Nhân dòng, biểu hiện và nghiên cứu một số tính chất của protease từ HIV 1 tại việt nam

Hiện nay, trên thế giới đã có nhiều công trình nghiên cứu để sản xuất protease của HIV-1 được gọi tắt là protease HIV-1 nhưng thực tế cho thấy protease HIV-1 không dễ dàng được biểu hiện

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

Nguyễn Thị Hồng Loan

NHÂN DÒNG, BIỂU HIỆN VÀ NGHIÊN CỨU MỘT SỐ TÍNH CHẤT CỦA PROTEASE TỪ HIV-1

TẠI VIỆT NAM

LUẬN ÁN TIẾN SĨ NGÀNH SINH HỌC

MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết của đề tài

Virus gây suy giảm miễn dịch ở người (Human immunodeficiency virus - HIV) là nguyên nhân chính gây ra hội chứng suy giảm miễn dịch mắc phải ở người (AIDS) và là một trong số những virus gây bệnh nghiêm trọng nhất hiện nay HIV biến đổi liên tục về cấu trúc và hệ gen để kháng lại các thuốc điều trị và gây ra tỷ lệ

tử vong cao Kể từ khi xuất hiện (từ năm 1981) đến nay đã có khoảng 60 triệu người trên hành tinh bị nhiễm HIV, trong đó có khoảng 25 triệu người đã chết do các bệnh

có liên quan đến AIDS và AIDS đã trở thành một trong những căn bệnh gây chết nhiều người nhất trong lịch sử loài người (UNAIDS, 2010) Theo các tài liệu đã công

bố, có ít nhất hai type HIV gây nên AIDS đó là HIV type 1 (HIV-1) và HIV type 2 (HIV-2), nhưng HIV-1 là nguyên nhân chính gây ra AIDS ở người trên toàn thế giới

Trong chu trình sống của HIV-1, 3 enzyme reverse transriptase, integrase và protease có vai trò quan trọng không thể thiếu trong sao chép, đóng gói và hình thành virus hoàn chỉnh Vì vậy, các chất ức chế của 3 enzyme này đã được nghiên cứu, sản xuất để điều trị cho bệnh nhân nhiễm HIV/AIDS và các điều trị này được gọi là liệu pháp dùng thuốc chống retrovirus (antiretroviral drug therapy, gọi tắt là

ART) Trong số 3 enzyme nói trên, protease được mã hóa bởi gen pol của virus có

chức năng cắt các chuỗi polyprotein (gag, gag-pol) tại những vị trí nhất định để tạo thành các protein cấu trúc và chức năng cần thiết cho virus hoàn chỉnh Nếu protease bị mất hoạt tính, HIV-1 không được đóng gói phù hợp để tạo virus hoàn chỉnh (Darke và tập thể, 1989) Tuy nhiên, do tốc độ sinh sản nhanh của HIV – 1, có khoảng 10 triệu hạt virus mới được tạo ra mỗi ngày và tỷ lệ sai sót rất cao của enzyme reverse transriptase (1/10.000 base) dẫn đến tình trạng kháng thuốc phổ biến

ở những bệnh nhân nhiễm bệnh thậm chí khi chưa điều trị Khi có ART, các chủng mang đột biến kháng thuốc được chọn lọc và trở thành chủng ưu thế (Hoffmann và tập thể, 2007) Mặc dầu, ngày càng có nhiều chất ức chế protease (PI) chống HIV được phát triển và thương mại hóa nhưng hiện vẫn chưa tìm được chất ức chế nào thực sự có hiệu quả Vì vậy, việc sản xuất và tinh sạch để thu được lượng lớn

protease của HIV-1 cho các nghiên cứu điều tra, phát triển chất ức chế hiệu quả là cần thiết

Hiện nay, trên thế giới đã có nhiều công trình nghiên cứu để sản xuất protease của HIV-1 (được gọi tắt là protease HIV-1) nhưng thực tế cho thấy protease HIV-1 không dễ dàng được biểu hiện trong tế bào vật chủ do đặc tính gây độc tế bào, khó tan; lượng protease thu được sau biểu hiện thường thấp, trong một

số trường hợp chỉ có thể phát hiện được bằng phương pháp miễn dịch với các quy trình biểu hiện, tinh sạch gồm nhiều bước rất phức tạp Mặt khác, các nghiên cứu đều sản xuất protease HIV-1 phân lập từ phân nhóm B là phân nhóm HIV phổ biến gây bệnh ở Mỹ, Australia và các nước Tây Âu Trong khi, phần lớn các trường hợp nhiễm HIV-1 trên thế giới và ở Việt Nam không thuộc phân nhóm B Những nghiên cứu gần đây cho thấy sự khác nhau về cấu trúc của protease phân nhóm B so với các phân nhóm khác dẫn đến hiệu quả điều trị thuốc ức chế protease (PI) và mức độ kháng thuốc có thể khác nhau Chính vì vậy, thiết lập hệ thống biểu hiện và tinh sạch protease HIV-1 tái tổ hợp hiệu quả và đại diện cho phân nhóm HIV-1 gây bệnh chủ yếu ở Việt Nam có vai trò quan trọng trong việc nâng cao hiệu quả điều trị bệnh nhân nhiễm HIV/AIDS

Bên cạnh đó, các đột biến kháng PI tương đối đặc hiệu cho từng loại thuốc riêng biệt, do đó thay thế một loại thuốc khác trước khi có sự tích lũy đột biến thì các phác đồ sau vẫn thành công (Hoffmann và tập thể, 2007) Vì vậy, xét nghiệm kháng thuốc thường theo hướng phát hiện đột biến trong gen mã hóa protease HIV-1 có vai trò rất quan trọng trong việc xây dựng phác đồ điều trị HIV/AIDS

Ở Việt Nam, protease HIV-1 từ các bệnh nhân Việt Nam là vấn đề còn ít được nghiên cứu Các nghiên cứu chủ yếu tập trung vào xác định nhóm virus gây bệnh chủ yếu ở người Việt Nam và tìm ra một số đột biến liên quan kháng thuốc Đặc biệt, chưa có nghiên cứu nào về biểu hiện protease HIV-1 phân lập từ các bệnh nhân người Việt Nam

Xuất phát từ thực tế trên, chúng tôi đã tiến hành đề tài “Nhân dòng, biểu hiện và nghiên cứu một số tính chất của protease từ HIV-1 tại Việt Nam” để

tạo ra chế phẩm protease HIV-1 tái tổ hợp sử dụng cho mục đích sàng lọc và phát

triển các chất ức chế sự nhân lên của HIV, từng bước làm cơ sở phát triển thuốc điều trị HIV/AIDS

