Nghiên cứu thu nhận tinh sạch enzyme glucoamylase từ nấm mốc aspergillus

tên đề tài.txt Nghiên cứu thu nhận, tinh Enzyme Glucoamylase từ nấm mốc Aspergillus Kawasaki môi trường lên men bán rắn, Ứng dụng Enzyne cố định chất mang Alginate Chitosan (Giảng viên hướng dẫn: Cn Đỗ Thị Tuyên) SV: Nguyễn Quốc Đạt Lớp: 06DSH MSSV:106111019 Page Đồ án tốt nghiệp GVHD: CN Đỗ Thị Tuyến CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu sơ lược enzyme: 1.1.1 Khái quát chung enzyme: Hầu hết phản ứng hóa học xảy hệ thống sống protein đặc biệt xúc tác, protein gọi enzyme hay fecment ( ferment ) Enzyme protein có cấu tạo phức tạp đóng vai trò xúc tác sinh học Dưới tác dụng enzyme phản ứng hóa sinh thể xảy nhanh không cần điều kiện nhiệt độ, áp suất cao nồng độ acid hay kiềm đặc Enzyme có tế bào sống, gọi chất xúc tác sinh học (nhằm phân biệt với chất xúc tác có nguồn gốc từ hóa học) Trong tế bào sinh vật, enzyme chiếm 80 % - 90 % thành phần protein tế bào Tuy nhiên, xúc tác cho phản ứng xảy hệ thống sống mà sau tách khỏi hệ thống sống chúng xúc tác cho phản ứng ngồi tế bào (invitro) Tóm lại, nói enzyme là protein có khả xúc tác đặc hiệu cho phản ứng hóa học, chất xúc tác sinh học 1.1.2.Tính chất ưu việt enzyme:  Enzyme hoạt động xúc tác điều kiện “nhẹ nhàng”: nhiệt độ thường khoảng 20 – 45oC, áp suất thường, pH acid yếu, kiềm yếu hay trung tính  Enzyme có tính đặc hiệu cao hẳn xúc tác khác tác dụng lên chất định xúc tác theo kiểu định  Vận tốc phản ứng enzyme xúc tác dễ dàng điều chỉnh chí ngừng phản ứng yếu tố tác động như: nhiệt độ, pH, chất kìm hãm, chất hoạt hóa… SVTH: Nguyễn Quốc Đạt Trang Đồ án tốt nghiệp GVHD: CN Đỗ Thị Tuyến  Enzyme thường có cường lực xúc tác cao nên cần lượng nhỏ enzyme chuyển hóa thành lượng lớn chất, khoảng thời gian ngắn 1.1.3 Nguồn nguyên liệu thu nhận enzyme: Hiện người ta khai thác thu nhận enzyme từ ba nguồn bản:  Từ động vật: từ lâu, loài người biết sừ dụng renin dày bê (nghé) để sản xuất phô mai thu nhận pepsin từ dày động vật Tuy nhiên, enzyme từ nguồn động vật khai thác bị hạn chế số lượng nguyên liệu  Từ thực vật: ta khai thác thu nhận enzyme amylase từ malt, papain từ nhựa đu đủ bromelin từ trái dứa hay thân dứa Tuy nhiên, thể động vật thực vật, trình sinh tổng hợp enzyme gắn liền với trao đổi chất tế bào Số lượng enzyme cần tổng hợp gắn liền với nhu cầu sống tế bào, phận sống thể có số lượng enzyme khơng đồng Vì vậy, có số phận sản xuất enzyme Muốn thu nhận enzyme phải phá bỏ quan chiết rút Như việc dùng động vật, thực vật làm nguồn nguyên liệu sản xuất enzyme hạn chế, không kinh tế đáp ứng nhu cầu ngày cao enzyme Nguồn vi sinh vật khai thác thu nhận nhiều ưu điểm vượt trội sau:  Vi sinh vật có chu kỳ sinh trưởng phát triển ngắn  Hệ enzyme vi sinh vật vô phong phú, có enzyme mà động vật, thực vật không tổng hợp  Vi sinh vật có cường độ sinh sản mạnh, hoạt tính enzyme cao, cần sử dụng lượng nhỏ enzyme chuyển hóa lượng chất lớn  So với động vật thực vật, việc cải tạo giống vi sinh vật dễ dàng hơn, thời gian ngắn SVTH: Nguyễn Quốc Đạt Trang Đồ án tốt nghiệp GVHD: CN Đỗ Thị Tuyến  Vi sinh vật khơng địi hỏi nghiêm ngặt mơi trường dinh dưỡng  Có thể điều khiển điều kiện tối ưu trình ni cấy để thu hiệu suất cao sản xuất 1.2 Enzyme Amylase 1.2.1 Lịch sử Enzyme amylase hay gọi diastase enzyme sinh lý, có ý nghĩa thương mại có lịch sử lâu đời Nó tìm thấy thực vật động vật Năm 1811 – 1814, nhà bác học người Nga - Viện sỹ K.Skirhof người nghiên cứu trình thủy phân tinh bột mầm chiết đại mạch nảy mầm (malt) nhận thấy malt có chứa chất phân giải thành đường Năm 1835, Anselme Jean Persoz tinh chế amylase có từ đại mạch, đồng thời đặt tên diastase ( xuất phát từ chữ Hy Lạp có nghĩa “ phân giải ” ) Sau theo đề nghị Duclo, enzyme phân giải tinh bột đặt tên amylase Amylase sản xuất qui mơ cơng nghiệp năm 1894, có nguồn gốc từ nấm mốc sử dụng loại dược phẩm để chữa bệnh tiêu hóa 1.2.2 Giới thiệu chung enzyme amylase  Hệ enzyme amylase hệ enzyme sử dụng rộng rãi công nghiệp, y học lĩnh vực kinh tế quốc dân khác  Amylase thủy phân tinh bột, glycogen, dextrin thành glucose, maltose, dextrin giới hạn  Hệ enzyme có nước bọt, dịch tiêu hóa người, động vật hạt nảy mầm, nấm mốc, nấm men vi khuẩn  Hiện nay, amylase thu chủ yếu từ canh trường vi khuẩn, nấm mốc số loài nấm men SVTH: Nguyễn Quốc Đạt Trang Đồ án tốt nghiệp GVHD: CN Đỗ Thị Tuyến 1.2.3 Đặc điểm chế tác dụng  Amylase hệ enzyme phổ biến giới sinh vật Các enzyme thuộc nhóm thủy phân (hydrolase), xúc tác phân giải liên kết - glucoside nội phân tử polysaccharide với tham gia nước: R-R’ + H-OH  RH + R’OH  Phương trình thủy phân tinh bột là: ( C6H12O6 ) n  n (C6H12O6)  Hiện nay, người ta biết rõ có loại enzyme amylase: -amylase, thủy phân liên kết  - 1,4 - glucoside polysaccharid đồng loại -amylase, thủy phân liên kết  - 1,4 - glucoside polysaccharid đồng loại -amylase ( hay glucoamylase ) thủy phân liên kết  -1,4 glucoside polysaccharid đồng loại Dextrin – - glucanhydrolase thủy phân liên kết  - 1,6 - glucoside polysaccharide dextrin cuối Amylasepectin - 6- glucanhydrolase thủy phân liên kết  - 1,6 - glucoside polysaccharide dextrin cuối Oligodextrin - 6- glucan hydrolase (hay dextrinase) thủy phân liên kết  - 1,6 - glucoside polysaccharide dextrin cuối Trong đó,  - amylase glucoamylase hai loại enzyme tạo nhiều chủ yếu nấm mốc sử dụng hiệu công nghệ sản xuất rượu, sử dụng làm thức ăn gia súc SVTH: Nguyễn Quốc Đạt Trang Đồ án tốt nghiệp GVHD: CN Đỗ Thị Tuyến Hình 1.1 :Sự thủy phân tinh bột enzym amylase 1.2.4 Vi sinh vật tổng hợp amylase Nhóm enzyme amylase, đa phần tổng hợp nấm mốc vi khuẩn, số từ nấm men  Từ nấm mốc : Asp oryzae, Asp niger, Asp awamorri, Asp usamii; Rhizopusneveus, Asp patatae, Rhizopus delemar, Rhizopus javamicus; Mucor sp, số loài vi sinh vật khác như: Endomycopsis fibuliger, Endomycopsis bifubuliger, Endomymycopsis bispora; Endomyces sp; Saccharomyces diastaticus… tạo amylase, glucoamylase, glucozil transferase  Từ vi khuẩn: Bac distaticus; Bac subtilis; Bac mesentercus; Bac amylosolvens… thường để thu  - amylase chịu nhiệt cao, dùng công nghiệp dệt để tách