ỦY BAN NHÂN DÂN THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁN CÔNG TÔN ĐỨC THẮNG
THU NHẬN VÀ TINH SẠCH ENZYME CELLULASE TỪ NẤM MỐC ASPERGILLUSE NIGER, MUCOR
TREN MOI TRUONG LEN MEN BAN RAN LUAN VAN TOT NGHIEP DAI HOC
Nganh : Công nghệ hóa học
Chuyên ngành : Tổng Hợp Hữu Cơ Bằng Phương Pháp Sinh Học Mã số ngành : 23.00 Người hướng dẫn: PGS.TS NGUYỄN TIẾN THẮNG CN ĐỒ THỊ TUYẾN
Sinh viên thực hiện: LÊ QUỐC NAM
Trang 2TRƯỜNG ĐẠI HỌC BC TON DUC THANG
KHOA KHOA HOC UNG UNG
CONG HOA XA HOI CHU NGHIA VIET NAM
Doc lap — Tu do — Hanh phtic
NHIEM VU LUAN VAN TOT NGHIEP
Tp Hồ Chí Minh, ngày2#thángZnăm 22êzZ
Họ và tên: LÊ Quốc Nam MSSV: 510967H
Bộ môn: THHC bing phương pháp sinh học Lớp: OSHIN Ngành : Công Nghệ Hoá Học Năm học : 2002 — 2006
1 Tên dé tai: Thu nhdn va tinh sach enzyme cellulase tit ndm mde Aspers Niger, Mucor trên môi trường lên men bán rắn
2 Nhiệm vụ: Tiia ensyme bằng côn và muối vô cơ trung tính ,xác định hoạt
tính, hàm lượng protein và tỉnh sạch enzyme cellulase từ hai chúng nấm móc
Aspergillus Niger va Mucor bang phương pháp sắc ký lọc gel và chạy diện di bằng phương pháp SDS - PAGE
3 Ngày giao nhiệm vụ luận án: 05/09/2006 4 Ngày hoàn thành nhiệm vụ: 05/01/2007
5 Họ tên người hướng dẫn: Phần hướng dẫn:
1/PGS.TS Nguyễn Tiến Thắng Tủa enzyme bằng côn và muối ung tính 2/CN Đỗ Thị Tuyến Xác định hoạt tính, hàm lượng protein tỉnh sạch phương pháp sắc ký lọc gel chạy điện di bằng phương pháp SDS - PAGE Nội dung và yêu cầu luận án đã được thông qua bộ môn Ngàyz¿tháng¿hăm.(277- Ngà v96tháng8(năm+2892“
CHỦ NHIỆM BỘ MÔN NGƯỜI HƯỚNG DÁN CHÍNH
(Ký và ghi rõ họ tên) (Ký và ghi rõ họ tên)
oe pee i
~ We
let Pre
` Ah ci hl Bonygery
PHAN GHI KET QUA LVTN
TRUGNG KHOA KHUD Ngày báo vệ: #/29/-207-
(Ký và ghi rõ họ tên) Điểm tổng kết ket
ng ih Noi luw wit LVTN: r2 + 2m12)
Trang 3
LOI CAM ON
Trong quá trình học tập và nghiên cứu thực hiện luận văn tốt nghiệp kỹ sư
này, ngoài sự nỗ lực của bản thân, em đã được sự hỗ trợ rất lớn của tập thể Thây,
Cô, Gia Đình, bạn bè
Em chân thành cảm ơn quý Thầy, Cô bộ mơn sinh hố ở Viện Sinh Học Nhiệt Đới đã giúp đỡ, chỉ dẫn và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho em trong quá trình
làm luận văn
Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến thầy Nguyễn Tiến Thắng và cô Đỗ Thị Tuyến đã tận tình hướng dẫn và tạo điều kiện thuận lợi cho em trong suốt
quá trình làm luận văn này Tất cả thầy, cô khoa Công Nghệ Sinh Học - Đại Học
Bán Công Tôn Đức Thắng TP Hồ Chí Minh đã dạy dỗ em trong suốt những năm
học dưới mái trường này
Em trân trọng gởi lời cảm ơn Cha Me, Anh Chị đã lo lắng, giúp đỡ, động viên, tạo mọi điều kiện vật chất và tinh thần giúp em vượt qua những khó khăn trong quá trình học tập và làm luận văn
Trân trọng !
Tháng 12 năm 2006
Trang 4
TOM TAT KHOA LUAN
Lê Quốc Nam, Đại Học BC Tôn Đức Thắng
“THU NHAN VA TINH SACH ENZYME CELLULASE TU NAM MOC ASPERGILLUSE NIGER, MUCOR TREN MOI TRUONG LEN MEN BAN RAN” Đề tài được thực hiện từ tháng 09/2006 đến tháng 01/2007 tại Viện Sinh Học Nhiệt Đới Tp.HCM Hội đồng hướng dẫn: PGS -TS NGUYEN TIEN THANG CN DO THI TUYEN
Chế phẩm enzyme thô được nuôi cấy ở nhiệt độ phòng, tỉ lệ 4 trấu: 6 cám
mì, độ ẩm 55%, pH5 Canh trường nuôi cấy Asp.Niger và Mucor được sấy khô ở
40C, xay nhỏ Sản phẩm gọi là chế phẩm enzyme thô Lấy chế phẩm enzyme thô
thêm nước cất, đem khuấy trên máy khuấy, các dịch lọc đem ly tâm thu địch chiết
thô Dịch chiếc enzyme thô này được tủa với muối (NH,);SO¿ ở các nồng độ: 50,
55, 60, 65,70, 75 và cồn 96? ở các tỷ lệ 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6 Cặn tủa thu được
hoà tan vào dung dịch đệm và xác định hoạt tính enzyme và khối lượng protein
nhằm tìm ra nồng độ muối và tỷ lệ cồn tốt nhất cho việc tủa enzyme Cuối cùng
tinh sạch enzyme có hoạt tính cao nhất được chạy qua sắc ký lọc gel và xác định
trọng lượng phân tử protein bằng phương pháp điện di Kết quả thu được như sau: Ở cả hai chủng nông độ muối 70% độ bão hoà và tỉ lệ cồn tối ưu là 1:4
Enzyme của hai chủng hoạt động tốt nhất ở pH 5 và nhiệt độ 40°C
e Vé hoat tinh: CMCase Aps.Niger > Mucor spp
e Vé ham lugng protein: Aps.Niger > Mucor spp
Trang 6
PHAN I TONG QUAN TAI LIEU
1.1 Khái quát chung YỀ enzyme eecssssseessessesssessssssssessessssssessesssssssssesssssssssseseess 1
1.1.1Sơ lược về lịch sử enzye - ¿+ 5z Sẻ z2x2321212111211E22E xe rrek I 1.1.2Tinh chat uu vit cla EnZyMe o ccceccceccsescsessesesceeevsesecseseeevsveeaeees 1
1.1.3Nguồn nguyên liệu để thu nhận enzyme . 5-©scxcrev 2
1.1.4Công nghệ sản xuất enzyme từ vi sinh vật s-s-s-s+s 3
1.2 Giới thiệu về enzyme Cellaase .- «s2 5° £ s2 +xeSexeexsevxe 3 |2 TJJHH1P HE và sac, cx2psvycszvitorruybsrogVagrritagbvEslsi235399291573589182002x011012580x55 3
D22 PHI ĐAU c7 n0 can 4
1.2.3 Cấu tạo của CellulaSe -¿- + +xxeEEtkEEEkEEEEEEEEEEEEEEEEEkrrerrey 4 0n Ố.Ố 6 0i 015inafortilniai Sẽ 7c cố 6 1:2:4.2 Đặc tính Vật Lý và hOá LỖ cii-cccecnocnn ho hd nh 1D H2 110 0x6666xes 6 2021161613191 ST ẽ cố 6 102:4-1:G0ICH©TEICLIOHD ee ne ED ai 6 1.3 Vi sinh tong hop Cellulase ssssssssssssssessssseesssssessssssesssssessssssesssssessssssssssssseesees 6 1.3.1 Giới thiệu chung về nhóm vi sinh vật tổng hợp Cellulase @
LBs 121 KHHẾT manssussunginoaretgiltobtuirg00iSuEigi8uigilicttbrooscl228i06801g361 7
U00 8n n6 6 -kd.H.Ả 7 1.3.1.3 Niễn khuẩn 1200515010101 021611001 01001 01000014018160181 7
1.3.1.4 Nấm sợi -c-c tk tv HS SE TS E11 11111111111111121111111 1xx E1 see 7
1.3.2 Nghiên cứu về nấm sợi Aspergilluse Niger -se¿ § 1.3.3 Nghiên cứu về nấm sợi Mu€OT - ¿- ¿+ 2k x‡x+kerxerrkeree 10 1.4 Nuôi cấy enzyme tổng hợp Cellulase - se sec ©csscces 12
1.4.1 Sinh tổng hợp enzyme cẩm ứng . ¿- 2 5¿+ce+cxe+cxezrszcsez 12 1.4.2 Anh hưởng của các yếu tố dinh dưỡng đối với quá trình sinh tổng
Trang 7
TAO MON SUG by Ca Cb Oiyec.ce tafe er ecto vscrenrasteetenetter es eectesea gate sneneeen essen 13 1.42 DiNSUGnINIG AaB ce ioe Braschi 13
