, những phân

tử có kích thước lớn sẽ di chuyển chậm hơn những phân tử có kích thước nhỏ khi đi qua một lỗ gel có kích thước nhất định Dưới tác dụng của điện trường các phân tử tích điện âm sẽ di chuyển về cực âm của điện trường

Để xác định phân tử lượng của một protein, người ta thường so sánh với một thang phân tử chuẩn, là một hỗn hợp các protein có trọng lượng phân tử khác như đã biết

Để đưa các protein trong mẫu về cùng một vạch xuất phát đồng thời tạo ra sự phân tách tốt hơn, người ta thường sử dụng phương pháp điện di trên gel không liên tục (discontinuous gel) Trong phương pháp này gồm hai lớp:

 Lớp gel gom (stacking gel) (lớp trên): các protein trong mẫu được dồn lại và tạo một lớp băng mỏng

 Lớp gel phân tách (separating gel) (lớp dưới): tạo ra các băng protein có trọng lượng phân tử, kích thước khác nhau từ một hỗn hợp protein xuất phát ban đầu

Hai lớp gel này được phân biệt nhau bởi dung dịch đệm, nồng độ acrylamide và vị trí

Kỹ thuật SDS-PAGE có thể xác định được những phân tử protein có trọng lượng phân tử từ 10000 – 200000Daltons Những phân tử protein có trọng lượng phân tử lớn hơn 200000Daltons thường được xác định trên gel có nồng độ acrylamide ít hơn 2,5% Ngoài kỹ thuật SDS- PAGE là phương pháp điện di trong điều kiện làm biến tính protein (Denaturing condition), người ta còn dùng một số kỹ thuật điện di trên gel polyacrylamide khác nhằm phân tích protein trong điều kiện không có biến tính (Nondenaturing condition) không sự hiện diện của SDS hoặc để khắc phục một số vấn

đề về SDS gây ra một số ảnh hưởng đến đặc tính của protein như tạo ra liên kết giữa các protein với nhau Một số protein không có sự tỷ lệ giữa điện tích và khối lượng với những protein khác người ta sử dụng kỹ thuật điện di tập trung điểm đẳng điện

1.10 Sự cố định enzyme

1.10.1 Định nghĩa enzyme cố định

Enzyme cố định (hay còn gọi là enzyme không hoà tan) là những enzyme chuyển động trong không gian bị giới hạn Sự giới hạn của enzyme đạt được bằng cách đưa nó vào một pha cách ly, tách rời khỏi pha dung dịch tự do mà ở đó nó vẫn có khả năng tiếp xúc được với phân tử cơ chất Pha chứa enzyme cố định thường không tan trong nước nhưng cũng có thể là các polymer ưa nước cao phân tử

Theo Michael Trevan, thuật ngữ cố định (immobilization enzyme, insoluble

enzyme) được hiểu là đưa những phân tử enzyme vào những pha riêng rẽ Pha này

được tách riêng với dung dịch tự do Pha enzyme thường không tan trong nước và được gắn với những polymer ưa nước có trọng lượng phân tử lớn

Theo Kalus Mosbach, các chất xúc tác sinh học cố định là enzyme, tế bào, cơ thể sống hoặc tổ hợp giữa chúng trong một trạng thái cho phép sử dụng lại và liên tục

1.10.2 Tính chất ưu và nhược của enzyme cố định

1.10.2.1 Ưu điểm

Enzyme cố định ngày càng sử dụng rộng rãi là nhờ vào những đặc điểm nổi bật:

 Có thể tái sử dụng lặp đi lặp lại nhiều lần một lượng enzyme xác định trong một thời gian dài Do đó làm giảm giá thành sản phẩm, hiệu quả kinh tế cao, tiết kiệm enzyme, đặc biệt quan trọng đối với những enzyme đắt tiền Thuận lợi trong các quá trình tự động hoá và liên tục