hồ tinh bột vải SVTH: Nguyễn Quốc Đạt Trang Đồ án tốt nghiệp GVHD: CN Đỗ Thị Tuyến 1.2.5 Ứng dụng enzyme amylase Chế phẩm amylase (dạng thô hay tinh khiết ) ứng dụng rộng rãi công nghiệp - đặc biệt công nghiệp thực phẩm Sau số ứng dụng nó:  Trong công nghệ sản xuất rượu – bia  Trong sản xuất mật, tinh bột, maltose, glucose  Trong công nghiệp nhẹ ( rũ hồ ), ngành dệt, công nghiệp giấy  Trong sản xuất bánh mỳ  Trong y học, chăn nuôi  Trong công nghiệp thực phẩm khác như: bánh kẹo, nước giải khát, đồ hộp nước ép trái cây, sản xuất tương, chao… 1.2.6 Phân loại enzyme amylase 1.2.6.1 Enzyme -amylase (  - 1,4 glucan – – glucanhydrolase, EC 3.2.1.1)  Đặc điểm: Tính chất -amylase dễ tan nước, dung dịch muối rượu loãng Protein  - amylase có tính chất acid yếu tính chất cua globulin Điểm đẳng điện nằm vùng pH 4.2 – 5.7 ( Bernfeld.P.1951)  - amylase metaloenzyme ( enzyme kim loại ) Các  - amylase chứa từ đến 30 nguyên tử gam Ca / mol, song khơng đến Khi tách hồn tồn Ca khỏi phân tử enzyme  - amylase hết khả thủy phân chất Đối với tác dụng acid  - amylase nấm mốc bền vững đối  amylase malt vi khuẩn Đối với nhiệt  - amylase bền nhiệt amylase khác SVTH: Nguyễn Quốc Đạt Trang Đồ án tốt nghiệp GVHD: CN Đỗ Thị Tuyến Tất  - amylase bị kìm hãm kim loại nặng ( Cu2+, Ag+, Hg2+…)  amylase có nguồn gốc khác có thành phần acid amin khác  Cơ chế tác dụng:  - amylase nấm mốc cắt đút tất liên kết  -1,4 glucoside nằm phía mạch polysaccharid cách ngẫu nhiên, khơng theo trật tự Vì thế, người ta gọi enzyme nội phân (endoamylase), trừ điểm phân nhánh amylopectin để tạo thành maltose dextrin giới hạn Như vậy, chúng có khả chuyển 80-82% tinh bột thành maltose  - amylase không thủy phân hồ tinh bột nguyên thủy mà thủy phân hạt tinh bột nguyên lành, song với tốc độ chậm Phản ứng thủy phân tinh bột  - amylase thường xảy hai giai đọan: - Giai đoạn đầu (giai đoạn dextin hóa): số liên kết phân tử bị thủy phân, tạo thành lượng lớn dextrin phân tử thấp ( - dextrin ) độ nhớt hồ tinh bột giảm nhanh - Giai đoạn thứ hai (giai đoạn đường hóa ): dextrin phân tử thấp vừa tạo thành bị thủy phân tiếp tục tạo mantotriose, mantose, glucose lại phần dextrin phân tử thấp không cho màu với Iốt - Tính chất đặc trưng  - amylase khả dextrin hóa cao, làm cho phản ứng màu tinh bột với Iốt bị biến đổi nhanh chóng Vì vậy, người ta gọi  amylase  - amylase dextrin hóa hay amylase dịch hóa  Điều kiện hoạt động: - Ở 70oC,  - amylase nấm mốc bị 50% hoạt lực Trong dung dịch đệm pH 4.7, -amylase Asp oryzae nhạy cảm với nhiệt độ cao, chí 40oC 3h, hoạt động dextrin hóa cịn 22 - 29 % hoạt lực đường hóa 27 - 85 % Ở 500C 2h, amylase Asp oryzae bị vơ hoạt hồn tồn SVTH: Nguyễn Quốc Đạt Trang Đồ án tốt nghiệp - GVHD: CN Đỗ Thị Tuyến PH tối thích cho hoạt động  - amylase nấm mốc 4,5 – 4,8 ( tốt vùng pH 4,5 – 5,8 ) - Nhiệt độ tối thích cho  - amylase nấm mốc 50 0C 1.2.6.2 Enzyme  - amylase ( - 1,4 glucan – – maltohydrolase )(EC 3.2.1.2)  Đặc điểm: Đa số, - amylase có nguồn gốc từ thực vật Một số vi sinh vật có khả tổng hợp  - amylase bền nhiệt