Nghiên cứu thu nhận, tinh sạch và xác định tính chất của Chitinase từ mủ cây cao su Hevea brasiliensis

LỜI MỞ ĐẦU Chitin là thành phần chính trong thành tế bào nấm và vỏ ngoài của côn trùng, giáp xác. Chitin bị phân cắt bởi chitinase tạo thành các sản phẩm có Nacetylglucosamine và oligomer N-acetyl-glucosamine có nhiều ứng dụng trong y dược học, nông nghiệp. Ngoài ra, chitin còn có thể được dùng trong thuốc trừ nấm, trừ sâu bệnh, côn trùng sinh học và không gây ô nhiễm môi trường. Việt nam đang là nước nuôi trồng, chế biến và xuất khẩu thủy sản hàng đầu châu Á. Sản lượng tôm của Việt nam hằng năm hơn 1.000.000 tấn. Đây là nguồn nguyên liệu dồi dào để sản xuất chitin, chitosan và các sản phẩm khác có giá trị. Vì vậy việc sử dụng chitinase để tận dụng nguồn chitin khổng lồ thải ra từ công nghiệp chế biến thủy sản vừa giảm ô nhiễm môi trường vừa tạo thành các sản phẩm có ích có ý nghĩa khoa học và thực tiễn cao. Chitinase có thể thu nhận từ thực vật, động vật (tuyến tiêu hóa của cá, mực) và vi sinh vật (Aspergillus fumigatus, Bacillus sp.). Tuy nhiên việc sản xuất chitinase đặt biệt là chitinase tinh sạch đòi hỏi nhiều đầu tư về vốn lẫn về mặt kỹ thuật và tốn nhiều công sức. Cho nên hiện nay việc sản xuất enzyme này còn nhiều hạn chế và giá thành của chitinase trên thị trường là rất đắt. Theo một số nghiên cứu gần đây cho thấy trong mủ của cây cao su có chứa một loại chitinase gọi là hevamine. Ở Việt Nam, diện tích trồng cây cao su hiện nay khoảng hơn 500.000ha và trong thời gian tới có thể tăng lên 800.000ha, đây là một nguồn cung cấp chitinase đầy tiềm năng và rẻ tiền. Đề tài này hướng tới mục tiêu tách chiết, tinh sạch, xác định tính chất và tiến đến mô hình hóa việc sử dụng enzyme hevamine trong thủy phân chitin để thu nhận Nacetylglucosamine và oligomer của chúng. Hiện nay, chưa có các đề tài trong nước nghiên cứu về chitinase từ mủ cao su hay hevamine. Do đó, thành công của đề tài này sẽ góp phần mở ra một hướng mới trong việc sản xuất chitinase ở Việt Nam, một enzyme có nhiều ứng dụng quan trọng.

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN ***** NGUYỄN QUANG NHÂN NGHIÊN CỨU THU NHẬN, TINH SẠCH VÀ XÁC ĐỊNH TÍNH CHẤT CỦA CHITINASE TỪ MỦ CÂY CAO SU HEVEA BRASILIENSIS Chuyên ngành: Hoá sinh Mã số: 1.07.05 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS. TS. NGUYỄN ANH DŨNG THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH - 2009 LỜI CẢM ƠN Để có được như ngày hôm nay, ngoài sự nỗ lực của bản thân, tôi đã nhận được biết bao sự quan tâm, chăm sóc, dạy dỗ và giúp đỡ của cha mẹ, thầy cô và bạn bè. Trước hết em xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc đến Thầy PGS. TS. Nguyễn Anh Dũng. Thầy luôn hướng dẫn, quan tâm và tạo mọi điều kiện tốt nhất cho em để em có thể hoàn thành luận văn này. Em cũng xin gửi lời cảm ơn các thầy cô trong Bộ môn Sinh hóa Trường Đại học Khoa học Tự nhiên và Bộ môn Sinh học Thực vật Trường Đại học Tây Nguyên. Các thầy cô luôn