4.0.8 IN SuGnitG IkhOdn gence eenernre een en ttn nrensvanss 14 1:4.2.4 Nhiệbđômu61cấy ii boaai.lnlBgg9Wplt4 ai Xeaeaalsi 6l 14 IE:555111511nrifsbiiEriar in ẽ 14 1.5 Phương pháp lên men bán rắn và thu nhận enzyme Cellulase từ nấm sợi Aspergilluse:Nigerivä: MUEOT cá 111146116xsx6x31s645660656061sesg0.sessoscSEsskeEndasssbcnair 14 1.6 Tách và làm sạch chế phẩm enzyIme . -s- «+ ssssx+ezxsessse 15 1.7 Phương pháp tách phân đoạn bằng sắc ký -‹« c«-c«ecse 17 1.8 Phương pháp lọc gel (Gel fÏltratÏOH)) .-.-«-es<c<csesssessssssesesssesessee 20 1.9 Phân tích hỗn hợp Enzym bằng phương pháp dién di mini- Gel SDS
2.1 Vật liệu
2.1.1 Chế phẩm enzyme Cellulase -¿- ¿5+ 5x+ssvzx+xvzvzvsrzvsvrrve 24
2.1.2 Hoá chất và thiết bị - 2c 5 56122121211 250116163610101 1611.156 24
2.2 Phương pháp lên men bán rắn để thu nhận enzyme cellulase 24 2.2.1 Nuối cấy nấm sợi Asp Niper và MUGDT c ceeenieiirersee 25 2.2.2 Thu nhận chế phẩm enzyme Ccllulase thô . . .-++ 28 AST a BAN O1CON ecu im ẽs 5 5 .= 28
B: Tủa bằng muối (NH¿)zŠO¿, c1 1012661221606 xeesE.E02/88258EyxE6 29
2.2.3 Xác định hàm lượng protein theo phương pháp Bradford 29
Ø:213,1:NGUYỆHLÃ Di nxoriifaBienlEsiccEEicnx so tears eigenen 29
2.:9;2: ]HWG HÀ HỦ¿ssxiiz2y522i06sssiEngsEngE61953535859551:4dk8S355485686335909356Đ3E6203 8021586 29
Ä: Hoá:chất vĩ THIẾT BÍ sxsssssisxststce tEEEIDIEEELSSHDESEOEONBEAVE1S11L244310131482393- 38 29
Trang 8Tinh Ket qua: bea Seth Se BSN Acs ĐỊT NT, 4 LÁ Ân cay pro 30
2.2.4 Phương pháp xác định hoạt tính enzyme Cellulase nấm sdi Asp bchiiiss ST Sẽ 31 2.2.4.1 Phuong pháp xác định hoạt tính enzyme Carboxymethyl Cellulase
niấim:s0i:AspiNiper:và:Mueefr:tiin,titabsia ba sen sử An 31
2.2.4.2 Khảo sát ảnh hưởng của pH đến hoạt tính của enzyme CMCase ñấm;S0i:AsbiiNiiepVä TNMHGGF:AIHEĐ ion san ti 118012826 seeee 35 2.2.4.3 2 Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính của enzyme
CMCase nấm sợi Asp Niger và Mucor c-csc5ccc: 35
2.2.5 Bước đầu tỉnh sạch enzyme CMCase nấm sợi Asp Niger và Mucor bằng sắc kỷ Iqe:pelit,A.16,E1SiLsã lãng bã ng J4 asetsan 35
2.2.5.1 Bản chất của phương pháp . . -sc5sccsccsrsrrsreee 35 2.2.:5 DN uy enitd cass den univ Aad GN UG oe aie ee ee 36
2.2.5.3 Chuẩn bị hoá chất và HH G17 s2 ng v5 n3 ee ee ee 37
2.2.5.4 Các bước tiến hành . -¿- c2 xEEEEkeEeErkekerkrkerrrrree 38
2.2.6 Phân tách enzyme Cellulase nấm sợi Asp Niger và Mucor bằng
điện:dit6T›;øel:Polygaerylamidesegl:-esbsiDisuepadshliditeÐlkessas 40
287/16118M†241001510102.1u.3/89900 8 net-otdiiifpiittrrp/ 08010166 se afioigareplie 40
2.2.6.2 Vật liệu và phương pháp +-¿cc+ScScxceScxcxexeecereecrcrs 41
VÀ 2V 4P LÍC PL co 2 s1 vs iteritndnti92Actosr21f0055 25a 8951x581 cvsvsDeeiEoerdnsffrteiaee SE ie 41
Trang 9
PHAN III: KET QUA VA BIEN LUAN
3.1 Chiết xuất thô enzyme Cellulase, tủa protein từ nấm sợi Asp, Niger và
MUG ON ss scsssscsvsvesssvensesaesatenacabattincd cemtnacescseustes tas csesEgsssnessacksssss4iLssg11516458.80Asessseeoi 46 3.1.1 Chiết xuất tho enzyme Cellulase, tit ndm soi Asp Niger va Mucor va
tia protein trong:cOm lạnh1i:.; cu ĐÁ cá se sog 46 3.1.2.1 Chiết xuất tho enzyme Cellulase va tia protein từ nấm sợi Asp Niger
và Mucor bAñbmmuối,CNHI) So can ben BskiSkceoEinEAavseee 50 3.1.3 So sánh việc tủa enzyme trong cén lanh va tia enzyme bằng muối
(NH,)zSO¿ từ nấm sợi Asp Niger và MUCOr ¿ccccsStcEctzrcrcez 53 3.2 Xác định pH và nhiệt độ tối ưu cho hoạt động của enzyme CMCase 55
3.2.1 pH tối ưu từ nấm sợi Asp Niger và Mue€or :+scccsczsccscz 55
3.2.2 Nhiệt độ tối ưu từ nấm sợi Asp Niger và Mucor : 56
3.3 Tỉnh sạch enzyme CMCase từ nấm sợi Asp Niger và Mucor 57
3.3.1 Tác nhân tủa là cồn lạnh từ nấm sợi Asp Niger và Mucor 57
3.3.1.1 Xác định tổng hoạt tính CMCase (UI) và tổng hàm lượng protein (mg)
trong dịch chiết enzyme thô từ nấm sợi Asp Niger và Mucor S7
3.3.1.2 Tủa enzyme trong cồn và xác định tổng hoạt tính CMCase và tổng hàm lượng protein (mg) trong sản phẩm nấm sợi Asp Niger và Mucor 3.3.1.3 Tinh sach enzyme CMCase trén Sephadex G100 từ nấm sợi Asp
INT Enya MUCOT csc cer tor carn -asanv oe nets re rere hk epee essere 58
3.3.2 Tác nhân tủa là muối (NH„);SO¿ 70% từ nấm sợi Asp Niger và Mucor63
3.3.2.1 Xác định tổng hoạt tính CMCase (UI) và tổng hàm lượng protein (mg)
trong dịch chiết enzyme thô từ nấm sợi Asp Niger và Mucor 63
3.3.2.2 Tủa enzyme bằng (NH¿);SO¿ và loại muối trên gel Sephadex G2563 3.32.3 Tinh sach enzyme CMC trén Sephadex G100 nấm sợi Asp Niger va
j/1@5v TS ố.ốố.ốẽốố.ẽẽẽ 63
3.4 Kết quả phân tách hệ enzyme Cellulase từ nấm sợi Asp Niger và Mueor bằng phương pháp điện đi trên gel SDS ~ PAGE -.sscecsssz 67
Trang 11DANH MỤC CÁC HÌNH VÀ ĐỒ THỊ
Hình Nội Dung Trang
1.1 Cấu trúc không gian ba chiều của enzym cellulase 6
1,2 Đại thể của nấm Aps.Niger 10
13 Vi thể của nấm Aps Niger 10
1.4 Đại thể của nấm Mucor 12
5 Vi thể của nấm Mucor 12
1.6 Nguyên tắc phân tách trong quá trình tỉnh sạch bằng sắc ký 18
ey Qua trinh loc gel 19
1.8 | Sắc ký đồ điển hình của quá trình phân tách nhóm ( Sắc ký loại| 19
muối)
2.1 Aps.Niger trên môi trường PGA 26 2.2 Mucor trên môi trường PGA 26 2.3 Nấm sợi Mucor và Aps.Niger trên môi trường cám trấu Zi 2.4 Hệ thống sắc ký cột áp suất thấp, hãng Bio - Rad, Mỹ 37 Sai Điện di ctia Asp Niger va Mucor 67
Đề thị Nội Dung Trang
8-1 Téng hoat tinh CMCase (UD) và tổng hàm lượng protein (mg) 47 thu được sau khi tủa ở các tỷ lệ khác nhau (Aps.Niger)
3.2 | Tổng hoạt tính CMCase (UI) và tổng hàm lượng protein (mg)|_ 49
thu được sau khi tủa ở các tỷ lệ khác nhau (Mucor)
3.3 Tổng hoạt tính CMCase (UI) và tổng hàm lượng protein (mg)|_ 51
thu được sau khi tửa muối (NH,);SO, ở các tỷ lệ khác nhau
(Asp.Niger)
3.4 | Tống hoạt tính CMCase (UI) và tổng hàm lượng protein (mg) | 52 thu được sau khi tỉa muối (NH¿);SO; ở các tỷ lệ khác nhau
(Mucor)
a5 Biểu diễn ảnh hưởng của pH 55
3.6 Biểu diễn ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính CMCase 56 tủa bằng muối