cao so với enzym có nguồn gốc thực vật  - amylase khác  - amylase số điểm: không thủy phân hạt tinh bột sống mà lại thủy phân mạnh mẽ hồ tinh bột  - amylase có pH tối ưu cao  - amylase khơng cần Ca2+ để ổn định tăng hoạt tính Việc chứng minh tồn  - amylase nấm mốc chưa khẳng định  Cơ chế tác dụng:  - amylase exo -  - amylase, xúc tác thủy phân từ đầu không khử mạch amylose amylopectin glucogen, chúng cắt liên kết glucoside tạo maltose ( dạng  - anomeric ) Do enzym không thủy phân liên kết  1,6 - glucoside amylose nên kết thủy phân cuối thường gồm 50 – 60 % maltose dạng  - anomeric  - detrin giới hạn, cho màu tím đỏ với iốt 1.2.6.3 Enzyme glucoamylase (1,4 -  - D – glucan glucohydrolase (EC.3.2.1.3)  Tên gọi: Glucoamylase có tên gọi khác nhau:  - amylase, amyloglucosidase, taka amylase Bac, maltulase,  - 1,4:1,6 - glucan - 4:6 – glucohydrolase,… SVTH: Nguyễn Quốc Đạt Trang 10 Đồ án tốt nghiệp GVHD: CN Đỗ Thị Tuyến  Tính đặc hiệu: - Glucoamylase xúc tác thủy phân liên kết  - 1,4 - glucoside lẫn  - 1,6 glucoside, đồng thời liên kết  -1,3 - glucoside đưa glucoamylase lên vị trí hàng đầu thủy phân tinh bột - Glucoamylase enzyme ngoại phân ( exoenzyme ) có khả thủy phân mạnh Nó thủy phân hồn tồn tinh bột, glycogen, amylodextrin cuối, panose, isomaltose, đầu không khử amylose, tách dần đơn vị phân tử đường glucose Sản phẩm cuối glucoamylase glucose, maltose Hình 1.2: Cấu trúc phân tử lượng nhỏ dextrin glucoamylase - Điểm đẳng điện glucoamylase từ nguồn khác không đồng nhất, theo số liệu thống kê nằm khoảng 6.5 – 7.5 CH2OH O H OH H H OH _ H2O CH2OH OH OH amylase _ H H O OH H2O + O H O H+ CH2OH + H H amylase O H2O O H H OH H OH H O OH H H+ O OH H H OH H O OH Hình 1.3 Enzyme glucoamylase thủy phân liên kết  - 1,4 - glucoside  - 1,6 – glucoside SVTH: Nguyễn Quốc Đạt Trang 11 O Đồ án tốt nghiệp GVHD: CN.Đỗ Thị Tuyến Tiến hành: Lấy 1ml dịch enzyme GA từ 5ml dịch tủa enzyme pha đệm acetate, pH6, chạy qua hệ sắc ký cột với thông số sau: Gel: Biogel P100 (Giới hạn phân tách 5000- 100000 Dalton) Cột: 50 x 1,5cm Flow adaptor: 1,5cm Tốc độ dòng: 0,14ml/phút Vmẫu: 1ml Phân đoạn: 2ml/phân đoạn A280: độ hấp thụ protein bước song 280nm Kết tinh qua lọc gel enzyme GA từ nấm mốc Asp.kawasaki sau dịch chiết nước tủa cồn 960 Hình 3.1: Sắc ký đồ lọc Biogel P100 dịch chiết tủa cồn SVTH: Nguyễn Quốc Đạt Trang 79 mốc Đồ án tốt nghiệp GVHD: CN.Đỗ Thị Tuyến Qua sắc ký ta thu peak Peak : từ ống 16 đến ống 26 Peak 2: từ ống 28 đến ống 38 Mang peak xác định hoạt tính hàm lượng protein Tuy nhiên, hoạt tính peak cao nên dự đốn peak có chứa enzyme GA mà ta quan tâm Bảng 3.8: Hoạt tính enzyme (U/g CT) hàm lượng protein (mg/g CT) dịch chiết enzyme tủa cồn sau sắc ký lọc gel Hoạt tính enzyme (U/g CT) Hàm lượng protein (mg/g CT) HTR (U/mg) 841.1 9.3 90.44 Qua bảng số liệu ta nhận thấy, sau tinh enzyme qua sắc ký lọc gel ta thu enzyme có hàm lượng protein thấp enzyme trước tinh Hoạt tính enzyme sau tinh giảm so với mẫu enzyme trước tinh Kết enzyme ta có protein tạp nên hàm lượng sau tinh thấp hàm lượng trước tinh Sau tinh protein tạp bị loại bỏ, nên hoạt tính riêng enzyme sau tinh cao hon nhiều so với enzyme trước tinh 3.5 So sánh độ tinh enzyme GA trước sau sắc ký Bảng 3.9: So sánh độ tinh enzyme GA trước sau sắc ký Mẫu enzyme ∑Hoạt tính (U) ∑Hàm lượng (mg) Hoạt tính riêng(U/mg) Độ tinh sạch(lần) Hiệu suất (%) Enzyme thô Enzyme sau tinh 1118.67 841.1 25.629 9.3 43.6 90.44 2.07 100 75.2 SVTH: Nguyễn Quốc Đạt Trang 80 Đồ án tốt nghiệp GVHD: CN.