động viên và tạo mọi điều kiện tốt nhất cho em trong suốt thời gian làm đề tài. Tôi cũng xin cám ơn những người bạn đã luôn giúp đỡ và động viên tôi rất nhiều, đặc biệt là bạn Trần Quốc Tuấn, bạn Nguyễn Văn Bốn, chò Trònh Thò Bích Ngọc, chò Nguyễn Kim Ngân. Tôi xin cảm ơn các bạn, các em làm việc tại bộ môn Sinh hóa và bộ môn Sinh học Thực vật đã giúp đỡ tôi trong quá trình làm thí nghiệm. Tôi xin cảm ơn anh Sơn cùng các anh chò làm việc tại phòng Kỹ thuật, nông trường Phú Xuân, TP Buôn Ma Thuột đã nhiệt tình giúp đỡ tôi trong quá trình lấy mẫu tại nông trường. Cuối cùng, con xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến Ba Má và Anh Chò Hai. Ba Má và Anh Chò vẫn luôn quan tâm, chăm sóc, động viên và là chỗ dựa tinh thần cho con, cho em. Một lần nữa tôi xin cảm ơn tất cả mọi người, xin nhận ở nơi tôi lòng biết ơn chân thành và lời chào trân trọng nhất. Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 09 năm 2009 NGUYỄN QUANG NHÂN - i - MỤC LỤC Trang LỜI CẢM ƠN i DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ii DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU iii DANH MỤC CÁC HÌNH iv DANH MỤC CÁC ĐỒ THỊ v LỜI MỞ ĐẦU vi Phần I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1 I.1. Sơ lược về chitin và chitinase 1 I.1.1. Chitin 1 I.1.2. Chitinase (EC 3.2.1.14) 5 I.1.2.1. Phân loại chitinase 6 I.1.2.2. Các nguồn thu nhận enzyme chitinase 9 I.1.2.3. Các đặc tính cơ bản của enzyme chitinase 12 I.1.2.4. Các loại cơ chất của enzyme chitinase 15 I.1.2.5. Cơ chế tác động của các loại enzyme chitinase 16 I.1.2.6. Ứng dụng của chitinase 17 I.2. Cây cao su Hevea brasiliensis và chitinase trong mủ cao su 20 I.2.1. Cây cao su 20 I.2.2. Mủ cao su 24 I.2.3. Hevamin 32 Phần II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 37 II.1. Vật liệu 37 II.2. Phương pháp 37 II.2.1. Phương pháp ly tâm mủ thu nhận lutoid 37 II.2.2. Kết tủa protein bằng dung môi hữu cơ 38 II.2.3. Kết tủa protein bằng muối trung tính 38 II.2.4. Thẩm tích 39 II.2.5. Xác đònh hàm lượng protein hòa tan theo phương pháp Lowry 40 II.2.6. Xác đònh hoạt độ chitinase theo phương pháp đònh lượng đường khử với thuốc thử DNS 42 II.2.7. Tinh sạch enzyme bằng phương pháp lọc gel Sephadex 45 II.2.8. SDS-PAGE 46 II.2.9. Xác đònh nhiệt độ tối ưu cho hoạt tính chitinase 50 II.2.10. Xác đònh pH tối ưu cho hoạt tính chitinase 50 II.2.11. Xác đònh nồng độ cơ chất tối ưu cho hoạt tính chitinase 51 II.2.12. Ảnh hưởng của ion kim loại 51 Phần III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 52 III.1. Quy trình tách chiết, thu nhận chitinase thô từ mủ cao su 52 III.1.1. Quy trình ly tâm tách mủ, thu hồi lutoid và phá vỡ lutoid để giải phóng chitinase 52 III.1.2. Quy trình tủa để thu nhận chitinase thô 52 III.1.2.1. Tủa bằng cồn để thu nhận chitinase thô 52 III.1.2.2. Tủa bằng acetone để thu nhận chitinase thô 54 III.1.2.3.Tủa bằng muối ammonium sulfate để thu nhận chitinase thô 55 III.2. Quy trình tinh sạch chitinase