3.7 | Sắc ký đổ lọc gel G-100 của nấm sợi Niger 59 3.8 | Sắc ký đồ lọc gel G-100 của nấm sợi Mucor 60
3.9 | Sắc ký đồ lọc gel G-100 của nấm sợi Niger 64
3.10 | Sắc ký đồ lọc gel G-100 của nấm sợi Mucor 65
3.11 | Điểm biểu diễn sự tương quan giữa giá trị Rf và LogioM của | 68 những protein trong thang chuẩn
Trang 12
3.16 | Tổng hoạt tính CMCase (UI) và tổng hàm lượng protein (mg) 63 trong 700 ml dịch chiết enzym thô.(Aps.Niger)
3.17 | Tổng hoạt tính CMCase (UI) và tổng hàm lượng protein (mg) 63
trong 700 ml dich enzym thô (Mucor spp)
3.18 | Kết quả tinh sạch enzym CMCase khi tủa enzym bằng muối 65
(Niger)
3.19 | Kết quả tỉnh sạch enzym CMCase khi tủa enzym bằng (muối 66
Mucor)
3.20 Giá trị Rf và LogioM của thang protein chuẩn 68 3.21 | Trọng lượng phân tử của các protein có trong dịch chiết thô 69
từ Aspergillus Niger
3.22 | Trọng lượng phân tử của các protein có trong dịch chiết thô 69
từ Mucor
3.23 | Trọng lượng phân tử của các protein có trong dịch tủa bằng 69 mudi peak | tiv Aspergillus Niger
3.24 | Trọng lượng phân tử của các protein có trong dịch tủa bằng 69
muối peak 2 tiv Aspergillus Niger
3.25 | Trọng lượng phân tử của các protein có trong dịch tủa bằng 70
muối peak 3 từ Aspergillus Niger
3.26 | Trọng lượng phân tử của các protein có trong dịch tủa bằng 70 muối peak | tit Mucor
3.27 | Trọng lượng phân tử của các protein có trong dịch tủa bằng muối peak 2 từ Mucor 70
Trang 14
1.1 ĐẶT VẤN ĐỀ
Khoa học kỹ thuật ngày càng phát triển cho nên các ngành khoa học ứng dụng ngày càng được ứng dụng vào thực tế, từ đó giúp cho cuộc sống con người ngầy càng được nâng cao và hoàn thiện
Đặc biệt là các ngành khoa học tự nhiên, ngành đã cố nhiều ứng dụng vào thực
tế và đáp ứng được nhu cầu ngày càng cao của con người Trong đó, ngành công nghệ
sinh học là có nhiều ứng dụng và nghiên cứu rất triển vọng Trong đó, lĩnh vực sản xuất và nghiên cứu về enzyme là đặc biệt phát triển, là mục tiêu nghiên cứu của
nhiều để tài mang tính ứng dụng cao và khoa học
Enzyme có bản chất là protein, nó có khả năng xúc tác sinh học không những
bên trong cơ thể mà còn có thể thực hiện bên ngoài cơ thể khi tạo cho chúng điều kiện thích hợp để hoạt động
Nhân tố quan trọng để thúc đẩy ngành công nghiệp enzyme phát triển là khả
năng to lớn của vi sinh vật Các vi sinh vật có tốc độ phát triển cực kỳ nhanh, do đó có khả năng đáp ứng được mọi nhu cầu của con người, đồng thời enzyme do chúng tạo ra có hoạt lực cao Bên cạnh đó, môi trường nuôi cấy vi sinh vật chúng ta có thể
tận dụng các phế thải của các ngành khác
Cellulase là một trong những nhóm enzyme có nhiều ứng dụng quan trọng và
phổ biến trong đời sống Bên cạnh đó, cellulase cũng được ứng dụng rộng rãi trong
các ngành và lĩnh vực khác nhau như công nghiệp, nông nghiệp, y học hoạt tính
chung của enzyme nói chung đều chịu ảnh hưởng của nhiều yếu tố Do đó để thu
nhận enzyme hiệu quả nhất cần khảo sát điều kiện kết tủa tối ưu của enzyme đó
Nhằm mục đích khảo sát hoạt tính và tìm hiểu về kỹ thuật sắc ký lọc gel dùng trong
tỉnh sạch enzyme.Vấn đề đặt ra trong để tài này là: Thu nhận và tỉnh sạch enzyme
Trang 15
1.2 MUC DICH NGHIEN CUU
Xác định điều kiện thu nhận và đặc tính ctia enzyme cellulase ti hai ching ném mốc Áspergilluse Niger, Mucor
So sánh hiệu quả giữa việc tủa enzyme bằng cổn và muối trung tính
So sánh hoạt tính enzyme cellulase giữa hai chủng nấm mốc Aspergilluse Niger,
Mucor
1.3 YEU CAU
Thu nhan enzyme, xdc dinh néng d6 mudi (NH4)2SO, bao hoa va ty 1é cén téi
ưu trong việc tủa enzyme — bước đầu trong quá trình tỉnh sạch enzyme Xác định pH và nhiệt độ tối ưu cho hoạt động của enzyme cellulase
Tinh sach enzyme bing sic ky loc gel
Trang 16
PHAN I TONG QUAN
Trang 17
LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP GVHD:PGS-TS.NGUYỄN TIẾN THANG
PHẦN I:TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1 Khái quát chung về enzym
Enzym là những chất có bản chất protein có vai trò cực kỳ quan trọng
trong việc tham gia xúc tác các phần ứng sinh hoá, chiếm tới 80-90% thành phan protein trong tế bào sinh vật Vì có nguồn gốc từ sinh vật nên enzym còn được
gọi là chất xúc tác sinh học nhằm phân biệt với các chất xúc tác hoá học khác 1.1.1 Sơ lược về lịch sử enzym
e Nam 1883 Payen và Persoz đã phân lập được một chất có trong lúa nẩy mâm có khả năng phá vỡ cấu trúc tỉnh bột tạo thành đường và đã đặt tên là Diastase, hién nay dude goi la Amylase
e_ Năm 1867 Wilhelm Kuhne là một nhà vật lý học người Đức lần đầu tiên để
nghị đặt tên “Enzym” thay thế cho từ “ Ferments”, Enzyme có nghĩa là
“ inyeast” trong tiếng Hy Lạp
e Nam 1897 Edward Buchner là nhà hoá học người Đức đã khám phá ra những tế bào tự do của cao nấm men có khả năng lên men rượu
se Năm 1906 Otto Rohm là người đầu tiên nghiên cứu về việc sử dụng những
sản phẩm enzym vào trong công nghiệp, ông đã dùng mô tuyến tụy để thu
nhận trypsin sử dụng trong công nghiệp thuộc da
se Năm 1926 James B Summer nhà sinh học của Mỹ đã thành công trong việc
tách chiết và kết tỉnh urease dạng tinh thể từ cao một loại đậu có tên là Jack- bean
Năm 1930 John H Northop là nhà Sinh hoá học người Mỹ đã thành công trong việc tách chiết và tạo ra tỉnh thể pepsin và trypsin
1.1.2 Tính chất ưu việt của enzyme
e Enzym hoạt động xúc tác trong điểu kiện “nhẹ nhàng”: Nhiệt độ từ 30 —
45°C, với áp suất thông thường, pH thường là axit yếu hay trung tính
Trang 18
LUAN VAN TOT NGHIEP = GVHD:PGS-TS NGUYEN TIEN THANG
e Enzym có tính đặt hiệu cao trên những cơ chất nhất định và xúc tác theo một
kiểu phản ứng nhất định
s Vận tốc phẩn ứng do enzym xúc tác có thể kiểm soát dễ dàng bằng các yếu
tố như: nhiệt độ, pH, các chất kìm hãm, chất hoạt hoá
e Enzym thường có cường lực xúc tác rất cao nên chỉ cần một lượng nhỏ
enzym có thể chuyển hoá một lượng lớn cơ chất, trong khoảng thời gian ngắn
1.1.3 Nguồn nguyên liệu để thu nhận enzym
Nguyên liệu để thu nhận enzym thường là tế bào thực vật, mô động vật và vi
sinh vật Từ tuyến tụy và màng nhây dạ dày động vật có thể thu nhận các chế phẩm