Đỗ Thị Tuyến Độ tinh trước sau Sắc Ký 2,5 2,07 Độ tinh sạch(lần) 1,5 Độ tinh sạch(lần) 1 0,5 Enzyme thô Enzyme sau tinh enzyme Đồ thị 3.8: So sánh độ tinh enzyme GA trước sau sắc ký Qua đồ thị ta kết luận sau: mẫu sau sắc ký độ tinh enzyme tăng lên 2.07 lần so với mẫu enzyme thơ số protein tạo tiếp tục bị loại bỏ qua cột gel trình sắc ký SVTH: Nguyễn Quốc Đạt Trang 81 Đồ án tốt nghiệp GVHD: CN.Đỗ Thị Tuyến 3.6 Kết phân tách hệ enzyme GA điện di SDS – Page: Hình 3.2: Kết điện di mẫu protein Giếng 1: Thang chuẩn Giếng 2: Peak Giếng 3: Peak Giếng 4: Enzyme thơ Tính giá trị Rf protein thang chuẩn vạch protein giếng mẫu SVTH: Nguyễn Quốc Đạt Trang 82 Đồ án tốt nghiệp GVHD: CN.Đỗ Thị Tuyến Bảng 3.10: Giá trị Rf Log10M thang protein chuẩn Rf 0.034483 0.068966 0.103448 0.155172 0.206897 0.258621 0.310345 0.362096 0.413793 0.448276 0.534483 Log10M 2.176091 1.954243 1.903009 1.845098 1.778151 1.69897 1.60206 1.477121 1.30103 M(KDa) 150 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 LogM 2 y = -1,9977x + 2,2293 R2 = 0,9407 1 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 Rf Hình 3.3: Đồ thị biểu diễn tương quan LogM protein thang chuẩn với Rf Sau tiến hành xây dựng phương trình hồi quy tuyến tính liên quan Rf Log10M protein thang chuẩn phần mềm Excel có phương trình hồi quy sau: Y= -1.9978x + 2.2293 Trong : Y = LogM: trọng lượng phân tử protein SVTH: Nguyễn Quốc Đạt Trang 83 Đồ án tốt nghiệp GVHD: CN.Đỗ Thị Tuyến X = Rf (protein) Rf tỷ số khoảng cách di chuyển protein khoảng cách di chuyển phẩm màu Bromphenol blue Theo kết điện di đồ áp dụng phương trình hồi quy, ta có bảng sau : Bảng 3.11 : Trọng lượng phân tử dịch chiết enzyme thô Rf 0.103448 0.155172 0.206897 0.258621 0.413793 0.448276 0.534482759 Log10M 2.022631 1.919297 1.815962 1.712628 1.402624 1.333734 1.161510345 M(KDa) 105.349 83.042 65.458 51.597 25.271 21.564 25.505 Bảng 3.12 : Trọng lượng phân tử enzyme sản phẩm Rf LogM M(Kda) 0.103448 2.022631 105.349 0.155172 1.919297 83.042 0.413793 1.402624 25.271 0.534483 1.16151 14.505 Bảng 3.13 : Trọng lượng phân tử enzyme sau tủa cồn P1 Rf LogM M(Kda) 0.103448 2.022631 105.349 0.206897 1.815962 65.457 0.413793 1.402624 25.271 0.534483 1.16151 14.505 Bảng 3.14 : Trọng lượng phân tử enzyme sau tủa cồn P2 Rf LogM M(Kda) 0.103448 2.022631 105.349 0.155172 1.919297 83.042 0.413793 1.402624 25.271 0.534483 1.16151 14.505 Qua bảng số liệu thể mối liên quan tỷ số khoảng cách di chuyển protein cách di chuyển phẩm màu bromphenol blue trọng lượng phân tử protein biết trước Từ xác định trọng lượng phân tử protein cần xác định SVTH: Nguyễn Quốc Đạt Trang 84 Đồ án tốt nghiệp GVHD: CN.