bằng phương pháp lọc gel Sephadex 58 III.2.1. Hàm lượng protein và hoạt tính chitinase trước lọc gel 58 III.2.2. Kết quả đo OD 280nm các phân đoạn lọc gel ở 3 giống cao su 59 III.2.3. Hàm lượng protein và hoạt tính chitinase sau lọc gel 61 III.2.4. Hiệu suất hàm lượng protein và hoạt tính chitinase thu được qua lọc gel 63 III.2.5. Hiệu suất thu hồi chitinase từ mủ cao su 63 III.2.6. Kết quả điện di SDS-PAGE các giống cao su qua lọc gel 64 III.3. Xác đònh các tính chất của chitinase 67 III.3.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ 67 III.3.2. Ảnh hưởng của pH 69 III.3.3. Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất 71 III.3.4. nh hưởng của các ion kim loại 73 III.3.5. Quy trình thu nhận enzyme chitinase từ mủ cao su 76 Phần IV: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 78 IV.1. Kết luận 78 IV.2. Đề nghò 78 TÀI LIỆU THAM KHẢO 80 PHỤ LỤC 84 DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ΔOD Biến thiên mật độ quang BSA Bovine serum albumin, albumin bò Dd Dung dòch DNS acid 3,5-dinitrosalicylic GlcNAc N-Acetyl-β-D-Glucosamine HT Hoạt tính HTR Hoạt tính riêng Latex Mủ cao su Laticifer Tế bào cây chứa nhựa mủ NAGase β-N-Acetylglucosaminidase OD Mật độ quang học Serum Dòch lỏng trong mủ cao su UI Đơn vò hoạt độ (International Unit - đơn vò quốc tế) - ii - DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU BẢNG Trang Bảng 3.1: Hàm lượng, hoạt tính và hoạt tính riêng chitinase khi tủa bằng cồn 53 Bảng 3.2: Hàm lượng, hoạt tính và hoạt tính riêng chitinase khi tủa bằng acetone 54 Bảng 3.3: Hàm lượng, hoạt tính, hoạt tính riêng chitinase tủa bằng (NH 4 ) 2 SO 4 55 Bảng 3.4: So sánh các tác nhân tủa với cùng lượng mẫu ban đầu 57 Bảng 3.5: Hàm lượng và hoạt tính chitinase của 3 giống cao su trước lọc gel 58 Bảng 3.6: Hàm lượng và hoạt tính chitinase của 3 giống cao su sau lọc gel 62 Bảng 3.7: Hiệu suất hàm lượng protein và hoạt tính chitinase qua lọc gel 63 Bảng 3.8: Hiệu suất thu hồi chitinase từ mủ cao su 64 Bảng 3.9: Ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt tính của chitinase ở giống GT1 67 Bảng 3.10: Ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt tính của chitinase ở giống PB235 67 Bảng 3.11: Ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt tính của chitinase ở giống RRIM600 68 Bảng 3.12: Ảnh hưởng của pH lên hoạt tính của chitinase ở giống GT1 69 Bảng 3.13: Ảnh hưởng của pH lên hoạt tính của chitinase ở giống PB235 70 Bảng 3.14: Ảnh hưởng của pH lên hoạt tính của chitinase ở giống RRIM600 70 Bảng 3.15: Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất lên hoạt tính chitinase ở giống GT1 72 Bảng 3.16: Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất lên hoạt tính chitinase ở giống PB235 72 Bảng 3.17: Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất lên hoạt tính chitinase ở giống RRIM600 72 Bảng 3.18: Ảnh hưởng của ion kim loại lên hoạt tính chitinase giống GT1 74 Bảng 3.19: Ảnh hưởng của ion kim loại lên