enzym như: Amylase, Lipase, Proteinase, Ribonuclease, đặc biệt là các enzym như:
Pepsin, Trypsin, Chimotrypsin Một số enzym được thu nhận từ thực vật như: Papain từ nhựa thân và quả đu đủ (Cacica papaya) Bromelin từ trái dứa hoặc Ficin từ các
cây quả sung họ Ficus
Việc sản xuất enzym từ vi sinh vật có những ưu điểm như sau:
1 2:
Vi sinh vật có chu kỳ sinh trưởng và phát triển rất ngắn Hệ enzym của vi sinh vật vô cùng phong phú
Chủng vi sinh vật có khả năng tổng hợp ra các loại enzym theo ý
muốn được thực hiện một cách dễ dàng trong một thời gian ngắn
Vi sinh vật có tốc độ sinh sản cực nhanh
Vi sinh vật không đòi hỏi nghiêm ngặt về môi trường dinh dưỡng Sản xuất enzym từ vi sinh vật hoàn toàn có thể thực hiện theo quy mô
công nghiệp
Tóm lại vi sinh vật là sinh vật vô cùng nhỏ bé nhưng về phương diện khai
thác enzym nó vượt xa động vật và thực vật Hiện nay người ta sản xuất được hàng
trăm loại enzym khác nhau bằng phương pháp tổng hợp nhờ vi sinh vật
Trang 19
LUAN VAN TOT NGHIEP GVHD:PGS-TS NGUYEN TIEN THANG
1.1.4 Công nghệ sản xuất enzym ti vi sinh vật
Các quá trình sử dụng vi sinh vật trong sẩn xuất rượu, sản xuất Phomat, sản
xuất Bia đã được phát triển từ lâu trong tiến trình phát triển loài người Các loại enzym sau đây được sản xuất với số lượng lớn và thương mại:
1 Các loại enzym sử dụng trong công nghiệp như Amylase, Protease, Catalase, Isomerase, penicilinase
2 Các loại enzym sử dụng trong phân tích như: Glucooxidase, Alcoholdehydrogenase, Cholesterol oxidase
3 Các enzym sử dụng trong dược phẩm như: Aspareginase,
Protesae, Lipase, Streptokinase
Những điều kiện cần chú ý khi quyết định xây dựng hoặc nâng cao
năng suất của công nghiệp enzym như sau:
1 Giống vi sinh vật
2 Tối ưu hoá quá trình lên men
3 Ấp dụng những tiến bộ của công nghệ tạo máy để tạo ra những
thiết bị lên men hiện đại
4 Ap dụng công nghệ cố định enzym để sử dụng lặp lại được
nhiều lần
5 Ấp dụng các biện pháp thu nhận và tinh chế enzym hợp lý
Cellulase là enzym có nhiều ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp và trong
cả đời sống
1.2 Giới thiệu về enzyme Cellulase
1.2.1 Định nghĩa
Cellulase là hệ enzym xúc tác cho quá trình chuyển hoá Cellulase thành sản
phẩm hoà tan Phức hệ enzym Cellulase là enzym khá phức tạp Một mặt chúng như một enzym cẩm ứng ( mà ở đây Cellulase lại là chất cảm ứng không chặt chẽ), một
Trang 20
LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP GVHD:PGS-TS.NGUYỄN TIẾN THẮNG
mặt chúng lại chịu tác động bởi cơ chế điều khiển bởi sản phẩm cuối và chịu kiểm soát bởi cơ chế kiểm chế di hoá
Cellulase là một loại homopolime của B-D-glucose Các góc 8-D-glucose
được nối với nhau qua liên kết B-D-1,4-glucan Hệ thống enzym thuỷ phân Cellulase
bao gồm ít nhất 3 enzym khác nhau: Endoglucanase (1,4-B-D-glucan-4- glucanohydrolase, EC.3.2.1.4), Exoglucanase (1,4- 8-D glucan- Cellobiohydrolase,
EC3.2.1.91) va B-glucosidase (B-D-glucosid glucohydrolase, EC3.2.1.21 ) Cac enzym này có tính đặc hiệu khác nhau và hoạt động hỗ trợ cho nhau Đầu tiên, Exoglucanase phá vỡ liên két 1,4- 8-D-glucosid trong phan tit Cellulose, sau đó Endoglucanase tiếp tục thuỷ phân Cellulose thành phân tử Cellobiose và sau cùng B-glucosidase phân cắt Cellulobiose thành glucose
1.2.2 Phân loại
Theo phân loại của Hội sinh học phân tử và sinh học quốc tế (IUBMB- International Union of Biochemistry and Molecular Biology ) hệ thống thuỷ phân
Cellulose gồm có enzym: Endoglucanase có kí hiệu EC 3.2.1.4, Exoglucanase có kí
hiệu EC3.2.1.91 và Í3-glucosidase có kí hiệu EC3.2.1.21
e Endoglucana- EC 3.2.1.4
Enzym này thường thuỷ phân các liên kết 1,4- B-D-glucosid trong Cellulose và các
8-D-glucan của ngũ cốc
e Exoglucanase EC3.2.1.91
Enzym này có tác dụng thuỷ phân các liên kết 1,4- B-D-glucosid trong Cellulose va
Cellotetraose giải phóng Cellobiose từ dầu không khử e }-glucosidase EC3.2.1.21
Enzym nay thuỷ phân các gốc B-D-glucosid M6t s6 truéng hgp cfing thuy phan §- D-galactosidase, 8-D-fucoside; B-D-Xyloside; a-L-Arabinoside
1.2.3 Cấu tạo của Cellulase
Trang 21
LUAN VAN TOT NGHIEP GVHD:PGS-TS.NGUYỄN TIẾN THẮNG
Cellulase có bản chất là protein được cấu tạo từ các đơn vị acid amin, các
acid amin này được nối với nhau bởi liên kết peptid-Co-NH-, tuy nhiên trong cấu
trúc có gắn những phần phụ khác Cấu trúc không gian Cellulase bao gồm một
trung tâm xúc tác và một đuôi không gian, phần đuôi này xuất phát từ trung tâm xúc
tác nhưng được gắn thêm đi vùng glycosil hố và cuối đuôi này là vùng gắn kết với Cellulose Vùng gắn kết với Cellulose có cấu tạo khác với liên kết thông
thường -CO-NH- của protein và việc thay đổi chiều dài của vùng glycosil hoá có ảnh hưởng đến hoạt tính xúc tác của enzym
Trọng lượng của enzym Cellulase thay đổi từ 30-110 Kdalt (Beguin, 1990 và cộng sự 1991) Cấu trúc không gian khoảng 280-600 aa nhưng chiều đài Cellulase
thường khoảng 300-450 aa ( Gillees và cộng sự 1992 ) và trung tâm xúc tác có khoảng 250 aa
Bằng cách bẽ gãy cdc lién két B-1,4 glucan, hé enzym Cellulase đã thuỷ
phân Cellulase thành sản phẩm cuối cùng là glucose Trong đó Exoglucanase là
enzym chính trong quá trình thuỷ phân Cellulase
Exoglucanase là một enzym chứa hai vùng xúc tác nối với một vùng gắn
Cellulose qua một vùng liên kết được glycosin hoá cao Exoglucanase gồm có chuỗi
gọi là chuỗi A và chuỗi B Cả 2 chuỗi đều có 434 gốc nhưng giữa chúng cũng có sự
khác nhau để phân biệt
Các xoắn B không song song tạo bể mặt chung với nhau và tạo nên một thể
tích lớn được bao bọc bên ngoài bởi các chuỗi ky nước và một phần nhỏ ưa nước
Hai bản xoắn không song song dựng chụm vào nhau mặt đối điện tạo một
kẹp B (B sanwich) Phần còn lại bao gồm các vòng ngắn được cố định bởi các cầu Disulfide và nối các sợi B với nhau và có bon xoắn d trong cấu trúc
Có 1 nguyên tử Ca?” ở cả hai chuỗi A và B của Cellulase và ở mỗi chuỗi nó
kết hợp với glu 295 và gu 325, một phần tử nước được gắn vào Ca?”