Đỗ Thị Tuyến Trọng lượng phân tử enzyme GA từ nấm mốc Asp.kawasakia môi trường lên men bán rắn khoảng 14.505KDa – 105.349KDa 3.7 Cố định khảo sát số lần tái sử dụng sau cố định 3.7.1 Hiệu suất cố định enzyme GA gel Alginate Chitosan Bảng 3.15 : Hiệu suất cố định enzyme GA Alginate Chitosan Chất mang Hoạt tính cố định (U) Alginate Chitosan 246.696 205.541 Hàm lượng protein cố định (mg) 10.10 10.55 Hoạt tính Hiệu suất cố Hiệu suất riêng cố định hàm cố định hoạt định(U/mg) lượng (%) tính (%) 24.43 19.48 99.9 83.25 81.22 67,67 120 100 80 60 Alginate Chitosan 40 20 Hiệu suất cố định hàm lượng (%) Hiệu suất cố định hoạt tính (%) Đồ thị 3.9: So sánh hiệu suất cố định hoạt tính enzyme cố định Alginate Chitosan SVTH: Nguyễn Quốc Đạt Trang 85 Đồ án tốt nghiệp Hình 3.4: Enzyme cố định Alginate GVHD: CN.Đỗ Thị Tuyến Hình 3.5: Enzyme cố định Chitosan Nhận xét: Qua bảng số liệu thực nghiệm ta nhận thấy hoạt tính enzyme cố định 246.696 (U/mg) (cố định Alginate) 205.541 (U/mg) (cố định chitosan) giảm đáng kể so với enzyme tự 303.725 (U/mg) Khi ta gắn enzyme vào chất mang có điện tích khác với điện tích enzyme, làm cấu trúc không gian enzyme thay đổi, làm cho tương tác enzyme chất chậm lại phản ứng xảy yếu hơn(Công nghệ enzyme, Nguyễn Đức Lượng) Bên cạnh đó, nhốt vào gel, gel bao lấy phân tử enzyme tạo thành vật cản với chất enzyme Với hiệu suất cố định đạt 81.22% (Alginate) 67,67%(chitosan) Ta sử dụng hai chất mang chitosan alginate để cố định enzyme sử dụng nhiều lần mà không làm hoạt tính enzyme Tuy nhiên, với tính chất gel Alginate có khả nhốt enzyme cao với hiệu suất nhốt đạt 81.22% SVTH: Nguyễn Quốc Đạt Trang 86 Đồ án tốt nghiệp GVHD: CN.Đỗ Thị Tuyến 3.7.2 Tìm hiểu yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme cố định 3.7.2.1 Tìm hiểu ảnh hưởng pH đến hoạt tính enzyme GA cố định Bảng 3.16: Ảnh hưởng pH đến hoạt tính enzyme GA cố định pH HT(A) (U/g) 103.9 HT (C) (U/g) 103.2 104.0 102.8 101.8 102.0 100.1 101.6 98.9 99.8 pH 10,5 Hoạt tính Enzyme(U/g) 10,4 10,3 10,2 10,1 HT(A) (UI/g) HT (C) (UI/g) 10 9,9 9,8 9,7 9,6 pH3 pH4 pH5 pH6 pH7 Đồ thị 3.10: Biểu đồ biểu diễn ảnh hưởng pH lên hoạt tính enzyme cố định Nhận xét: Nhận thấy sau cố định khoảng pH hoạt động tối ưu enzyme nằm khoảng từ – 4, khoảng pH hoạt tính enzyme cao 103.9 - 104 U/g (Alginate) từ 103.2 – 102.8 U/g (Chitosan) Vì sau cố định điện tích chất mang có ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme cố định pH tối ưu enzyme cố định bị chuyển phía kiềm hay acid so với pH tối ưu enzyme hòa tan SVTH: Nguyễn Quốc Đạt Trang 87 Đồ án tốt nghiệp GVHD: CN.