hoạt tính chitinase giống PB235 75 Bảng 3.20: Ảnh hưởng của ion kim loại lên hoạt tính chitinase giống RRIM600 75 - iii - DANH MỤC CÁC HÌNH HÌNH Trang Hình 1.1: Cấu trúc của chitin 1 Hình 1.2: Cấu trúc chuỗi α-chitin 2 Hình 1.3: Cây cao su Hevea brasiliensis 22 Hình 1.4: Hình chụp mủ cao su dưới kính hiển vi điện tử 27 Hình 1.5: Cấu trúc của hevamine 33 Hình 1.6: Cấu trúc bậc 2 của hevamine A 34 Hình 1.7: Cấu trúc TIM barrel ở hevamine 35 Hình 2.1: Phản ứng phân cắt chitin bằng chitinase 42 Hình 2.2: Phản ứng của đường khử với thuốc thử DNS 42 Hình 3.1: Khối lượng phân tử của các protein trong các mẫu thơ và mẫu tinh của 3 giống cao su 65 Hình 3.2: Sơ đồ quy trình sơ bộ thu nhận chitinase từ mủ cao su Hevea brasiliensis 77 - iv - DANH MỤC CÁC ĐỒ THỊ ĐỒ THỊ Trang Đồ thò 3.1: Kết quả đo OD 280nm các ống lọc gel của giống cao su GT1 60 Đồ thò 3.2: Kết quả đo OD 280nm các ống lọc gel của giống cao su PB235 60 Đồ thò 3.3: Kết quả đo OD 280nm các ống lọc gel của giống cao su RRIM600 61 Đồ thò 3.4: Ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt tính chitinase ở giống GT1 67 Đồ thò 3.5: Ảnh hưởng của pH lên hoạt tính chitinase ở giống GT1 69 Đồ thò 3.6: Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất lên hoạt tính chitinase ở giống GT1 71 Đồ thò 3.7: Ảnh hưởng của ion kim loại lên hoạt tính chitinase giống PB235 74 - v - LỜI MỞ ĐẦU Chitin là thành phần chính trong thành tế bào nấm và vỏ ngoài của côn trùng, giáp xác. Chitin bò phân cắt bởi chitinase tạo thành các sản phẩm có N- acetylglucosamine và oligomer N-acetyl-glucosamine có nhiều ứng dụng trong y dược học, nông nghiệp. Ngoài ra, chitin còn có thể được dùng trong thuốc trừ nấm, trừ sâu bệnh, côn trùng sinh học và không gây ô nhiễm môi trường. Việt nam đang là nước nuôi trồng, chế biến và xuất khẩu thủy sản hàng đầu châu Á. Sản lượng tôm của Việt nam hằng năm hơn 1.000.000 tấn. Đây là nguồn nguyên liệu dồi dào để sản xuất chitin, chitosan và các sản phẩm khác có giá trò. Vì vậy việc sử dụng chitinase để tận dụng nguồn chitin khổng lồ thải ra từ công nghiệp chế biến thủy sản vừa giảm ô nhiễm môi trường vừa tạo thành các sản phẩm có ích có ý nghóa khoa học và thực tiễn cao. Chitinase có thể thu nhận từ thực vật, động vật (tuyến tiêu hóa của cá, mực) và vi sinh vật (Aspergillus fumigatus, Bacillus sp.). Tuy nhiên việc sản xuất chitinase đặt biệt là chitinase tinh sạch đòi hỏi nhiều đầu tư về vốn lẫn về mặt kỹ thuật và tốn nhiều công sức. Cho nên hiện nay việc sản xuất enzyme này còn nhiều hạn chế và giá thành của chitinase trên thò trường là rất đắt. Theo một số nghiên cứu gần đây cho thấy trong mủ của cây cao su có chứa một loại chitinase gọi là hevamine. Ở Việt Nam, diện tích trồng cây cao su hiện nay khoảng hơn 500.000ha và trong thời gian tới có thể tăng lên 800.000ha, đây là một nguồn cung cấp chitinase đầy tiềm năng và rẻ tiền. Đề tài này hướng tới mục tiêu tách chiết, tinh sạch, xác đònh tính chất và tiến đến mô hình hóa