Trang 22
LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP GVHD:PGS-TS.NGUYỄN TIẾN THẮNG
Hình 1.1 : Cấu trúc không gian ba chiều của enzym cellulase
1,2.4 Tính chất
1.2.4.1 Tính đặc hiệu
Cellulase thuỷ phân các liên kết 1,4-B-D-glucosid trong Cellulose và các - D-glucan của ngũ cốc Người ta cho rằng đầu tiên Exoglucanase tác động trên các
đầu chuỗi mới tạo thành để sản xuất chủ yếu là Cellulobiose, B-glucosidase thuỷ phân các gốc B-D-glucose cuối cùng từ các đầu của phân tử Cellulose
1.2.4.2 Đặc tính vật lý và hoá học
Theo nghiên cứu, hầu hết các Cellulase có pH tối ưu, tính hoà tan và thành
phân acid amin giống nhau Độ bến nhiệt và tính đặc hiệu cơ chất có thể khác nhau
Bên cạnh hoạt tính Cellulase, các chế phẩm Cellulase thường chứa các hoạt động
khác của enzym và các hoạt động này có ảnh hưởng đến đặc tính của chế phẩm
-Nhiệt độ tối ưu: 40-50°C -pH tối ưu: Thường ở giữa 4-5
1.2.4.3 Các chất ức chế
Trang 23
LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP GVHD:PGS-TS.NGUYỄN TIẾN THẮNG
1.3.1 Giới thiệu chung về các nhóm vi sinh vật tổng hợp Cellulase
Cellulase có mặt trong các hạt của thực vật bậc cao, hạt lúa mạch, giun đất, sâu róm và ốc sên Tuy nhiên vi sinh vật là nguồn cung cấp Cellulase khá phong phú gồm các loại xạ khuẩn, vi khuẩn, nấm mốc Popov (1875) là người đầu tiên xác
nhận khả năng phân giải Cellulase của vi sinh vật ky khí G van Iterson (1903) phát hiện khả năng phân giải cellulose của các vi sinh vật hiếu khí
Trong quá trình phân giải các chất hữu cơ có chứa cellulose, nấm và vi
khuẩn tạo ra các sản phẩm và sinh khối của chúng, khí CO; hoặc CH, va cdc san phẩm phụ khác
1.3.1.1.Xạ khuẩn
Nhiều tác giả đã nghiên cứu về khả năng phân giải cellulose của xạ khuẩn
Štreptoiyces,Actinomyces Các ông cũng nhấn mạnh rằng trong cùng một loài hoạt
tính phân giải cellulose của các chủng khác nhau là khác nhau 1.3.1.2 Vi khuẩn
Vi khuẩn sinh ra chủ yếu Endoglucanase và 8-glucisudase gần như không tạo ra Exoglucanase
Người ta phân tích thấy rằng có đến 15-20 tỷ vi khuẩn/I cmỶ chất có
trong dạ cỏ ở động vật ăn có (1960-Gorbacheva)
Vi khuẩn hiếu khí: Cellulomonas Persica sp.noy va Cellulomonas iranensis sp Nov (Elberson, 2000)
Vi khuẩn ky khí: Clostridium thermcellum, Clostridium Cellulovorans (Murashima, 2002), Clostridium Cellulotiticus (Parsiegla, 1998)
1.3.1.3 Niên khuẩn (Myxobacterales) gồm các giống:
-Promyxobacterum Cytophaga Sporangium Sporocytophaga
1.3.1.4 Nấm sợi
Nhiều loại nấm sợi có khả năng sinh ra một lượng lớn Cellulase thuộc giống Alternaria, Trichoderma, Aspergillus, Pinicillium, Cladosporum Chúng được tách từ
Trang 24
LUAN VAN TOT NGHIEP GVHD:PGS-TS.NGUYỄN TIẾN THẮNG
đất xung quanh các vùng rễ cây, từ mẫu thực vật, từ than bùn và các nguồn tự nhiên
khác có quá trình phân huỷ Cellulose
1.3.2 Nấm sợi A niger [60], [68]
1.3.2.1 Vị trí phân loại và các đặc điểm sinh lý, sinh hoá và sinh thái Vị trí phân loại của Aps nøiger được xếp như sau [3]:
Lớp: DeuferoinyCes
BO: Moniliales
Ho: Moniliaceace
Giéng: Aspergillus Nhom: Aspergillus niger
Khuẩn lạc trên môi trường Czapek yeast extract agar (CYA) c6 dang léng nhung, khi còn non có màu trắng, khi già có màu đen, mặt trái của Petri thường có
màu vàng nhạt đến vàng sáng
Cuống sinh bào tử được sinh ra từ khuẩn ty khí sinh, có chiểu dài 1-3 mm, có
vách tế bào trơn bóng và trong suốt Đỉnh cuống phình ra có dạng hình cầu được gọi
là bọng, có đường kính từ 50-75 m, sinh ra 2 lớp thể bình; lớp thứ nhất hình tam giác cân ngược, lớp thứ hai hình chai, sinh ra bào tử đính hình cầu; bào tử đính có đường
kính 4-5 m, có màu nâu đen, vách bào tử đính có dạng xù xì
Đặc tính sinh lý: sinh trưởng ở nhiệt độ tối thiểu 6-§°C, tối đa 45-47°C, tối ưu
35-37°C (Panasenko, 1967) là nấm sợi chịu khô: Ayerst (1966) cho biết bào tử đính
có thể nẩy mầm trong môi trường có thế nước 0,77 ở 35°C có thể sinh trưởng ở pH 2 trong điều kiện có thế nước cao (Pitt, 1981)
Độc tố: được xem là nấm sợi không sinh độc tố và được sử dụng rộng rãi
trong chế biến thực phẩm Các enzyme thuỷ phân thu nhận được từ chủng này
không gây đột biến vi khuẩn và các mô của chuột
Lầm thối rữa trái cây (táo, cam quýt, dâu ) và hoa màu (hành, tôi, cà
chua, )
Trang 25
LUAN VAN TOTNGHIEP GVHD:PGS-TS.NGUYỄN TIẾN THANG
1.3.2.2 Các đặc tính và cấu trúc của hệ cellulase từ Aps.Niger
Theo Hurst (1977), endoglucanase từ có trọng lượng phân tử là 26.000
Dalton, hoạt động ở pH và nhiệt độ tối ưu 14 4,0 va 45°C [40]
Theo báo cáo gần đây của Gokhan CORAL (2002), dịch nuôi cấy Z10 trong
môi trường Czapek Dox chứa CMC 1%, sau khi cho chạy điện di trên gel SDS-
PAGE (chứa 2% CMC) phát hiện có hoạt tính thuỷ phân CMC với trọng lượng phân
tử lần lượt là 83.000 và 50.000 Dalton
1.3.2.3 Một số nghiên cứu về khả năng sinh tổng hợp cellulase từ Aps.Niger
Gokhale (1991), cho biết (NH„);SO¿, (NH,)H;PO/ và dich chiết bắp là nguồn
nitơ tốt nhất cho NCIM 1207 sinh tổng hợp cellulase; pH và nhiệt độ nuôi cấy tối ưu lần lượt là 3,0-5,5 và 28°C [35]
Sonia (2000), đã khảo sát khả năng sinh tổng hợp các enzym như
polygalacturonase, cellulase, xylanase, và protease từ 3T5B8 trên các nguồn phụ
phế liệu nông nghiệp khác nhau bằng phương pháp lên men bán rắn và ứng dụng
enzym trong việc tách chiết dầu thực vật
Aguiar (2001), nuôi cấy chủng IZ 9 trong các môi trường có nguồn carbon
khác nhau: glucose, bã mía không được tiền xử lý, bã mía được tiễn xử lý với dung dịch NaOH 4%, bã mía được tiền xử lý với dung dịch NaOH/H;PO, 4% trong hơi nước và giấy lọc Hoạt lực cellulase trong môi trường có giấy lọc khoảng 0,44 IU/ml, va 0,26 IU/ml trong méi trường có bã mía được tiền xử lý với dung dịch NaOH 4%
sau 192 giờ nuôi cấy
Kang (2004), đã nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp cellulase và
hemicellulase của KK2 trên môi trường lên men bán rắn với cơ chất là hỗn hợp rơm và cám mì Hoạt tính giấy lọc là 1,95 IU/g sau 4 ngày nuôi cấy, hoạt lực CMCase
192 IU/g, -glucosidase 100IU/g, xylanase 5070 IU/g va B—xylosidase 193 IU/g sau 5-6 ngay lén men
Trang 26
LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP GVHD:PGS-TS.NGUYỄN TIẾN THẮNG Ở Việt Nam, có công trình nghiên cứu của Lê Hông Mai (1989) về sinh tổng
hợp và một số đặc tính của cellulase (typ CMC-ase) ở VS-I trên môi trường lên
men bán rắn, công trình nghiên cứu của Hoàng Quốc Khánh và cộng sự về sinh
tổng hợp và đặc điểm cellulase từ RNNL-363 trên môi trường lên men bán rắn với
cơ chất là trấu xay và mật rỉ đường (thời gian nuôi cấy tối ưu là 56h)
Hình 1.2 : Đại thể của nấm Aps.Miger — Hình 1.3:Vi thể của nấm Aps Niger
1.3.3 MUCOR SPP
1.3.3.1 Đặc điểm phân loại