 Tăng độ tinh sạch của sản phẩm vì enzyme được cố định ở những pha riêng rẽ,

dễ dàng tách ra khỏi sản phẩm Do đó tránh được những ảnh hưởng không tốt đến sản phẩm Điều này có ý nghĩa đặc biệt quan trọng khi sử dụng enzyme cố định trong sản xuất dược phẩm, trong công nghiệp sản xuất hoá chất tinh khiết và trong phân tích

 Có thể dừng phản ứng ở bất cứ giai đoạn nào khi cần thiết, chỉ cần tách enzyme

1.10.2.2 Nhược điểm

Bên cạnh đó enzyme cố định cũng có những nhược điểm nhất định:

 Hạn chế khả năng tiếp xúc giữa cơ chất với enzyme cho nên hoạt tính riêng của enzyme thường thấp hơn so với enzyme tự do

 Một lượng enzyme đáng kể bị mất hoạt tính khi cố định bằng phương pháp cộng hoá trị là do chất hoạt hoá và do phản ứng gắn kết không đặc hiệu của các liên kết trên vật liệu cố định vào trung tâm hoạt động của enzyme

1.10.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme cố định

Khi gắn lên chất mang, enzyme bị giới hạn trong một phạm vi môi trường xác định, cấu tạo không gian của phân tử có thể bị thay đổi, do đó làm biến đổi một số tính chất của enzyme ban đầu (enzyme hoà tan) Một số yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme không hoà tan là:

 Bản chất và tính chất hoá học của chất mang

 Các tính chất lý học của chất mang như tính hoà tan, tính bền cơ học, độ trương, điện tích, tính háo nước và kị nước,…đều có ảnh hưởng nhất định đến lượng enzyme được liên kết, tính bền và hoạt tính sinh học của các dẫn xuất enzyme cố định Bản chất hoá học của các chất mang cũng có ảnh hưởng đáng kể đến khả năng tạo thành dẫn xuất enzyme, và tới khả năng hấp thụ không đặc trưng các chất từ môi trường phản ứng

 Dẫn xuất enzyme không hoà tan thường có tính bền nhiệt cao so với enzyme tan

do kết quả của sự định vị enzyme tạo nên Chất mang cũng có tác dụng hạn chế sự biến tính của enzyme trong các dung môi có khả năng làm đứt mối liên kết hydro và liên kết

kị nước

 Sự khuếch tán của cơ chất, sản phẩm và các phân tử khác

 Tốc độ khuếch tán của cơ chất, sản phẩm và các chất phụ khác

 Phương pháp liên kết enzyme với vật liệu cố định (carrier binding)

 Phương pháp hấp thụ vật lí (physical adsorption)

 Phương pháp nhốt (entrapment)

 Phương pháp khâu mạch (cross – linking)

1.10.4.1 Phương pháp liên kết enzyme với vật liệu cố định (carrier binding)

Nguyên tắc của phương pháp này là enzyme được nối với chất mang thông qua cầu nối Cầu nối phải có kích thước không lớn và có hai đầu, một đầu gắn chất mang còn đầu kia gắn với enzyme, đảm bảo liên kết vững chắc của enzyme với chất mang

Phương pháp này thì enzyme không bị rửa trôi khỏi chất mang trong quá trình sử dụng, do liên kết chặt chẽ với vật liệu cố định bằng liên kết cộng hoá trị nên tăng khả năng ổn định với sự thay đổi nhiệt độ Nhưng do liên kết chặt chẽ enzyme với chất mang, nên cản trở hoạt động của phân tử enzyme, làm giảm khả năng tiếp xúc giữa enzyme với cơ chất, kết quả làm giảm hoạt tính của enzyme cố định Vật liệu cố định thường không tái sử dụng được, vì vậy phương pháp này chỉ thích hợp với những enzyme đắt tiền và ổn định hoạt tính khi cố định

1.10.4.2 Phương pháp hấp thụ vật lí (physical adsorption)

Phương pháp này khá đơn giản, được sử dụng sớm nhất và được ứng dụng rộng rãi

để cố định enzyme Quá trình cố định là trộn lẫn dung dịch enzyme với vật liệu cố định rồi ủ một thời gian cho phép rồi lọc, rửa phần enzyme không hấp thụ Enzyme được cố