2 Mục tiêu nghiên cứu của đề tài

- Phát hiện một số đột biến trong gen mã hóa protease HIV-1 ở người Việt Nam

- Thiết lập quy trình hiệu quả cho việc biểu hiện gen mã hóa protease HIV-1

ở vi khuẩn E coli và tinh sạch protease HIV-1 tái tổ hợp ở dạng có hoạt tính

- Nghiên cứu một số tính chất protease HIV-1 và tìm hiểu tác dụng của một

số chất ức chế làm cơ sở để tìm kiếm và phát triển các PI mới có thể ứng dụng trong điều trị HIV/AIDS

3 Đối tượng và nội dung nghiên cứu của đề tài

Đối tượng nghiên cứu của đề tài:

Gen mã hóa protease HIV-1 từ huyết thanh các bệnh nhân nhiễm HIV-1 tại Bệnh viện Bệnh Nhiệt đới Trung ương

Nội dung nghiên cứu của đề tài:

- Tinh sạch RNA của HIV-1 và tổng hợp cDNA của một số mẫu HIV-1 từ các bệnh nhân nhiễm HIV-1 tại Việt Nam

- Nhân bản, nhân dòng và đọc trình tự gen mã hóa protease HIV-1 của các mẫu virus phân lập được, đánh giá sự sai khác về trình tự gen mã hóa protease HIV-1 giữa các đối tượng bệnh nhân nhiễm HIV-1 so với trình tự gen tương ứng trên thế giới

- Thiết kế hệ thống vector và xác định điều kiện biểu hiện gen mã hóa cho

protease HIV-1 ở E coli

- Xây dựng quy trình tinh sạch protease HIV-1 tái tổ hợp

- Nghiên cứu một số đặc trưng xúc tác của protease HIV-1 tái tổ hợp thu được

- Tìm hiểu tác dụng ức chế của một số hợp chất tổng hợp và tự nhiên lên protease HIV-1 tái tổ hợp

4 Địa điểm thực hiện đề tài

Các nghiên cứu của luận án được thực hiện chủ yếu tại Phòng Thí nghiệm trọng điểm Công nghệ Enzym và Protein, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội

5 Đóng góp mới của đề tài

- Công trình nghiên cứu có tính hệ thống từ việc nhân bản, nhân dòng và

biểu hiện ở E coli gen mã hóa protease HIV-1 tái tổ hợp thuộc chủng CRF01_AE

của Việt Nam; thiết lập được phương pháp đơn giản để tinh sạch protease HIV-1 với hiệu suất thu nhận enzyme cao hơn so với các nghiên cứu trên thế giới

- Là công trình đầu tiên phát hiện thấy tác dụng ức chế protease HIV-1 bởi axit asiatic, 8-hydroxyquinoline và menadione

6 Ứng dụng thực tiễn của đề tài

- Cách thức biểu hiện gen mã hóa protease HIV-1 và tinh sạch protease tái

tổ hợp tạo ra trong công trình nghiên cứu này có thể dễ dàng được áp dụng để sản xuất một số protease tái tổ hợp khó tan và chỉ đặc hiệu với một số cơ chất nhất định

- Chế phẩm protease HIV-1 tạo ra là cơ sở cho việc tìm kiếm và phát triển các PI mới để có thể ứng dụng trong điều trị bệnh nhân HIV/AIDS

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 GIỚI THIỆU CHUNG VỀ HIV-1

1.1.1 HIV-1 nguyên nhân của AIDS

Virus gây suy giảm miễn dịch ở người (HIV) lần đầu tiên được Montagnier

và tập thể ở Viện Pasteur Paris phân lập vào năm 1983 với tên gọi ban đầu là virus liên quan tới viêm hạch (LAV) Năm 1986, virus này được Ủy ban Quốc tế thống nhất gọi tên HIV (Greene, 2007) Cùng thời điểm đó người ta đã phân lập được một virus mới ở Tây Phi và đặt tên là HIV–type 2, đây là virus gốc của HIV-type 1 Hai loại virus này đều làm suy giảm hệ thống miễn dịch của người và đặt tên chung là HIV Mặc dù HIV-type 2 có một số điểm giống với HIV-type 1 như về cách thức

truyền bệnh, các hình thức nhiễm bệnh cơ hội và phương pháp điều trị nhưng người nhiễm HIV-type 2 ít phát sinh bệnh hơn so với nhiễm HIV-type 1 và HIV-type 2 thấy chủ yếu ở các vùng của Châu Phi (Hoffmann và tập thể, 2007) Vì vậy, HIV-type 1 (HIV-1) được xem như là nguyên nhân chính gây nên bệnh AIDS

HIV thuộc họ retrovirus, là họ gây ung thư cho người và động vật HIV-1 có

3 nhóm chính là M (main), N (new), và O (outlier) Có tới 90% sự lây nhiễm HIV trên toàn thế giới thuộc nhóm M; nhóm này có 9 phân type được ký hiệu bằng các chữ cái A-D, F-H, J, K và nhiều dạng tái tổ hợp khác được gọi tắt là các phân nhóm CRF (circulating recombinant forms) Sự khác nhau giữa phân nhóm này với phân nhóm khác là ở trình tự axit amin của protein vỏ và có thể vượt quá 30% Phân nhóm B phổ biến ở Mỹ, Tây Âu và Australia; trong khi các phân nhóm không phải nhóm B lại phân bố ở các nước đang phát triển của châu Á và châu Phi, nơi mà phần lớn những người bị nhiễm đang sinh sống Sự đa dạng của virus có thể thấy ở vùng Sahara (châu Phi) Ở Việt Nam và các nước Đông Nam Á phân nhóm HIV-1 phân lập từ các bệnh nhân nhiễm HIV-1 chủ yếu thuộc nhóm CRF01_AE, bên cạnh

đó là một số ít các phân nhóm B, C và các dạng tái tổ hợp khác (UNAIDS, 2010; Nguyen và tập thể, 2003; Ishizaki và tập thể, 2009; Phan và tập thể, 2010)

Phần lớn việc nghiên cứu để tìm ra thuốc điều trị bệnh do HIV gây nên đều dựa trên phân nhóm B Tuy nhiên gần đây, sự đa dạng về trình tự axit amin giữa các phân nhóm được xem như hướng nghiên cứu quan trọng trong các con đường kháng

thuốc PI (Bandaranayake và tập thể, 2008)

1.1.2.Tình hình nhiễm HIV-1

Đại dịch HIV/AIDS đã và đang là một thách thức to lớn đối với tiến trình phát triển xã hội Sau 3 thập kỷ phát hiện mà đầu tiên là ở các nước phát triển, HIV/AIDS đã lan rộng trên toàn thế giới, đặc biệt ở khu vực châu Phi và các nước châu Á Đến nay vẫn chưa có vaccine phòng ngừa HIV hay thuốc chữa trị đặc hiệu

Theo chương trình HIV/AIDS của Liên hiệp quốc (UNAIDS, 2010), đến cuối năm 2008 số người nhiễm HIV/AIDS đang sống trên thế giới tăng 20% so với năm 2000 và tỷ lệ hiện nhiễm HIV/AIDS ước tính cao gấp 3 lần năm 1990 Số liệu mới nhất tính đến cuối năm 2009 ước tính khoảng 33,3 triệu người đang mang căn

bệnh HIV/AIDS, trong đó số đối tượng nhiễm mới là 2,6 triệu người và có khoảng 1,8 triệu bệnh nhân đã chết vì AIDS trong năm 2009

Ở Việt Nam, trường hợp nhiễm HIV-1 đầu tiên được phát hiện đầu năm 1990; giữa những năm 2000 đến 2007, số người nhiễm đã tăng gấp đôi từ 122.000 đến 290.000 người và mỗi năm có khoảng 40.000 người nhiễm mới Tính đến ngày 30/9/2010 trên cả nước có 180.631 trường hợp nhiễm HIV/AIDS Thành phố Hồ Chí Minh là địa phương có tỷ lệ bệnh nhân HIV/AIDS cao nhất với 23% tổng số bệnh nhân trong cả nước (Liao và tập thể, 2009; UNAIDS, Vietnam) Theo đánh giá chung, tình hình nhiễm HIV/AIDS có xu hướng giảm nhưng đại dịch HIV/AIDS vẫn trong giai đoạn tập trung – xảy ra chủ yếu trong các nhóm có hành vi nguy cơ cao,

đặc biệt trong nhóm tiêm chích ma túy và mại dâm

Theo phân tích của các chuyên gia, tổng số người nhiễm HIV còn sống vẫn đang tiếp tục gia tăng là hệ quả của hai tác động chủ yếu: Số người mới nhiễm HIV hàng năm trên toàn cầu vẫn cao và do kết quả tích cực của các liệu pháp điều trị kháng virus làm giảm số người tử vong, kéo dài sự sống cho người bệnh

1.1.3 Sinh bệnh học của nhiễm HIV-1

1.1.3.1 Cấu trúc hình thể của HIV-1

Trên kính hiển vi điện tử, HIV-1 và HIV-2 có cấu trúc gần như giống nhau hoàn toàn Chúng chỉ khác nhau ở khối lượng của các protein cũng như các gen phụ trợ Cả HIV-1 và HIV-2 đều nhân bản trong tế bào lympho CD4 và đều gây bệnh ở người, mặc dù mức độ suy giảm miễn dịch do HIV-2 gây ra là ít hơn (Hoffmann và tập thể, 2007)

HIV-1 có kích thước khoảng 120 nm, dạng cầu (hình 1.1) Vỏ ngoài của virus là lớp lipid kép với nhiều protein gắn vào và nhô lên được ký hiện là Env Protein Env có phần chỏm được tạo thành từ 3 phân tử glycoprotein có khối lượng phân tử là 120 kDa (gp120) và phần thân được tạo thành bởi 3 phân tử gp41 gắn với nhau tạo thành các phân tử gp160 đính vào lớp vỏ ngoài của virus; gp160 có thể được phát hiện trong huyết thanh cũng như mô bạch huyết của bệnh nhân HIV Trong quá trình nảy chồi, virus có thể gắn thêm các protein từ màng của tế bào vật chủ vào lớp lipoprotein của virus, ví dụ các protein HLA lớp I và II, hoặc các protein kết dính như ICAM-1 giúp virus gắn vào tế bào đích Protein p17 được gắn vào mặt trong của màng lipoprotein

Lõi có dạng hình trụ đƣợc bao bọc bởi lớp capsid tạo thành từ 2.000 bản sao của protein p24 (Hare, 2006; Hoffmann và tập thể, 2007)

Hình 1.1 Cấu trúc của một hạt HIV-1 (Hoffmann và tập thể, 2007)

1.1.3.2 Tổ chức hệ gen của virus

Hệ gen của HIV-1 nằm trong phần lõi của virus và bao gồm hai sợi RNA (+) đơn, mỗi sợi có chiều dài khoảng 9,8 kb và có 9 gen mã hóa cho 15 protein khác nhau (hình 1.2) So với các virus khác thuộc họ retrovirus thì hệ gen của HIV-1

phức tạp hơn Trên mỗi sợi RNA có 3 gen cấu trúc là gag, pol và env; trong đó gag

có nghĩa “group-antigen” (kháng nguyên nhóm), pol là “polymerase” và env là

“envelope” (vỏ) Cấu trúc “cổ điển” của bộ gen retrovirus là

5’LTR-gag-pol-env-LTR 3’ Trong đó, vùng 5’LTR-gag-pol-env-LTR (long terminal repeat hay đoạn lặp dài đầu cùng) là hai đầu của bộ gen virus, nối với DNA tế bào vật chủ sau khi tích hợp và không mã

hóa cho bất cứ protein nào của virus Các gen gag và env mã hóa cho nucleocapsid

và glycoprotein của màng virus; gen pol mã hóa cho 3 enzyme: reverse transcriptase, integrase và protease Ngoài ra, HIV-1 còn có 6 gen (vif, vpu, vpr, tat, rev và nef) ở vùng RNA 9 kb (Hoffmann và tập thể, 2007)

Hình 1.2 Cấu tạo hệ gen của HIV-1 (Hoffmann và tập thể, 2007)

Hình 1.2 Cấu tạo hệ gen của HIV-1 (Hoffmann và tập thể, 2007)