Đỗ Thị Tuyến 3.7.2.2 Tìm hiểu ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt tính enzyme GA cố định Bảng 3.17: Ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt tính enzyme GA cố định Nhiệt độ 30 40 50 60 HT(A) 86.4 94.6 105.5 112.7 HT(C) 78.2 91.8 104.8 110.3 70 43.3 52.8 Nhiệt độ 120 100 80 HT(A) 60 HT(C) 40 20 30oC 40oC 50oC 60oC 70oC Đồ thị 3.11: Biểu đồ biểu diễn ảnh hưởng nhiệt độ lên hoạt tính enzyme cố định Qua tìm hiểu nhiệt độ tối ưu enzyme hịa tan enzyme cố định ta nhận thấy enzyme cố định có khoảng nhiệt độ tối ưu cao so với enzyme hòa tan, nhiệt độ tối ưu enzyme hoà tan 400C, với enzyme cố định khoảng nhiệt độ từ 40 – 600C hoạt tính đạt cao 94.6 – 112.5 (U/g) (Alginate) 91.8 – 110.3 (U/g) (Chitosan) Dựa vào đặc điểm enzyme cố định ta lý giải sau: gắn lên chất mang, enzyme bị giới hạn phạm vi môi trường xác định, chúng bảo vệ chất mang SVTH: Nguyễn Quốc Đạt Trang 88 Đồ án tốt nghiệp GVHD: CN.Đỗ Thị Tuyến Qua bảng kết thực nghiệm biểu đồ nhận thấy với chất mang chitosan, enzyme có độ bền nhiệt cao enzyme cố định chất mang Alginate Tại khoảng nhiệt độ 60 – 800C hoạt tính enzyme giảm mạnh từ 112.7 (U/g) 43.3 (U/g) khoảng nhiệt độ với enzyme cố định chất mang chitosan hoạt tính 52.8 (U/g) 3.7.2.3 Tìm hiểu độ bền nhiệt enzyme GA cố định Bảng 3.18: Ảnh hưởng thời gian phản ứng đến hoạt tính enzyme cố định Thời gian phản ứng (phút) 10 20 30 40 50 60 HT (A) HT (C) 117.7 52.20 35.27 26.40 21.44 17.98 105.30 52.90 35.16 26.50 21.16 17.60 Độ bền nhiệt A (%) 100 44.35 29.96 22.43 18.22 15.28 Độ bền nhiệt C (%) 100 50.24 33.39 25.16 20.09 16.7 Độ bền nhiệt E hòa tan (%) 100 57.8 47.53 44.92 17.54 12.38 Thời gian phản ứng 120 100 Độ bền nhiệt A (%) 80 Độ bền nhiệt C (%) 60 Độ bền nhiệt E hòa tan (%) 40 20 10ph 20ph 30ph 40ph 50ph 60ph Đồ thị 3.12: Biểu đồ biểu diễn độ bền nhiệt enzyme hòa tan enzyme cố định hai chất mang Alginate Chitosan SVTH: Nguyễn Quốc Đạt Trang 89 Đồ án tốt nghiệp GVHD: CN.Đỗ Thị Tuyến Nhận xét: Qua biểu đồ ta nhận thấy, enzyme cố định có độ bền nhiệt cao so với enzyme hòa tan, thời gian 50 – 60 phút độ bền nhiệt enzyme hòa tan giảm mạnh 17.54 – 12.38 %, với enzyme cố định từ 18.22 – 15.28% (trên Alginate) 20.9 – 16.7% (trên Chitosan) Đó ưu điểm enzyme cố định, chúng bao bọc lớp gel nhờ mà enzyme cố định bền nhiệt so với enzyme hòa tan Qua ta nhận thấy, enzyme cố định chitosan có độ bền nhiệt cao so với alginate Đặc điểm enzyme cố định phụ thuộc vào chất mang, với đặc điểm hóa lý chitosan giúp cho enzyme cố định chất mang bền với nhiệt độ Do vậy, dựa mục đích sử dụng enzyme cố định mà ta chọn chất mang phù hợp 3.7.2.4 Tìm hiểu số lần tái sử dụng enzyme cố định Sau cố định enzyme GA gel Natrialginate Chitosan tiến hành xác định hoạt tính Rửa hạt gel qua nhiều lần CaCl2 0,02M (cố định gel Alginate) nước cất (cố định gel chitosan) với thể tích nhằm xác định độ bền gel Thu kết theo bảng sau: Bảng 3.19: Khảo sát số lần tái sử dụng enzyme cố định gel Alginate Số lần tái sử dụng L1 Hàm lượng Hoạt tính enzyme cố định enzyme cố định Alginate (mg) Alginate (U) 10.10 254.922 Hiệu suất protein tái sử dụng (%) 100 Hiệu suất hoạt tính tái sử dung (%) 100 L2 9.34 209.892 92.47 82.34 L3 6.98 180.561 69.11 70.83 L4 6.10 160.765 60.39 63.06 L5 3.80 130.235 37.62 51.09 L6 3.09 102.437 30.59 40.18 SVTH: Nguyễn Quốc Đạt Trang 90 Đồ án tốt nghiệp GVHD: CN.