định trên chất mang nhờ các liên kết yếu như: liên kết ion, liên kết hydro, liên kết Van der Wall,…

Trong phương pháp hấp thụ vật lí thì hoạt tính enzyme cố định thường cao, từ 50 –

100 % Tuy nhiên, hoạt tính không ổn định lâu dài, enzyme dễ bị hấp thụ do sự thay đổi pH, nhiệt độ, nồng độ enzyme và các thành phần ion

1.10.4.3 Phương pháp nhốt (entrapment)

 Nhốt trong cấu trúc mạng gel (entrapment in gel)

Đây là phương pháp khá đơn giản, enzyme ít bị biến đổi qua quá trình cố định Để gói enzyme vào trong khuôn gel người ta tiến hành trùng hợp hoá các gel khi có mặt đồng thời của enzyme Sau khi hoàn thành quá trình trùng hợp ta thu được enzyme bị nhốt trong các lỗ gel Gel đã có enzyme có thể nghiền nhỏ bằng cách đồng hoá hoặc ép qua rây có lỗ nhỏ rồi đem sấy khô ở nhiệt độ thấp Dẫn xuất enzyme loại này lần đầu tiên do Bernfeld (1933) thu được bằng cách trùng hợp acrylamide với N, N-

metylenbisacrylamide Phương pháp này thường dùng gần đây do chất trùng hợp dễ tạo thành hạt và tuỳ vào điều kiện tiến hành mà gel có độ xốp khác nhau

Alginate và Caraghehan lấy từ rong biển thường có khả năng tạo gel tốt, thuận lợi

để gói enzyme và tế bào Canxialginate là một trong những vật liệu thích hợp cho phương pháp nhốt enzyme Hỗn hợp enzyme và alginate được nhỏ xuống dung dịch CaCl2 để tạo hạt

qua một khuôn lọc dưới áp suất của nitơ Các sợi ra khỏi khuôn được nhúng vào trong một cái bể đông tụ có chứa toluen, sau đó được làm khô trong chân không

 Dạng bao vi thể (microcapsul)

Enzyme được nhốt trong bao vi thể có màng bán thấm, màng này được tạo ra từ các polymer có kích thước lỗ đủ nhỏ để ngăn cản sự khuếch tán ra ngoài Vì enzyme hoạt động trong môi trường dung dịch nên khả năng tiếp xúc giữa enzyme và cơ chất lớn hơn, vì vậy mà hoạt tính enzyme cao hơn so với nhốt trong cấu trúc mạng gel

 Dạng màng siêu lọc

Phương pháp này đơn giản, tương tự như nhốt torng bao vi thể Enzyme được giữ trong màng siêu lọc Màng bán thấm này cho phép các cơ chất và sản phẩm có trọng lượng phân tử thấp qua lại tự do nhưng giữ lại enzyme có trọng lượng phân tử cao

1.10.4.4 Phương pháp khâu mạch (cross – linking)

Những chất có hai hoặc đa nhóm chức năng như: diisocyanate, glutaraldehyde, hexamethylen disocyanate được dùng làm cầu nối khâu mạch các phân tử enzyme Những enzyme được khâu mạch tạo thành mạng lưới không tan trong nước Theo phương pháp này thì hoạt tính của enzyme cố định thường thấp, do các hợp chất khâu mạch có thể liên kết không đặc hiệu vào trung tâm hoạt động của enzyme và enzyme bị liên kết tạo thành một khối kém linh động

1.10.5 Đặc điểm, tính chất của Natrialginate

Là chuỗi polymer mạch thẳng không phân nhánh, là dẫn xuất của alginic kết hợp với cation của kim loại Na2+, cấu trúc của alginate gồm hai acid hợp thành: acid α-L-guluronic (gọi tắt là G) và acid β-D-manuronic (gọi tắt là M) qua liên kết 1-4 glycosit Natrialginate có nguồn gốc từ một loại tảo nâu Natrialginate có các tính chất sau:

 Khả năng tạo độ nhớt

 Khả năng tạo gel

 Khả năng tạo màng

1.10.6 Ứng dụng của enzyme cố định

1.10.6.1 Trong công nghiệp

Ngày nay, nhiều quy trình ứng dụng enzyme cố định trong công nghiệp như: công nghiệp sản xuất rượu bia, nước giải khát, chế biến sữa, sản xuất da, hóa chất…

Rượu bia: Các enzyme amylase, tế bào nấm men cố định enzyme được sử dụng ở quy mô lớn

Chế biến sữa: Enzyme lactase cố định để thủy phân lactose trong sữa

Năm 1969 Wilson đã sản xuất liên tục glucose bằng glucoseamylase cố định

Năm 1971 đã dung Chimotrypsin liên kết cộng hóa trị với carboximethyl cellulose làm đông tụ sữa thay cho rennin đắt tiền

1.10.6.2 Trong y học

Enzyme cố định được ứng dụng nhiều trong y học, để chữa các bệnh di truyền do thiếu enzyme hoặc hoạt độ enzyme yếu Năm 1954, Chung đã tạo được vi tiểu cầu bán thấm có gắn enzyme, nhờ thế enzyme có thể tồn tại trong cơ thể lâu dài vì enzyme bị biệt lập với môi trường xung quanh Do đó cơ thể tạo được nồng độ cao của enzyme thiếu mà không bị ảnh hưởng của các phản ứng phụ

Enzyme được cố định còn được dùng trong chuẩn đoán bệnh Ngoài các ứng dụng điện cực enzyme trong phân tích các chỉ tiêu sinh hóa của máu như lượng: glucose, urea, cholesterol…Enzyme Horseradish peroxidase cố định trên polystyren cùng với kháng thể , giúp chuẩn đoán nhanh và chính xác (kĩ thuật ELISA)

Enzyme L-asparaginase có khả năng ức chế sự phát triển của u ác tính, nếu đưa trực tiếp enzyme này vào cơ thể sẽ bị đưa ra ngoài nhanh chóng và gây nên hiện tượng dị ứng, nhưng nếu đưa các vi tiểu cầu có gắn enzyme vào cơ thể sẽ có hiệu quả cao hơn

1.10.6.3 Trong nghiên cứu khoa học

Năm 1967, điện cực enzyme đã được chế tạo để xác định nồng độ glucose nhờ glucoxydase cố định Điện cực enzyme là điện cực oxy trên bề mặt gel polyacryamide Nhúng điện cực vào dung dịch glucose thì cơ chất và oxy sẽ khuếch tán vào gel chứa enzyme Như vậy sự biến đổi dòng điện trong hệ thống điện cực phụ thuộc vào tốc độ phản ứng và nồng độ glucose

Kaetsu dùng điện cực urease trong máu, dùng cholesterol oxydase đo nồng độ cholesterol

Clark dùng điện cực alcohol oxyreductase để xác định nồng độ cồn

Ngoài ra enzyme cố định còn có thể được dùng vào nhiều mục đích khác nhau như : hoạt hóa enzyme zymogen, nghiên cứu cấu trúc phân tử protein, sử dụng trong

phương pháp sắc kí ái lực để tinh chế một số chất có khả năng liên kết đặc biệt với enzyme ngày nay có nhiều quy trình sử dụng tế bào cố định để xử lí nước thải đạt hiệu quả cao

1.10.6.4 Trong bảo vệ môi trường

Trong công nghiệp chế biến thực phẩm, rượu, bia, chế biến đường…chất thải, phế phụ liệu của những nhà máy này là nguồn ô nhiễm nặng do giàu chất hữu cơ Do đó có thể sử dụng enzyme cố định để xử lí nước thải sinh học nhằm làm giảm thiểu hàm lượng hữu cơ trước khi đưa ra ngoài môi trường bên ngoài