1.1.3.3 Chu trình nhân bản của nhiễm HIV-1

Quá trình nhiễm HIV-1 của tế bào vật chủ bắt đầu bằng việc gắn một phần virus lên bề mặt của tế bào (hình 1.3) Quá trình này được bắt đầu khi protein bề mặt vỏ gp120 gắn vào thụ thể trên bề mặt tế bào đích Nhiều trường hợp thụ thể là CD4 có ở tế bào lympho T hoặc có ở một số tế bào khác như đại thực bào, bạch cầu đơn nhân hay tế bào lympho B Các tế bào này có vai trò rất quan trọng trong hệ thống miễn dịch của cơ thể; chúng nhận diện, báo động và huy động các tế bào lympho tấn công và tiêu diệt vi sinh vật lạ vào cơ thể Sự liên kết đầu tiên của gp120 với CD4 để lộ ra vị trí khác của trimer Env, sau đó gp120 liên kết với đồng thụ thể, thường là thụ thể chemokine CXCR4 hoặc CCR5 Tiếp đó phân tử gp41 qua thụ thể gắn vào màng tế bào đích và hòa tan màng, HIV-1 cởi bỏ lớp vỏ lipid bên ngoài và bơm vật liệu di truyền RNA của nó cùng với reverse transcriptase vào

tế bào chất của tế bào vật chủ Nhờ reverse transcriptase, sợi RNA của virus được tổng hợp thành sợi DNA bổ sung (cDNA) Sợi RNA của virus kết hợp cDNA thành chuỗi RNA/DNA – chuỗi lai này chuyển thành 2 sợi DNA xoắn mạch thẳng, sau đó chuyển thành DNA xoắn dạng vòng chui qua màng nhân đi vào nhân tế bào và nhờ enzyme integrase, DNA kép của virus được chèn vào DNA nhiễm sắc thể của tế bào chủ DNA virus được hợp thành (hay gọi là tiền virus, phân biệt nó với dạng virion)

có thể tồn tại ở trạng thái tiềm tàng trong nhiều giờ hoặc nhiều năm trước khi trở thành dạng hoạt động mà có thể không biểu hiện bệnh (Hare, 2006)

Quá trình sao chép hệ gen của virus được thực hiện dưới sự điều khiển phức tạp của một số protein, bao gồm Tat và các yếu tố sao chép DNA của tế bào Chính việc gắn vật chất di truyền của virus vào hệ gen đã làm thay đổi cấu trúc gen của tế bào vật chủ DNA của virus sẽ chỉ thị cho tế bào sản xuất ra RNA của virus nhờ enzyme RNA polymerase Các RNA này được nhân lên, các protein của virus cũng được tổng hợp nhờ ribosome của tế bào vật chủ, chúng di chuyển ra mạng lưới nội chất hoặc màng tế bào, tiếp theo là quá trình nảy chồi tạo thành các virion nằm trên màng hoặc tách ra khỏi tế bào chủ, đi vào máu và lại gắn vào các

tế bào lympho T khác Sự vận chuyển RNA của virus đã được sao chép ra khỏi nhân phụ thuộc vào một số nhân tố của virus và vật chủ trong đó có Rev; nó có thể được vận chuyển ra ngoài nhân dưới dạng vật liệu di truyền cho các virion mới hay có thể được nối từng phần hoặc toàn bộ nhằm tổng hợp nên những protein khác nhau của virus (Hare, 2006; Hoffmann và tập thể, 2007)

Hình 1.3 Chu kỳ sống của HIV-1 (Weiss, 2001)

Các tế bào lympho T CD4+ bị nhiễm có thể bị giết trực tiếp khi một lượng lớn virus được sản sinh và nảy chồi từ bề mặt, phá vỡ màng tế bào hoặc khi các protein và axit amin của virus có mặt bên trong tế bào, cản trở sự hoạt động của bộ máy tế bào Mặt khác, các tế bào lympho T CD4+ bị nhiễm có thể rơi vào tình trạng

Bản sao DNA

của HIV

tự chết (chết theo chương trình) khi chức năng của tế bào bị rối loạn do HIV-1 gây

ra Thêm vào đó, nhiều nghiên cứu cho thấy rằng HIV-1 cũng phá hủy các tế bào tiền thân mà khi trưởng thành chúng có các chức năng miễn dịch đặc hiệu, do đó có thể mất khả năng tái sinh, hơn nữa là làm giảm khả năng bảo vệ cơ thể của hệ thống miễn dịch Các cơ thể nhiễm HIV cho thấy cả miễn dịch thể dịch và miễn dịch tế bào đều kháng lại virus Quá trình đáp ứng lại của tế bào có sự tham gia của tế bào lympho T CD8+ và CD4+ làm trung gian kìm hãm sự nhân lên của HIV-1 trực tiếp bằng cách nhận diện, giết các tế bào bị nhiễm và không trực tiếp bằng cách sản sinh các nhân tố kháng chemokine của virus Trong thời gian đó, các kháng thể do hệ thống miễn dịch ở người được sản sinh khi có mặt các kháng nguyên của virus Tuy nhiên, virus có các phương thức để chống lại sự tấn công của hệ thống miễn dịch bằng cách biến đổi các epitope đích hoặc thoát ra khỏi sự bắt giữ Vì vậy, cơ thể (hay hệ thống miễn dịch) không thể ngăn chặn được sự tiến triển của bệnh và cuối

cùng HIV-1 phá hủy hệ thống miễn dịch (Feinberg, 1996; Hare, 2006)

1.1.3.4 Diễn biến của quá trình nhiễm HIV-1

Sự lây nhiễm HIV-1 ban đầu gọi là quá trình nhiễm sơ cấp, thường từ 3-6 tuần, sau đó virus đi khắp cơ thể, các hạt virus gây nhiễm các cơ quan Người bệnh sốt nhẹ, có dấu hiệu như cảm cúm cũng có khi không thấy triệu chứng gì, số lượng

tế bào T CD4+ giảm Tiếp theo là giai đoạn tiềm ẩn lâm sàng kéo dài từ 2 đến 10 năm; trong giai đoạn này, quá trình nhân lên của virus và số lượng tế bào lympho T CD4+ tăng lên dẫn tới các hoạt động khác thường của hệ miễn dịch, khả năng kháng virus của người bệnh tăng lên làm cho người bệnh lầm tưởng là đã khỏi nhưng lúc này virus vẫn có khả năng truyền bệnh Khoảng vài năm sau đó, mật độ virus trong máu tăng nhanh và giữ cho tới lúc chết, các kháng thể kháng virus giảm dần, giai đoạn này gọi là giai đoạn toàn phát hay giai đoạn cuối Người bệnh thấy mức độ nhiễm khuẩn tăng lên, người gầy yếu, các vi sinh vật cơ hội có điều kiện tấn công Đặc biệt, một số bệnh như bệnh ung thư, lao, tiêu chảy kéo dài, sút cân, dùng kháng sinh không khỏi, chân tay xuất hiện các nốt nhiễm, da và niêm mạc bắt đầu xuất hiện bệnh, người bệnh chết dần (Daar và tâ ̣p thể, 2001; Hoffmann và tập thể, 2007)