Đỗ Thị Tuyến Bảng 3.20: Khảo sát số lần tái sử dụng enzyme cố dịnh Chitosan Số lần tái sử dụng Hàm lượng protein (mg) Hoạt tính enzyme cố định (U) Hiệu suất protein tái sử dụng (%) Hiệu suất hoạt tính tái sử dung (%) L1 10.55 205.541 100 100 L2 9.90 120.78 1.01 93.80 L3 119.11 86.35 L4 113.16 29.95 L5 110.71 6.73 So Sánh HS tái sử dụng enzyme Cố định 120 100 % 80 Hiệu suất hoạt tính tái sử dung (%) Alginate 60 Hiệu suất hoạt tính tái sử dung (%) Chitosan 40 20 L1 L2 L3 L4 L5 L6 Đồ thị 3.13: Biểu đồ biểu diễn số lần tái sử dụng enzyme cố định Nhận xét: Qua kết thực nghiệm, chúng tơi nhận thấy hoạt tính hàm lượng enzyme giảm dần qua số lần tái sử dụng, điều xảy enzyme thoát khỏi gel sau lần tái sử dụng bị rửa trơi Qua q trình khảo sát số lần tái sử dụng biểu đồ từ thực nghiệm ta nhận thấy enzyme cố định Alginate có hiệu suất tái sử dụng cao Đến lần thứ hiệu suất hoạt tính đạt 40.38%, enzyme cố định chitosan tái sử dụng SVTH: Nguyễn Quốc Đạt Trang 91 Đồ án tốt nghiệp GVHD: CN.Đỗ Thị Tuyến tới lần thứ hiệu suất hoạt tính đạt lần tái sử dụng thứ 6.73% Vì mà ta kết luận gel Alginate thích hợp để cố định enzyme GA sử dụng cho nhiều lần với quy mô công nghiệp SVTH: Nguyễn Quốc Đạt Trang 92 Đồ án tốt nghiệp GVHD: CN.Đỗ Thị Tuyến CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận  Thu nhận trích ly enzyme từ mơi trường ni cấy bán rắn: sau 48h nuôi cấy ta tiến hành trích ly thu nhận enzyme nước cất, với tỷ lệ nước cất : canh trường : 3, thời gian trích ly 40 phút  Tinh enzyme cách tủa cồn 960 lạnh, thu enzyme có hoạt tính 703.98 UI/ml  Tinh enzyme sắc ký lọc gel thu hiệu suất tinh 75.2%  Kết phân tích hệ enzyme GA điện di SDS – Page thu trọng lượng phân tử enzyme GA từ nấm mốc Asp.kawasaki môi trường lên men bán rắn khoảng 14.505KDa – 105.394KDa  Enzyme phản ứng điều kiện tối ưu: khoảng pH6, nhiệt độ 500C, thời gian phản ứng 10 phút  Cố định enzyme gel Alginate Chitosan với hiệu suất hoạt tính cố định 81.22%(Alginate) 67.67%(Chitosan)  Điều kiện hoạt động tối ưu enzyme cố định: pH 4, nhiệt độ 600C độ bền nhiệt 10 phút hoạt tính thu cao  Số lần tái sử dụng enzyme alginate lần lần Chitosan 4.2 Đề nghị Nếu có đầy đủ thiết bị tơi xin có vài đề nghị sau:  Tiến hành tủa dịch enzyme số hóa chất khác muối, aceton để so sánh kết  So sánh hoạt tính enzyme tự tổng hợp với enzyme mốt số hãng sản xuất khác  Tiến hành sản xuất enzyme dạng bột  Cố định enzyme chất mang thích hợp để tái sử dụng nhiều lần qui mô sản xuất công nghiệp  Sử dụng enzyme thu tiến hành sản xuất glucose quy mô nhỏ SVTH: Nguyễn Quốc Đạt Trang 93 ... định pectinase thu thập từ chủng nấm mốc, Nguyễn Quyết (2004) nghiên cứu cố định α – amylase thu nhận từ vi khuẩn Bacillus subtilis… 1.10.7.2 Tình hình nghiên cứu nước ngồi Nghiên cứu enzyme cố định... giới hạn  Hệ enzyme có nước bọt, dịch tiêu hóa người, động vật hạt nảy mầm, nấm mốc, nấm men vi khuẩn  Hiện nay, amylase thu chủ yếu từ canh trường vi khuẩn, nấm mốc số loài nấm men SVTH: Nguyễn... Tuyến Hình 1.1 :Sự thủy phân tinh bột enzym amylase 1.2.4 Vi sinh vật tổng hợp amylase Nhóm enzyme amylase, đa phần tổng hợp nấm mốc vi khuẩn, số từ nấm men  Từ nấm mốc : Asp oryzae, Asp niger,