việc sử dụng enzyme hevamine trong thủy phân chitin để thu nhận N- acetylglucosamine và oligomer của chúng. Hiện nay, chưa có các đề tài trong nước nghiên cứu về chitinase từ mủ cao su hay hevamine. Do đó, thành công của đề tài này sẽ góp phần mở ra một hướng mới trong việc sản xuất chitinase ở Việt Nam, một enzyme có nhiều ứng dụng quan trọng. - vi - - 1 - Phần I: Tổng quan tài liệu Phần I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU I.1. SƠ LƯC VỀ CHITIN VÀ CHITINASE I.1.1. Chitin • Cấu tạo chitin Chitin có công thức hóa học (C 8 H 13 NO 5 ) n trong đó C chiếm 47,29%, H chiếm 6,45%, N chiếm 6,89% và O chiếm 39,37%. Ở dạng tự nhiên, chitin là một chất rắn màu trắng vô đònh hình, dai, có sợi, phụ thuộc vào nguồn gốc và phương pháp thu nhận. Về cấu trúc, chitin (còn gọi là poly-[1,4-(N-acetyl-β-D-glucosamine)]) là một polysaccharide bao gồm các gốc N-acetyl-D-glucosamine [GlcNAc, còn gọi là (1->4)-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucose] gắn với nhau bằng liên kết β-1,4- O-glycoside. Về mặt cấu trúc lập thể, chitin có 3 dạng: α, β, δ. Sự khác nhau này biểu hiện ở sự sắp xếp các chuỗi. Ở α-chitin các chuỗi xuôi và ngượïc xen kẽ nhau, ở Hình 1.1: Cấu trúc của chitin Nguyễn Quang Nhân [...]... : Hevea Loài : Hevea brasiliensis [28] Hình 1.3: Cây cao su Hevea brasiliensis Nguyễn Quang Nhân - 23 - Phần I: Tổng quan tài liệu Hevea brasiliensis là một loại cây cao su (Pará rubber tree, rubber tree) to lớn, cao từ 20 mét đến 40 mét, có nguồn gốc từ lưu vực sông Amazone và chi lưu (Nam Mỹ) ở trạng thái ngẫu sinh [4] Cũng như các loại khác thu c giống Hevea, cây Hevea brasiliensis có hoa đơn tính, ... phức tạp có bản chất là tế bào chất của tế bào cây chứa nhựa mủ Thành phần, hàm lượng các thành phần và tính chất latex khác biệt nhau tùy theo loại cây, tùy theo các điều kiện về khí hậu, hoạt tính sinh lý và hiện trạng sống của cây cao su Các phân tích latex từ nhiều loại cây cao su khác nhau chỉ đưa ra những con số phỏng chừng về thành phần latex: cao su chiếm từ 30-40% [17, 31], nước từ 52-70%, protein... tấn/hecta/năm [4] Một cây cao su Hevea brasiliensis có kích thước lớn được xử lý thích hợp có thể chòu được trên 20 lần cạo mủ trong mùa thu hoạch, cung cấp tới 10 lít latex ứng với 3kg cao su khô Qua năng su t kể trên, ta thấy loại cao su này bỏ xa năng su t đạt được với những cây cao su khác (Ficus, Manihot, Puntomia, Guayule hay Kok-saghyz) năng su t của chúng chỉ vào khoảng vài kg cao su/ hecta/năm [4]... muốn thu hoạch cao su, cần phải thực hiện rạch cạo một đường trên vỏ thân cây nhằm Nguyễn Quang Nhân - 26 - Phần I: Tổng quan tài liệu cắt đứt các mạch latex, làm tổn thương các tế bào chứa nhựa mủ để cho latex cao su tiết, chảy ra ngoài Phương pháp thu hoạch này, được gọi là phương pháp “cạo mủ , được áp dụng vào cây cao su Hevea brasiliensis vì latex của cây này có độ nhớt thấp và do cây cao su này... vỏ cây dễ lành vết thương hơn) và nhất là giống tuyển nhân ghép