1.1.4 Phương pháp điều trị HIV/AIDS

Trong phòng chống nhiễm HIV-1, phát triển vaccine theo phương pháp truyền thống gặp rất nhiều khó khăn do một số nguyên nhân như thời gian ủ bệnh của HIV-1 dài, thường xuyên xảy ra đột biến ở vùng gen mã hóa cho kháng nguyên, chưa có mô hình nhiễm HIV-1 trên động vật và tần suất phơi nhiễm HIV-1 cao Nguời nhiễm HIV-1 muốn kéo dài cuộc sống chỉ có con đường duy nhất là uống thuốc ức chế sự sao chép và nhân lên của HIV-1

Cho đến nay, việc điều trị HIV/AIDS phức tạp, tốn kém và chỉ giúp kéo dài

sự sống mà không chữa khỏi được bệnh Các thuốc điều trị HIV/AIDS có thể hướng đến các đích khác nhau dựa trên cơ sở hiểu biết về quá trình nhiễm và nhân lên của HIV trong tế bào (hình 1.4) như: ức chế quá trình nảy chồi, ức chế quá trình hòa màng và xâm nhập của HIV-1 và phổ biến nhất là liệu pháp dùng thuốc kháng retrovirus (ART) được áp dụng từ những năm 1987 bao gồm thuốc ức chế enzyme reverse transcriptase, protease và integrase (Hoffmann và tập thể, 2007)

Hình 1.4 Các thuốc chống HIV và đích tác dụng (Hoffmann và tập thể,

2007)

Các chất tương tự nucleoside (NRTI) ức chế enzyme reverse transcriptase:

đây là nhóm thuốc chống retrovirus đầu tiên được triển khai Đích tác động của NRTI là reverse transcriptase của HIV-1 Chúng chỉ có khác biệt nhỏ ở phân tử ribose so với các nucleoside bình thường vì vậy có thể thay thế vị trí của nucleoside bình thường theo cơ chế cạnh tranh Khi các thuốc này được đưa vào phân tử DNA đang được tổng hợp, thì quá trình kéo dài chuỗi của DNA sẽ bị ngừng lại Nhóm

thuốc này gồm zidovudine (AZT), lamivudine, didanosine, zalcitabine, stavudine và abacavir Một thuốc mới hơn là emtricitabine phải được dùng phối hợp với ít nhất 2 thuốc AIDS khác, điều trị cả HIV-1 và viêm gan B Tuy vậy, khi điều trị kéo dài các thuốc nucleoside có thể gây nhiều tác dụng như: nhiễm độc thần kinh, sinh nhiều lactic, viêm đa dây thần kinh và viêm tu ̣y Mặc dù ban đầu rối loạn phân bố mỡ được cho là do điều trị bằng thuốc ức chế protease nhưng thực ra có nhiều rối loạn

về chuyển hoá (đặc biệt là teo mỡ) hiện cũng được cho là đặc tính của thuốc nucleoside Có lẽ chúng liên quan đến ức chế hoạt động của ty thể do hoạt động chức năng của ty thể cần đến nucleoside Quá trình chuyển hoá của cơ quan quan trọng này bị rối loạn do việc sử dụng phải nucleoside “giả” dẫn đến sự thoái hoá của

ty thể Các thuốc khác nhau có thể gây độc với ty thể ở mức độ khác nhau (Galli và

tâ ̣p thể, 2002)

Thuốc ức chế virus xâm nhập: Các thuốc này ức chế hay cản trở sự xâm nhập

của HIV vào tế bào vật chủ Có 3 bước chủ yếu giúp HIV-1 xâm nhập vào tế bào CD4: HIV-1 gắn vào thụ thể của tế bào CD4, gắn với đồng thụ thể và hòa nhập virus với tế bào Mỗi bước này đều có thể bị ức chế Tất cả các nhóm thuốc cụ thể như thuốc ức chế gắn virus, đối kháng đồng thụ thể và ức chế hòa màng hiện nay đều được gọi chung là thuốc ức chế xâm nhập Thuốc đầu tiên trong nhóm này được cấp phép năm 2003 là enfuvirtide (T-20) tỏ ra ức chế ngay cả những chủng HIV-1 kháng thuốc mạnh nhất Tuy nhiên, bệnh nhân điều trị T-20 có sự gia tăng tỷ lệ về bệnh lý hạch và viêm phổi do vi khuẩn (Trottier và tập thể, 2005)

HIV/AIDS còn có thể được điều trị bằng thuốc điều hòa miễn dịch như Alpha-interferon, interleukin 2, loprinasine với tác dụng tăng cường khả năng bảo

vệ các hệ miễn dịch Ngoài ra, bệnh nhân HIV/AIDS còn có thể được điều trị với một số thuốc phòng ngừa bệnh cơ hội

Dầu vậy, bức tranh phòng chống HIV/AIDS đến năm 1994 vẫn hết sức ảm đạm, nhiều bệnh nhân nhiễm bệnh từ giữa những năm 80 đã tử vong Chính vì vậy,

sự ra đời của các thuốc ức chế protease và thuốc ức chế enzyme reverse transcriptase không phải nucleoside (NNRTI) vào năm 1995 đã bắt đầu kỷ nguyên trị liệu kháng retrovirus hiệu lực cao (Highly Active Anti-Retroviral Therapy-

HAART) và tạo ra những tiến bộ vượt bậc về giảm tỷ lệ mắc và tử vong do HIV-1 cũng như giảm rõ rệt các nhiễm trùng cơ hội và khối u

Các chất ức chế protease (PI): đây là các chất có tác dụng cản trở sự nhân

lên của HIV-1 ở giai đoạn muộn hơn trong vòng đời của virus, khiến cho HIV-1 bị rối loạn cấu trúc và không có khả năng gây nhiễm Tuy nhiên, bệnh nhân điều trị bằng PI thường phải uống nhiều lần thuốc trong một ngày và điều trị kéo dài gây ra một số tác dụng phụ thường gặp như: bệnh dạ dày, ruột, giảm chức năng gan, rối loạn lipid máu, loạn nhịp tim (Nolan, 2003; Anson và tập thể, 2005) Điều này cũng

đã được hạn chế với sự ra đời của các PI mới (PI tăng cường) thường được biểu thị bằng cách thêm chữ “r” vào sau tên thuốc Việc tăng cường có thể hiệu quả trên những chủng virus kháng thuốc nhờ vào việc làm tăng nồng độ thuốc trong huyết tương Kháng thuốc cũng hiếm gặp khi điều trị PI tăng cường, ít nhất ở những bệnh nhân chưa từng điều trị ART bởi hàng rào kháng thuốc cao Theo nhiều chuyên gia, bệnh nhân có tải lượng virus cao cần phải dùng PI tăng cường ngay từ khi bắt đầu điều trị Tuy nhiên, lạm dụng PI tăng cường cũng dẫn đến rối loạn lipid máu và các tác dụng phụ khác nặng nề hơn (Van der Valk và Reiss, 2003) Dù vậy, PI vẫn là một thành phần quan trọng và không thể thiếu của HAART Các thuốc trong nhóm gồm saquinavir, ritonavir, indinavir, nelfinavir, amprenavir, lopinavir và atazanavir Thuốc PI tiêu biểu là atazanavir (Reyataz ™) là PI uống 1 ngày 1 lần duy nhất với lợi thế không hại lipid máu, không kháng insulin được đưa vào sử dụng từ năm