1.10.7 Tình hình nghiên cứu trong nước và ngoài nước

1.10.7.1 Tình hình nghiên cứu trong nước

Nghiên cứu cố định enzyme chỉ mới bắt đầu ở Việt Nam trong vài năm gần đây, kết quả thu được cũng còn nhiều hạn chế

Năm 1994 -1995, Viện Sinh Học Nhiệt Đới Thành Phố Hồ Chí Minh nghiên cứu enzyme glucoisomerase trên các hạt Silochrom B2 hoạt hóa bằng glutaraldehyde

Lê Văn Hiệp (1995), cố định vi khuẩn tả (Vibrio cholerea) lên giá thể PHEMA bằng kĩ thuật bức xạ, Nguyễn Quốc Hiến (1996) đã nghiên cứu chế tạo chế phẩm hormone progesterone thải chậm bằng kĩ thuật bức xạ

Lê Quang Luân (1997) đã cố định vi khuẩn Pseudomonas mastophlla để xử lí chất hữu cơ nước

Nguyễn Quang Tâm (2002) đã nghiên cứu cố định pectinase thu thập từ các chủng nấm mốc, Nguyễn Quyết (2004) đã nghiên cứu cố định α – amylase thu nhận từ vi khuẩn Bacillus subtilis…

1.10.7.2 Tình hình nghiên cứu nước ngoài

Nghiên cứu enzyme cố định bắt đầu từ năm 1916 khi Nelson và Griffin quan sát và cho thấy rằng enzyme invertase của nấm men khi hấp thụ vào than có khả năng thủy phân đường saccharose Sau đó trên thế giới xuất hiện nhiều báo cáo về khả năng cố định các enzyme bằng liên kết đồng hóa trị trên chất mang

Năm 1963, Bernfeld và Wan đã thí nghiệm thành công việc nhốt các enzyme như amylase, tripsin, papain, ribonuclease và polyacryamide

Năm 1969, Wilson đã xây dựng thành công xưởng thực nghiệm để sản xuất glucose bằng glucoseamylase cố định Cũng trong năm này Chibata và những người cộng tác ở công ty Tanabe Seiyaku - Nhật đã làm những đầu tiên thực hiên thành công việc áp dụng enzyme không hòa tan vào trong sản xuất công nghiệp

Những năm gần đây đã có nhiều nghiên cứu việc cố định enzyme trên chất mang chitosan, điển hình là một số nghiên cứu sau: Ali KILNC và ctv (2001), đã nghiên cứu việc ổn định Penicilin G Acylase bằng việc cố định trên chitosan đã được hoạt hóa bởi

glutaraldehyde Ehab Taqieddin và ctv (2002), đã nghiên cứu việc cố định enzyme Horseradish Peroxidase (HPR) bằng phương pháp vi nang trên tritosan kết hợp với alginate Asta Zubriene và ctv(2003), đã nghiên cứu việc cố định hidrolase lên trên các hạt chitosan

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.1 Vật liệu

2.1.1 Nguồn vi sinh vật

Nấm mốc Aspergillus Kawasaki sử dụng chủng thương mại do Jaegaki Industry Inc Nhật Bản cung cấp đã được Viện Sinh Học Nhiệt Đới nhập về Bào tử giống được giữ tại Viện Sinh Học Nhiệt Đới

Các hóa chất dùng để pha dung dịch đệm: CH3COONa.3H2O, CH3COOH,

2-2.2.2 Thiết bị

Máy Quang Phổ kế Hewwlett Packard 8435 ( phần mềm HPUV – Vis Chemstations)

Phòng đếm hồng cầu, Hirschmann Laborgerate

Kính hiển vi quang học Olympus

Cân phân tích Mettler Toledo

Máy ly tâm Jouan CR412

Nồi hấp Tommy-SS-325

Máy đo pH Precisa

Máy xay sinh tố Máy sấy Máy lắc

2.2.3 Môi trường

Môi trường dùng để giữ giống PGA (Potato glucose agar):

Môi trường lên men bán rắn để thu nhận glucoamylase

2.3 Các phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Nuôi nấm mốc Asp.kawasaki

 Môi trường dùng để giữ giống PGA