Mucor thuộc họ Mucoraceae, bộ Mucorales, lớp Zygomycetes
Mucor là giống lớn nhất của bộ Mucorales Chúng bao gồm các loài:
M.mucedo, M.cremosis, M.rouxii, M.hiemalis, M.silvaticus, M.subtilis Mucor là một
loại nấm phát triển rộng rãi, thường tìm thấy trong đất, phân bón, trái cây, bánh rnì
và những thực phẩm giàu tinh bột khác
Chúng phát triển tốt trong điểu kiện hiếu khí Ở điều kiện yếm khí
Mucor.spp phân tách thành những sợi nấm nhỏ hình tròn hay hình bau duc và nay
chéi, vi thé người ta gọi loài này là men của mốc
Trang 27
LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP = GVHD:PGS-TS NGUYEN TIEN THANG
Chúng còn có khả năng sử dụng một cách hiếu khí nhiều nguồn carbon, lên men carbohydrate, sử dụng ammoniac hay nitơ hữu cơ và có thể phát triển trên một thang nhiệt độ rộng Vì thế, chúng có mặt trên nhiều loại môi trường, bao gồm nhiều loại thức ăn khác nhau
Chúng có những đặc điểm đặc trưng sau để phân biệt với các loài nấm khác
+Khuẩn ty không có vách ngăn
+Nang bào tử được hình thành trên tất cả các bộ phận khí sinh của nấm
+ Nang trụ có hình nón, hình trụ hoặc hình quả lê
+ Bào tử đều, bóng lống + Khơng có thân bò và rễ giả
+ Một số loài có bào tử màng dày và tiếp hợp tử
1.3.3.2 Các hệ enzyme ctia Mucor spp + Hé enzyme protease +Hé enzyme amylase + Hé enzyme lipase + Hé enzyme glucooxidase va catalase + Hé enzyme cellulase
Cellulase thuộc nhóm enzyme thuỷ phân, thuỷ phan cellulose thanh cellobiose
(cấu trúc gồm 2 phân tử D-glucose nối với nhau bằng liên kết 1,4-B- glucosid ở vị trí
ngẫu nhiên trong chuỗi cellulose, chuỗi cellodextrin và các dẫn xuất của cellulose
như carboxy]l methyl cellulose (CMC) va hydroxyethyl cellulose (HEC) Ngoai ra có một số enzyme endoglucanase c6 khả năng phân cắt đặc hiệu trên vùng vô định
hình của cellulose tinh thể Sự thuỷ phân của endocellulase tạo ra những chuỗi cellodextrin có đầu không khử
- Exocellulase (Exoglucanase): thuỷ phân đặc hiệu liên kết I.4-B - glucosid ở đầu không khử của chuỗi cellulose hoặc các cellodextrin để giải phóng cellobiose
Trang 28
LUAN VAN TOTNGHIEP GVHD:PGS-TS.NGUYỄN TIẾN THẮNG
- B-glucosidase (cellobiase): thuỷ giải cellobiose và các cellodextrin phan tử thấp tạo thành D-glucose
- Enzyme cellulase cia M.pusillus NRRL 1543 c6é khả năng phân giải CMC và cellulose da xit ly sơ bộ bằng acid có hoạt tính tối ưu 6 pH 5,0 14 mét enzyme
được nghiên cứu và ứng dụng rộng rãi
1.3.3.3 Ứng dụng của Mucor spp
Mucor spp có vai trò quan trọng trong một số qui trình sản xuất công nghệ thực phẩm, chúng thúc đẩy quá trình chín của phomai hoặc một số thực phẩm Á Đông
như chao, tương, phomai, đường hoá trong giai đoạn đầu của quá trình lên men
rượu, bia
a
Hình 1.4: Đại thể của ném Mucor spp Hình 1.5: Vi thể của nấm Mucorspp
1.4 NUÔI CẤY VI SINH VẬT TỔNG HỢP CELLULASE 1.4.1 Sinh tổng hợp Enzym cảm ứng
Một quá trình sinh tổng hợp Enzym được gọi là cảm ứng nếu như nó chỉ xảy ra với mức độ đáng kể khi trong môi trường có cơ chế đặc hiệu của Enzym này hoặc
các chất có cấu trúc tương tự cơ chất Các Enzym này được gọi là chất cảm ứng
Cellulase là một Enzym thuộc hệ Enzym cảm ứng Cellulase được sinh ra khi
nấm sợi sinh trưởng trên môi trường chứa Cellulase hay dẫn xuất Cellulose và
Trang 29
LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP GVHD:PGS-TS.NGUYỄN TIẾN THẮNG
Lactose, còn trên môi trường chứa Glucose, frutose hoặc Glycerol thì Cellulase kh6ng sinh ra (Bisaria va Mishra, 1989; Beguim, 1990; Kubicek, 1993) M6t trong
các phần tử kích thích nấm sợi sinh tổng hợp Cellulase có hiệu quả nhất là
Sophorose (Mandelset al, 1962; Nisizawaet al, 1971), chất này có nguồn gốc từ các
phần tử Celloligosaccharide
Ở các loài nấm sợi có khả năng sinh ra Cellulase thấp, trước tiên có lẽ do sự tấn công của Cellulase vào tỉnh thể yếu, do đó giải phóng chất cảm ứng
Oligosaccharide cũng ít (Bisaria và Mishra, 1989; Kubicek, 1993)
1.4.2.Ẩ£nh hưởng cửa các yếu tố dinh dưỡng đối với quá trình sinh tổng hợp
Enzym Cellulase của vi sinh vật 1.4.2.1 Nguén Carbon:
Để vi sinh tổng hợp Enzym Cellulase, trong môi trường nhất thiết phải có chất cảm ứng là Cellulose Celluose trong môi trường có thể là giấy lọc, bông, bột
œ,
Cellulose, lõi ngô, mùn cưa, rơm Ngoài ra chất cảm ứng của Cellulase còn có th
là Cellobiozootaacetat, cám mì, lactose
Những loài vi sinh vật khác nhau thì có những nguồn cảm ứng khác nhau vì
từ chất cảm ứng đó vi sinh vật sẽ tạo ra Enzym có hoạt tính mạnh nhất
Các nguồn Cacbon khác như Glucose, Cellobiose, Acetat, Citrat, Oxalate, Succinat và những sản phẩm trung gian của chu trình Krebs, nếu trong môi trường
có nồng độ tất ít thì có tác dụng kích thích vi sinh vật phát triển và tạo Enzym,
nhưng nếu nổng độ cao có tác dụng kìm hãm sinh tổng hợp Cellulase Glycerin chỉ
có tác dụng kích thích vi sinh vật trưởng và phát triển, không cảm ứng tổng hợp Enzym
1.4.2.2 Nguồn Nitơ:
Hoạt tính Enzym có thể thay đổi rất nhiều khi ta thay đổi các thành phần
chính của môi trường trong đó có Nitơ Nitrat là nguồn Nitơ vô cơ thích hợp nhất đối
với các vi sinh vật
Trang 30
LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP GVHD:PGS-TS.NGUYỄN TIẾN THẮNG
Trong môi trường nuôi cấy, các muối amon làm acid hoá môi trường nên nó
ít có tác dụng nâng cao hoạt lực Enzym Cellulase mà thậm chí còn ức chế quá trình sinh tổng hợp Enzym,và có thể làm mất hoạt tính Enzym sau khi tạo thành
Natri nitrate làm cho mơi trường kiểm hố, tạo điều kiện thuận lợi cho sự tạo
thành Cellulase Tuỳ theo đặc tính sinh lý của từng giống mà các hợp chất Nitơ có
tác dụng khác nhau đến sinh tổng hợp Cellulase Nước chiết nấm men chủ yếu
khích thích sự tạo thành Endoglucanase, còn cao ngô kích thích sinh ra Exoglucanase I(CBHI) và Exoglucanase II (CBH II) Tác dụng kích thích của các hợp chất này là do sự có mặt các acid amin, các nguyên tố khoáng và những nhân
tố sinh trưởng khác
1.4.2.3 Các nguyên tố khoáng:
Fe, Mn, B, Mo, Cu, có ảnh hưởng rõ đến khả năng tổng hợp Cellulase của vi sinh vật Trong đó, Zn, Mn, Fe có tác dụng kích thích tạo thành Enzym này ở nhiều chủng
1.4.2.4 Nhiệt độ nuôi cấy:
Nhiệt độ là yếu tố có ảnh hưởng mạnh mẽ đến sự phát triển và sinh tổng hợp
Enzym của vi sinh vật Hoạt động của các loài vi sinh vật dựa trên sự chuyển hoá
của hàng loạt các phản ứng dựa theo những trình tự xác định Khi nhiệt độ tăng các
phản ứng này cũng tăng theo, nhưng khi nhiệt độ tăng quá một giới hạn nào đó thì
tốc độ các phẩn ứng sẽ giảm 1.4.2.5.pH ban đầu:
pH của môi trường cũng có ảnh hưởng rất lớn đến sự phát triển và khả năng sinh tổng hợp Cellulase của vi sinh vật pH của môi trường ảnh hưởng không giống nhau đối với những loài vi sinh vật khác nhau Nhiều loài nấm phát triển và phân giải Cellulose mạnh ở pH 4-6