2004 (Noor và tâ ̣p thể , 2004) Thuốc có tác dụng dung nạp tốt và hiệu lực kháng virus mạnh được cấp phép sử dụng cho các bệnh nhân đã điều trị ART Hiện nay, atazanavir đang cạnh tranh với lopinavir để dành vị trí PI được kê đơn nhiều nhất Lopinavir được cấp phép tháng tư năm 2001 và là thuốc PI đầu tiên và duy nhất có một liều tăng cường làm tăng nồng độ lopinavir lên trên 100 lần Lopinavir/r có hàng rào kháng thuốc rất cao, cần tích lũy ít nhất 6-8 đột biến kháng thuốc thì mới

đủ gây thất bại trong điều trị (Kemp và tâ ̣p thể, 2002)

Các chất ức chế reverse transcriptase không nucleoside (NNRTI): giống với

các NRTI, đích tác động của chúng là enzyme reverse transcriptase Tuy vậy, NNRTI gắn trực tiếp và không cạnh tranh với enzyme ở vị trí gần sát với nơi gắn các nucleoside Kết quả là làm phong bế hoàn toàn vị trí gắn các chất hoạt hóa

enzyme reverse transcriptase, làm giảm đáng kể quá trình tổng hợp axit nucleic Nhóm thuốc này gồm: nevirapine (viramuneTM), efavirenz (sustiva™ hay stocrin™) và delavirdine (rescriptor™) Tuy nhiên, bệnh nhân điều trị bằng NNRTI

có nguy cơ kháng thuốc không chỉ rất cao mà còn có thể xuất hiện khá nhanh Một khi đã xảy ra kháng thuốc thì hầu như sẽ kháng với cả nhóm thuốc này Chỉ cần một đột biến ở vị trí gắn kỵ nước (đột biến K103N) là đủ loại bỏ toàn bộ cả nhóm thuốc Nếu đã có đột biến kháng thì không nên điều trị tiếp tục bằng NNRTI, bởi lẽ khả năng nhân lên của virus có đột biến kháng NNRTI lại không bị giảm sút như những trường hợp có đột biến kháng PI hay NRTI Mặc dù có những vấn đề liên quan đến nguy cơ kháng thuốc, rất nhiều nghiên cứu đều cho thấy NNRTI có hiệu quả rất tốt nếu phối hợp cùng với các thuốc NRTI Các dữ liệu về miễn dịch học cũng như virus học ở những bệnh nhân chưa từng được điều trị ART cho thấy các thuốc NNRTI cũng có hiệu lực tương đương nếu không muốn nói là vượt trội hơn so với các thuốc PI (Robbins và tâ ̣p thể , 2003) Liều dùng đơn giản và dung nạp thuốc tốt giúp nevirapine và efavirenz trở thành thành phần quan trọng của HAART và thậm chí vượt trội các PI Vừa qua, nhiều nghiên cứu ngẫu nhiên đã chứng minh rằng nếu đảm bảo đã ức chế được virus thì hoàn toàn có thể chuyển từ điều trị bằng PI sang NNRTI và sử dụng NNRTI đôi khi đem lại hiệu lực tốt hơn so với tiếp tục dùng các thuốc PI (Hoffmann và tập thể, 2007)

Trong phác đồ điều trị cho bệnh nhân HIV/AIDS, các thuốc thường được dùng phối hợp để tăng hiệu quả và hạn chế tác dụng phụ

Đến năm 1997, các mô hình tính toán toán học cho thấy thời gian ức chế hoàn toàn HIV-1 là 3 năm, sau thời gian này các nhà khoa học tiên đoán rằng các tế bào mang virus có lẽ đã chết hết và chữa trị hoàn toàn tiệt căn HIV-1 là có thể Tuy nhiên, các nghiên cứu gần đây cho thấy, HIV-1 vẫn còn tồn tại tiềm tàng ở nhiều tế bào thậm chí sau một thời gian dài bị ức chế, không ai có thể biết các tế bào mang virus tiềm tàng này sống được bao lâu và dù còn một lượng rất nhỏ thì HIV-1 vẫn

có thể bùng phát trở lại ngay sau khi ngừng điều trị Thời gian ước lượng gần nhất

để xóa sạch các tế bào mang HIV-1 là 73,3 năm và như vậy HIV-1 không thể chữa khỏi trong thời gian ngắn (Siliciano và tâ ̣p thể , 2003) Bên cạnh đó, các thuốc ức chế HIV-1 phải uống nhiều lần và điều trị kéo dài dẫn đến các tác dụng phụ (bệnh

dạ dày và đường ruột, rối loạn trao đổi lipid máu, loạn nhịp tim ) Vấn đề này có thể được giải quyết bằng cách sử dụng nồng độ chất ức chế protease cao hoặc tạo ra các chất ức chế mới có hiệu lực cao Mặt khác, HIV-1 nhân lên nhanh và enzyme reverse transcriptase phiên mã với tỉ lệ sai sót khá cao nên tốc độ đột biến HIV-1 lớn và HIV-1 luôn tạo ra các chủng mới dẫn đến sự thay đổi trong cấu trúc và giúp cho HIV có khả năng kháng thuốc Đây là thách thức và dẫn đến thất bại trong điều trị HIV-1 bằng ART

Dầu vậy, dù HIV-1 là một tác nhân gây bệnh truyền nhiễm rất nguy hiểm với những biến đổi phức tạp, các nhà khoa học vẫn đang không ngừng nghiên cứu để tìm ra thuốc mới, hiệu quả chống HIV và hi vọng rằng trong 10 năm nữa hiệu quả điều trị bằng ART và HAART sẽ khác hoàn toàn