năng su t thông thường đạt được từ 1 tấn đến 1,5 tấn cao su/ hecta/năm Việc sử dụng các cây giống mới có thể tăng năng su t vượt lên trên 2 tấn cao su khô/hecta/năm Viện khảo cứu cao su Việt Nam cho biết đã trao đổi kỹ thu t về giống cây với nhiều viện khảo cứu cao su quốc tế và đã nhập được những giống mà năng su t ở vườn thí nghiệm của. .. ta và các nước khác chính là cây cao su Hevea brasiliensis này I.2.2 Mủ cao su • Nguồn gốc latex và hệ thống mạch latex Mủ cây cao su (latex) được tạo ra từ những tế bào sống chuyên biệt (laticifer, tế bào cây chứa nhựa mủ [17]) có trong nhu mô cây, đặc biệt là trong vùng tạo lập libe vỏ Các tế bào tạo latex được một lớp nguyên sinh chất mỏng bao phủ, bao cả một không bào lớn là nơi mà nguyên sinh chất. .. béo và dẫn xuất 1-2%, glucid và heterosid khoảng 1%, khoáng chất từ 0,3-0,7% Nhiều dạng cao su trên thò trường đều có chứa nhiều hoặc ít lượng chất cấu tạo latex phụ hoặc có chứa những chất biến đổi của chúng và có thể chúng có tính liên hệ mật thiết với tính chất của cao su thô hay latex được bảo quản Trò số pH của latex có ảnh hưởng quan trọng tới độ ổn đònh latex Latex tươi vừa chảy khỏi cây cao su. .. pH Giá trò tối ưu của enzyme chitinase từ 4-9 đối với các chitinase ở thực vật bậc cao và tảo, enzyme chitinase ở động vật có vú là 4,8-7,5 và ở vi sinh vật là 3,5-8,0 Theo các nhà khoa học, pH tối thích của enzyme chitinase có thể có sự phụ thu c vào cơ chất được sử dụng Đa số các enzyme chitinase đã được nghiên cứu có pH tối thích khoảng 5,0 khi cơ chất là chitin, enzyme chitinase của Streptomyces... SU HEVEA BRASILIENSIS VÀ CHITINASE TRONG MỦ CAO SU I.2.1 Cây cao su Trong thiên nhiên có rất nhiều cây cao su thu c nhiều loại thực vật khác nhau (chưa kể có loại cây cho ra chất tương tự cao su như cây gutta-percha và balata) Nói chung cây cao su trên thế giới thu c vào 5 họ thực vật sau: Euphorbiaceae, Moraceae, Apocynaceae, Asclepiadaceae và Composeae Chúng thích hợp với khí hậu vùng nhiệt đới, đặc... hoạt tính kháng nấm của enzyme chitinase tái tổ hợp trong cơ thể chuột và thỏ bò nhiễm các loại nấm khác nhau thu c nhóm Aspergillus, Candida … Hiệu quả của sự điều trò vơí tác nhân kháng nấm được ước lượng trên 3 điểm: - Giảm tỉ lệ chết - Giảm số lượng tế bào nấm được nuôi cấy từ các cơ quan - Giảm mức độ lưu thông kháng nguyên nấm I.2 CÂY CAO SU HEVEA BRASILIENSIS VÀ CHITINASE TRONG MỦ CAO SU I.2.1 Cây . NHIÊN ***** NGUYỄN QUANG NHÂN NGHIÊN CỨU THU NHẬN, TINH SẠCH VÀ XÁC ĐỊNH TÍNH CHẤT CỦA CHITINASE TỪ MỦ CÂY CAO SU HEVEA BRASILIENSIS Chuyên ngành: Hoá sinh Mã số:. cơ chất của enzyme chitinase 15 I.1.2.5. Cơ chế tác động của các loại enzyme chitinase 16 I.1.2.6. Ứng dụng của chitinase 17 I.2. Cây cao su Hevea brasiliensis và chitinase trong mủ cao su. lượng và hoạt tính chitinase của 3 giống cao su trước lọc gel 58 Bảng 3.6: Hàm lượng và hoạt tính chitinase của 3 giống cao su sau lọc gel 62 Bảng 3.7: Hiệu su t hàm lượng protein và hoạt tính chitinase