1.5 PHƯƠNG PHÁP LEN MEN BAN RAN VA THU NHAN ENZYME
CELLULASE TU NAM SOI ASPERGILLUSE NIGER VA MUCOR
SVTH: LE QUOC NAM Trang 14
Trang 31
LUAN VAN TOTNGHIEP = GVHD:PGS-TS NGUYEN TIEN THANG
Trong phương pháp lên men bán rắn, vi sinh vật mọc trên bề mặt môi trường rắn (môi trường rắn trước khi nuôi cấy vi sinh vật cần được làm ẩm trước) Các phụ
phế phẩm nông nghiệp được xem là các cơ chất tốt nhất cho quá trình lên men bán rắn, do đó phương pháp lên men bán rắn được sử dụng để sản xuất Enzym Một số
cơ chất được sử dụng bao gồm: bã mía, cám gạo, bột bắp, rơm, trấu, cây đậu nành,
mạt cưa, cùi bắp Tuy nhiên, cám mì là cơ chất chủ yếu và được sử dụng phổ biến nhất Vi sinh vật khi phát triển sẽ lấy những chất dinh dưỡng trong môi trường và sử dụng O; của không khí để hô hấp Để đảm bảo cho vi sinh vật mọc đều trên bể mặt
môi trường và sử dụng được nhiều chất dinh dưỡng để sản sinh Enzym, lớp môi trường rắn cần phải mồng, chiều dày chỉ vào khoảng 2-5 cm
Phương pháp lên men bán rắn nhiều ưu việt hơn so với phương pháp lên men chìm: Môi trường lên men tương đối rẻ tiền, nồng độ Enzym tạo thành ở môi trường
rắn cao hơn nhiều lần so với dịch nuôi cấy theo phương pháp chìm, canh trường lên men dễ dàng sấy khô và ít bị tổn hao hoạt tính Enzym, không cần các thiết bị phức tap, chủ yếu nuôi cấy trên khay và buông nuôi giữ ở nhiệt độ, độ ẩm thích hợp, quá
trình sản xuất ít tiêu hao năng lượng
1.6 TÁCH VÀ LÀM SẠCH CHẾ PHẨM ENZYME
Trong thực nghiệm và sản xuất hiện nay người ta có thể sử dụng các tác
nhân khác nhau để kết tủa protein như:
+ Muối vô cơ trung tinh: Amoni sunfat, Natri sunfat, Magie sunfat,
Kali sunfat
+ Dung môi hữu cơ : Rượu Ethylic, Isopropanol, Axeton
+ Polymer: Polyethylen glycol (PEG)
+ pH ( được điều chỉnh đến pH của Enzym muốn kết tủa
+ Nhiệt độ
Phương pháp làm sạch Enzym được sử dụng rộng rải nhất hiện nay là phương
pháp kết tủa Enzym bằng dung môi hữu cơ và kết tủa bằng muối trung tính
Trang 32
LUAN VAN TOTNGHIEP — GVHD:PGS-TS NGUYEN TIEN THANG
Kết tủa bằng dung môi hữu cơ:
Các loại dung môi này làm giảm hằng số điện môi của môi trường nước
nghĩa là làm giảm khả năng tan của những phân tử nước bao quanh phan ttt Protein
Điều này xảy ra là do đẩy ra một khối lượng lớn nước và cố định một phần các
phân tử nước bởi quá trình Hydrat hoá của các phân tử dung môi hữu cơ Các dung
môi hữu cơ sẽ thay thế các phân tử dung môi hữu cơ Các dung môi hữu cơ sẽ thay thế các phân tử nước xếp xung quanh những vùng ky nước trên bể mặt phân tử
protein, điều này làm gia tăng độ hoà tan của dung môi hữu cơ, nên lúc này toàn bộ các Protein trong dung dịch cũng như các tạp chất phân tử lớn khác có thể tương tác
với nhau tạo thành một tập hợp và sẽ lắng xuống Các yếu tố ảnh hưởng lên quá
trình này bao gồm nông độ dung môi, nhiệt độ phản ứng lực ion, của dung dịch và tính chất của Enzym
Sự tạo quần hợp Protein có thể do các lực khác nhau tác động hoặc do sự
tương tác giữa các phân tử tích điện khác dấu trên bể mặt Protein Người ta cho
rằng kích thước của phân tử Protein có ảnh hưởng đến quá trình lắng tủa
Tuy nhiên khi sử dụng dung môi hữu cơ làm tác nhân kết tủa Protein có một vấn để cân quan tâm là khả năng biến tính không thuận nghịch của Protein và muốn
đạt được hiệu quả lắng tủa cao, dung môi phải được trộn đều hoàn toàn với nước, có
tính ưa nước để tránh làm biến tính Protein và quá trình phải thực hiện ở nhiệt độ
thấp để giữ cấu trúc ổn định của Protein
Bên cạnh việc kết tủa cùng một lúc nhiều Protein khác nhau, người ta có thể
phân tách riêng hỗn hợp các Protein có trọng lượng phân tử khác nhau, thu nhận
Protein Enzym, loại bỏ Protein phi Enzym bằng phương pháp kết tia phân đoạn
Nguyên tắc chung của phương pháp này là dựa trên tính hoà tan của các Protein khác
nhau ở các nông độ dung môi khác nhau có trong hỗn hợp dung dich Protein cần tách ra Tủa bằng muối trung tính:
Trang 33
LUAN VAN TOT NGHIEP GVHD:PGS-TS.NGUYỄN TIẾN THẮNG
Đây là phương pháp kết tủa khi bổ sung muối trung tính ở nồng độ cao vào
dung dịch Protein Thông thường Protein tổn tại trong dung dịch nhờ sự cân bằng
giữa các lực tĩnh điện và các tương tác ky nước giữa phân tử Protein và nước, ở các
nồng độ muối thấp độ hòa tan của Protein giảm dân và sự cân bằng trên sẽ bị phá
vỡ tạo nên các tập hợp Protein và làm chúng tạo tủa lắng xuống
Các phân tử Protein trong dung dịch được một lớp vỏ nước che chắn, bao bọc các phần ky nước trên bể mặt phân tử Protein làm cẩn trở các Protein tương tác với nhau Nhưng khi có nông độ muối cao tranh giành các lớp vỏ nước làm cho lượng
nước che chắn này giảm đi nên các Protein có thể tương tác lẫn nhau tạo sự lắng tủa Người ta có thể sử dụng nhiễu loại muối trung tính khác nhau nhưng trong đó tốt nhất là Amoni sunfat vì độ hoà tan của muối cao, phản ứng kết tủa không phụ thuộc vào nhiệt độ và chúng không làm biến mất tính các Enzym Tuy nhiên nhược
điểm lớn của phương pháp này là lượng muối trung tính dùng quá nhiều, thường là
50-60% so với dung dịch chiết Enzym và không thể tái thu hồi muối đã sử dụng
Người ta có thể dùng dung dịch muối bảo hoà để tủa phân đoạn Protein hay Enzym để thu được những phân đoạn protein-Enzym loại bỏ những phân đoạn Protein-phi Enzym
1.7 PHƯƠNG PHÁP TÁCH PHÂN ĐOẠN BẰNG SẮC KÝ
Sắc ký là phương pháp có hiệu quả tốt khi cần tách và tỉnh sạch Enzym Có nhiều phương pháp sắc ký được sử dụng như: sắc ký hấp thụ, sắc ký ái lực, sắc ký
trao đổi ion, sắc ký gel trên các nễn chất mang khác nhau như: gel phosphat calci, oxid nhém, hydroxy apatit, silicagel, tinh bét, cellulose, agarose, polyacrilamid,
dextran Tuy nhiên, thường được sử dụng nhất là phương pháp sắc ký trao đổi ion
trên cột cation có chứa các nhóm chức mang tính acid, hoặc trên cột anion có chứa các nhóm chức mang tính kiểm Sự hấp thụ Enzym lên các nhóm chức mang điện tích trái dấu của chất mang và Protein; pH của dung dịch quyết định đến mức độ ion
Trang 34
LUAN VAN TOTNGHIEP GVHD:PGS-TS.NGUYỄN TIEN THANG
hoá của các nhóm chức đó Các dạng chất mang cơ bản thường được sử dụng trong
các phương pháp sắc ký trao đổi ion được giới thiệu ở bảng sau
Hiện nay trong quá trình tỉnh sạch Enzym người ta cũng thường sử dụng
phương pháp sắc ký ái lực dựa trên cơ sở tạo liên kết giữa Enzym và một số cơ chất
đặc hiệu, các Coenym Các chất mang thường được sử dụng trong phương pháp này la Cellulose, agarose, oxyalkyl methacrylate gel, polyacrylamide gel, b6t thuy tinh
Sắc ký Sắc ký Sắc ký
lọc gel tương tác ky ước đổi lon ái tực dao phase
Hình 1.6 : Nguyên tắc phân tách trong quá trình tỉnh sạch bằng sắc ký