1.2 PROTEASE HIV-1 VÀ ỨNG DỤNG

Trong chu trình tái bản của HIV-1, protease là enzyme có tác dụng phân cắt các polyprotein tiền thân gag và gag-pol thành những protein cấu trúc và chức năng trong quá trình trưởng thành của virus Khi ức chế hoạt tính của protease hoặc gây đột biến trên gen mã hóa cho protease, các hạt virus vẫn hình thành nhưng không được đóng gói phù hợp để tạo thành virus hoàn chỉnh nên chúng không có khả năng xâm nhiễm vào tế bào vật chủ (Darke và tâ ̣p thể , 1989) Với vai trò đặc biệt quan trọng như vậy, protease HIV-1 đã được nhiều nhóm các nhà khoa học trên thế giới quan tâm nghiên cứu

1.2.1 Cấu tạo protease HIV-1

Có nhiều cách phân loại protease, dựa vào vị trí cắt trên chuỗi polypeptide, protease được chia thành hai nhóm chính: exopeptidase và endopeptidase Exopeptidase cắt liên kết peptide ở gần đầu N hoặc đầu C của cơ chất, trong khi đó endopeptidase cắt liên kết peptide nội chuỗi Dựa vào cấu trúc của “nhóm chức” có mặt trong trung tâm hoạt động, protease lại được chia thành bốn nhóm chính: protease serine, protease aspartyl, protease cysteine và protease chứa kim loại, tiếp

đó protease lại tiếp tục được phân chia thành nhiều họ khác nhau dựa vào trình tự axit amin (Rao và tâ ̣p thể , 1998) Dựa vào cách phân loại như trên, protease HIV-1

là một protease aspartyl (có chứa Asp trong trung tâm hoạt động)

Năm 1989, Navia và tập thể phòng thí nghiệm Merck là nhóm đầu tiên mô tả cấu trúc tinh thể của protease HIV-1 Từ đó đến nay, nhiều protease HIV-1 khác nhau đã được nghiên cứu về chức năng, tính đặc hiệu cơ chất và vị trí gắn của các chất ức chế Cấu trúc của một số phức hợp protease HIV-1 kháng thuốc với các chất ức chế đặc hiệu cũng đã được làm sáng tỏ (King và tâ ̣p thể , 2000) Protease HIV-1 được mã hóa bởi hệ gen của HIV-1 và là một protease aspartyl, họ retropepsin A2, được tạo ra khi HIV nhiễm vào tế bào chủ Protease HIV-1 là một dimer, mỗi monomer giống hệt nhau có khối lượng phân tử (KLPT) 11 kDa gồm 99 axit amin và được sắp xếp gần như theo kiểu đối xứng Mỗi một monomer tạo thành cấu trúc các phiến gấp nếp với một đoạn xoắn ngắn gần đầu C (Tie, 2006)

Như được chỉ ra ở hình 1.5, đầu N của protease HIV-1 với các axit amin 1-4

hình thành nên chuỗi β a là phần bên ngoài của bề mặt phiến gấp β Các axit amin 9-15 hình thành chuỗi β b qua một vòng quay, tiếp tục đến chuỗi β c là nơi kết thúc

vị trí bộ ba hoạt động (Asp25-Thr26-Gly27) Tiếp theo cấu trúc vòng của vị trí hoạt

động là chuỗi β d gồm các axit amin từ 30–35 Một cấu trúc vòng rộng (axit amin 36–42) liên kết với chuỗi β a’ hình thành bởi các axit amin 43–49 Các axit amin 52–66 và 69-78 lần lượt hình thành nên chuỗi β b’ và chuỗi β c’ Sau một cấu trúc vòng tạo ra bởi các axit amin 79–82, một chuỗi ngắn d’ (các axit amin 83–85) dẫn trực tiếp đến một đoạn xoắn α h (các axit amin 86–94) Đoạn xoắn h theo sau bởi một chuỗi q thẳng tận cùng bằng đầu C (các axit amin 95–99) hình thành nên phần

bên trong của bề mặt nhị phân Bốn chuỗi β trong phân tử lõi tổ chức thành phiến ψ

là đặc trưng của tất cả các protease aspartyl Các axit amin 44-57 trong mỗi tiểu

phần hình thành nên một “mũ” gồm một cặp chuỗi song song ngược nhau (a’ và một phần của b’) (Wlodawer và Vondrasek, 1998; Tie, 2006)

Cấu tạo protease HIV-1 còn có thể được chia thành ba vùng (domain) chính: vùng cuối hoặc vùng dimer hóa, vùng lõi và vùng mũ Vùng dimer hóa bao gồm 4 phần cuối của phiến β (các gốc axit amin 1-4 và 95-99 của mỗi monomer), vòng quay quanh axit amin 4-9 và chuỗi xoắn (axit amin 86-94 của mỗi monomer) Vùng này có vai trò thiết yếu trong hình thành cấu trúc dimer và ổn định hoạt tính protease HIV-1 Cấu trúc dimer sẽ được hình thành nhờ tương tác không tích điện

giữa 4 sợi của phiến  từ các gốc axit amin 1-4 (vùng N đầu cùng N), 96-99 (vùng

C tận cùng) và các gốc axit amin trong trung tâm hoạt động 24-29 Tương tác giữa các gốc Ile50 và Gly51’; Asp29, Arg87 và Arg88’ cũng ảnh hưởng đến sự ổn định của dimer Sự gắn thêm chất ức chế hoặc cơ chất sẽ tăng cường hơn nữa sự ổn định của cấu trúc dimer Vùng lõi gồm 4 phần đầu sợi β (các axit amin 10-32 và 63-85 của mỗi monomer) có vai trò quan trọng trong ổn định dimer và hoạt tính Bộ ba xúc tác Asp25-Thr26-Gly27 có tính bảo thủ trên mỗi monomer cũng nằm trong cấu trúc của vùng lõi Vùng mũ bao gồm các axit amin từ 33-43 và 44-63 bao quanh trung tâm hoạt động Phần đầu của vùng này giàu Gly tạo nên tính mềm dẻo của vùng cần thiết cho việc gắn cơ chất, giải phóng sản phẩm có vai trò quan trọng đối với hoạt tính của enzyme Nếu đột biến xuất hiện ở vị trí mũ có thể làm giảm mạnh hoạt tính của enzyme (Wlodawer và Vondrasek, 1998; Tie, 2006)

Hình 1.5 Mô hình cấu trúc của protease HIV-1 (Tie, 2006)

A: Cấu trúc bậc hai của protease với chất ức chế (hoặc cơ chất), B: Cấu trúc của protease khi có/không có chất ức chế (cơ chất) Màu đỏ thể hiện protease khi liên kết với chất ức chế (cơ chất) và màu xanh thể hiện protease khi không có chất ức chế (cơ chất)