Trang 35
LUAN VAN TOT NGHIEP
được nhỗi trong cột
` mm
3 Dung dịch đệm (phase động) và mẫu di chuyển qua cột Các phân tử khuếch
tán trong và ngoài lỗ nền Các phân từ
nhỏ hơn sẽ di chuyển vào sâu trong chất nền hơnvà do đó lưu lại troag cột lâu hơn
2 Mẫu được nạp vào cột GVHD:PGS-TS NGUYỄN TIẾN THẮNG 1 Các hạt hình cầu của môi trường sắc ký lọc gel Kit et oe
4 Khi dung dịch đêm di chuyển liên tục qua cột,
các phân tử kin hơn kích thước lễ gel không thể
khuếch tần vào trong lỗ và do đó di chuyển qua cột
Các phân tử nhỏ hơn khuếch tần vào trong các lỗ gel và bị trì hoãn trong quá trình đi chuyển xuống đầy cột
5 Các phân tử lớn rời cột trước nhất sau đó Độ hấp thụ
là các phân tử nhỏ hơn theo trình tự kích thước 4 7 Trọng _ Tương của chúng Quá trình phân tách xảy ra hoàn ì Non lượng Trọng tác
Trang 36
LUAN VAN TOTNGHIEP GVHD:PGS-TS.NGUYỄN TIẾN THANG
Oxy hoá mạnh các hạt gel sẽ bị phá vỡ, trong dung dịch axit mạnh các glucosid trong gel sẽ bị thuỷ phân
Theo sự giới thiệu bốn loại Sephadex của hãng “ Pharmacia” thì nếu muốn tách hỗn hợp có trọng lượng phân tử trong khoảng 10-40 ngàn Dalton thì nên dùng Sephadex G75, đối với các phân tử có trọng lượng phân tử khoảng 20-50 ngàn
Dalton thì dùng Sephadex G100, đối với các phân tử có trọng lượng phân tử 30-
100.10” Dalton thì dùng Sephadex G200
Hiện nay các chế phẩm Sephadex dạng thương mại có các loại khác nhau từ
G10 cho đến G200 có độ xốp lớn nhất và chúng có đặc tính tương ứng Ngoài Sephadex còn có các chất mang lọc gel khác hiện nay có thể kể đến là Superdex có
đặc tính ưu việt hơn Sephadex
1.9 PHÂN TÍCH HỖN HỢP ENZYM BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐIỆN DI MINI-
GEL SDS POLYACRYLAMIDE
Phương pháp này kết hợp với phương pháp sắc ký có thể xác định được trọng lượng phân tử của các Protein hoặc cũng có thể xác định được độ tỉnh sạch của chế
phẩm Enzym thu được
Quá trình phân tách Enzym bằng phương pháp điện di dựa trên khả năng chuyển dịch khác nhau của các phân tử Protein mang điện tích khác nhau trong điện
trường Có nhiều dạng điện di trên gel acrylamide nhờ các đặc điểm ưu việt của
loài gel này là có tính trơ hoá học, tính ổn định cao, không hấp phụ và thẩm thấu
điện tích Đặc biệt trong quá trình điện di sử dụng dung dịch đệm dị pha thì khả
năng tách biệt các Protein sẽ nâng lên rõ
Trong phương pháp này, các Protein được phản ứng với các chất hoạt động
bể mặt mang điện tích âm đó là SDS (Sodium Dodecyl Sunfate) để tạo thành một
phức hợp mang điện tích âm, lượng SDS liên kết với một Protein và do đó phức hợp
Protein-SDS sẽ tỷ lệ với kích thước Protein đó, phức hợp này đều mang điện tích âm ( do điện tích âm của SDS đã lấn áp các điện tích thực tế của Protein) chúng sẽ
Trang 37
LUAN VAN TOT NGHIEP GVHD:PGS-TS.NGUYỄN TIẾN THẮNG
di chuyển một chiểu về cực dương dựa trên cơ sở sự khác nhau về chất mang và
kích thước Thêm vào đó một chất khử là Mercaptoethanol hoặc Dithithreitol (DDT)
để phá vỡ cầu nối —S-S- (disunfur) của Protein ( và các tiểu đơn vị của chúng) nhờ
đó sự di chuyển trong gel của các phân tử có kích thước lớn sẽ di chuyển chậm hơn
những phân tử có kích thước nhỏ hơn khi đi qua lỗ gel có kích thước nhất định
Mục đích của phương pháp điện di được sử dụng để đánh giá độ tỉnh sạch và
xác định trọng lượng phân tử Protein, người ta thường so sánh với một thang phân tử lượng chuẩn là hỗn hợp Protein có trọng lượng phân tử khác nhau đã biết
Tốc độ di chuyển của Protein trong phương pháp điện di phụ thuộc vào:
+ Điện tích của mỗi phân tử thay đổi tuỳ theo pH môi trường, do đó phải
dùng dung dịch đệm để duy trì pH ổn định
+ Hình dáng và trọng lượng phân tử + Cường độ của điện trường
+ Nhiệt độ
+ Tính chất của giá mang (giấy, Axetat cellulose, gel ) sẽ ảnh hưỡng ít
nhiều lên sự di chuyển của Protein
+ Thời gian điện di
Lớp gel gom mục đích làm cho các Protein trong mẫu được đồn lại tạo thành băng mỏng, lớp gel phân tích sẽ tạo ra các băng Protein có kích thước khác nhau từ
cùng một điểm xuất phát ban đầu
1.10 MỘT SỐ ỨNG DỤNG ENZYME CELLULASE
Hiện nay việc sản xuất chế phẩm Cellulose từ vi sinh vật đã tiến hành ở qui mô công nghiệp và được ứng dụng rộng rãi vào nhiều lĩnh vực khác nhau ở nhiều
nước trên thế giới
Hiện nay, trên thị trường có một loại Enzym Cellulose như:
Cellulose va Novozyme C[SN] Meicelase MC [MJ] Cellulose TAP [AM], Cytolase [GR]
Trang 38
LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP GVHD:PGS-TS.NGUYỄN TIẾN THẮNG
Việc nghiên cứu và sử dụng trực tiếp Enzym Cellulose trong quá trình chế biến thực phẩm cũng như trong chế biến thức ăn gia súc để cải thiện độ tiêu hoá đang được chú ý rất nhiều
Ở Trung Quốc đã có phong trào sử dụng nấm nốc để chế biến các phụ phẩm
nông nghiệp thành thức ăn cho lợn, còn ở Việt Nam cũng đã có những ứng dụng Cellulose trong việc thuỷ phân vỏ dưa, vỏ chuối để làm thức ăn cho gia súc
Cellulose còn có tác dụng làm mềm vải nên được bổ sung vào thành phần chất giặt tẩy trong cơng nghệ bột giặt
Ngồi ra Cellulose còn được ứng dụng trong việc làm giảm sự ô nhiễm môi
trường trong công nghiệp xử lý rác thải, chất thải công nghiệp
Trang 40
LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP = GVHD:PGS-TS NGUYEN TIEN THANG
PHAN II: PHUONG PHAP VA VAT LIEU 2.1 Vật liệu 2.1.1 Chế phẩm enzyme cellulase Chế phẩm enzyme thô được nuôi cấy ở nhiệt độ phòng, tỉ lệ 4 trấu: 6 cám mì, độ ấm 55%, pHã 2.1.2 Hóa chất và thiết bị 2.1.2.1 Hóa chất
Các hóa chất dùng để pha dung dịch đệm: CH;COONa.3H;O, CH;COOH Các hóa chất dùng để xác định hoạt tính enzyme: Sodium carboxy methyl cellulose
(CMC), glucose, thuốc thử DNS (acid 2-hydroxy-3,5-dinitrobenzoic, NaOH,
pastassium sodium tartrate tertradydrate), dung dich lactose
Các hóa chất dùng để xác định hàm lượng protein: albumine, bằng phương pháp Bradford (coomassie Brilliant Blue, Ethanol tuyệt đối, Acid photphoric)
Các hóa chất dùng trong phương pháp điện di: sodium dodecyl sulfate (SDS),
ammonium persulfate, bromophenol blue,N.N.N'.N'-tetramethylenediamidl (C2H,¿N;-TEMED), Acryamide Bisacryamide,-mercaptoethanol, thang phân tử
lượng nhỏ (Sigma), Glycine (C;H;O¿N!) 2.1.2.1 Thiết bị
se Quang phổ kế Hewwlett Packard 8435 (Phần mềm HPUvischemstations), hệ
thống sắc ký cột áp suất thấp Bio-Rad, bộ điện di đứng Bio-Rad, máy đo pH
Precisa, cân phân tích Mettler Toledo, máy ly tâm Jouan CR412, bộ ổn nhiệt Memmert GmbH, bình hút chân không, máy xay
2.2 Phương pháp lên men bán rắn để thu nhận enzyme cellulase 2.2.1 Vật liệu và phương pháp
2.2.1.1 Nấm sợi
Aspergillus Niger được ký hiệu là Cạ N¡ K;¿ và Mucor spp ở phòng Vĩ sinh
ting dung — Viện sinh học Nhiệt Đới