Trung tâm hoạt động của protease chứa bộ ba Asp25-Thr26-Gly27 nằm tại mặt phân giới của dimer, được làm ổn định nhờ mạng lưới các liên kết hydro giống với các enzyme ở sinh vật nhân chuẩn Mạng lưới liên kết hydro này khá vững chắc

(hình 1.6) tạo nên sự ổn định của trung tâm hoạt động cũng như dimer Mỗi monomer đều có một bộ ba Asp-Thr-Gly với vị trí axit amin tương ứng như sau: 25 (25’) – 26 (26’) – 27 (27’) và phân tử Asp cần thiết cho cả cấu trúc và hoạt tính xúc tác của protease

Hình 1.6 Cấu trúc kẹp trong trung tâm hoạt động của protease HIV-1

(Wlodawer và Vondrasek, 1998) Nhóm cacboxyl của Asp25 tạo liên kết hydro với –NH của Gly27 Nhóm –

OH của Thr tạo liên kết hydro với hai điểm trên vùng đối diện, liên kết giữa NH của Thr (màu xanh) với gốc –CO (màu đỏ) của gốc phía trước Asp

Bên cạnh đó, bộ ba Gly86-Arg87-Asn88 của protease HIV-1 cũng là một

vùng bảo thủ cao khác đóng vai trò trong việc hình thành cấu trúc dimer Các vị trí

liên kết cơ chất gồm S3 đến S4’ chủ yếu hình thành bởi các axit amin 8, 23-30, 32, 45-50, 53, 56, 76, 80-82 và 84 Các vị trí 1-3, 5-9, 23-27, 29, 47-52, 54, 67, 81, 87

và 90-99 góp phần liên hệ giữa bề mặt dimer Các chất ức chế hoặc cơ chất liên kết giữa hai tiểu phần bằng liên kết hydro và tương tác van der Waals với vị trí hoạt động gồm hai bộ ba đặc trưng và hai mũ linh hoạt Các mũ gấp xuống cơ chất hoặc các chất ức chế và hoạt động trong suốt quá trình xúc tác cùng với việc liên kết cơ

chất cũng như loại trừ khỏi trung tâm hoạt động Có một phân tử nước được giữ lại

hình thành nên cầu nối giữa nhóm CO ở liên kết P2-P1’ giữa chất ức chế và nhóm –NH- của Ile 50/50’ –NH- ở các mũ Phân tử nước này rất cần thiết cho hoạt tính thủy phân của protease và có thể bị thay thế bởi một nhóm carbonyl có trong chất

ức chế thích hợp nào đó

Ceccherini-Silberstein và tập thể (2004) đã nghiên cứu về mức độ bảo thủ của protease HIV-1 khi có mặt cũng như vắng mặt các chất ức chế protease từ kết quả giải trình tự gen mã hóa protease HIV-1 của 475 bệnh nhân chưa dùng thuốc và

639 bệnh nhân có sử dụng PI Kết quả phân tích trên các bệnh nhân không dùng thuốc cho thấy 68 trong số 99 axit amin có mức độ bảo thủ cao (chiếm 69%) Các tác giả cũng chỉ ra 5 vùng khá bảo thủ của protease ở các bệnh nhân này và hầu hết đều là các vùng có chức năng quan trọng như vùng N đầu cùng (P1-P9), vùng C tận cùng (G94-F99), vùng trung tâm hoạt động (E21-V32), vùng mũ (P44-V56) và vùng G78-N88 Trong khi đó, trình tự axit amin của protease HIV-1 phân lập từ các bệnh nhân sử dụng thuốc ức chế protease lại có sự thay đổi đáng kể, chủ yếu do các đột biến kháng thuốc ức chế protease Có 45 trong số 99 axit amin thể hiện tính bảo thủ (chiếm 45% so với 69% ở các bệnh nhân không sử dụng thuốc) Hơn nữa, khi

so sánh với các bệnh nhân không sử dụng thuốc, các vùng N đầu cùng và vùng C tận cùng là khá bảo thủ, trong đó có sự thay thế C95 với xác suất dao động từ 0,6% đến 2,7% Tất cả các vùng bảo thủ lớn khác (E21-V32, P44-V56, G78-N88) cũng ít bảo thủ hơn cụ thể là D25-D29, G49-G52, G78-P81 và G86-R87

Cho đến nay, hầu hết các nghiên cứu về cấu trúc protease HIV-1 đều của nhóm B, trong khi đó theo Bandaranayake và tâ ̣p thể (2008) thì sự khác nhau về trình tự axit amin giữa các phân nhóm HIV-1 gần đây được xem là cũng có vai trò quan trọng trong các cơ chế kháng thuốc ở protease HIV-1 Các tác giả này đã xác định cấu trúc của protease HIV-1 phân nhóm CRF01_AE và so sánh với phân nhóm

B Bằng cách sắp xếp các nguyên tử C chồng lên nhau, các tác giả cho thấy có sự tương đồng cao giữa cấu trúc của protease HIV-1 phân nhóm B với phân nhóm CRF01_AE, độ lệch chỉ có 0,37 Ao Tuy nhiên, trong cấu trúc của protease HIV-1 phân nhóm CRF01_AE có sự sắp xếp lại từ gốc axit amin 33-39 và gần vùng lõi (gốc axit amin 16-22) Sự khác nhau về cấu trúc ở cả trên hai monomer Chuỗi bên ngắn hơn của Ile36 được ổn định qua tương tác van der Waals với chuỗi bên của Asn18, Leu38 và Arg20 qua đó cho phép vùng mũ tiến lại gần hơn vùng lõi khi so sánh với chuỗi bên Met36 trong cấu trúc protease phân nhóm B Phần cong của vùng mũ hướng về vùng lõi thúc đẩy sự hình thành liên kết hydro giữa –C0 của Asp35 và NH2- của Arg20 Tương tác này làm cho chuỗi bên Asp35 hướng vào

vùng lõi So với chuỗi bên Glu35 dài hơn của phân nhóm B hướng ra ngoài vùng hòa tan, cho phép oxy của H2O hình thành liên kết hydro với NH- của Arg57 Vị trí chuỗi bên Arg57 cho phép hydro của NH2 tạo liên kết hydro với CO- của Met36 Chuỗi bên Arg57 của CRF01_AE không liên quan đến tạo bất cứ tương tác nào với vùng mũ Nghiên cứu cũng cho thấy sự kém linh động hơn của vùng mũ do cấu trúc chặt chẽ hơn trong cấu tạo protease HIV-1 phân nhóm CRF01_AE so với phân nhóm B, dẫn đến tính đặc hiệu và hiệu quả xúc tác của protease phân nhóm CRF01_AE thấp hơn so với protease phân nhóm B Hơn nữa, sự đa hình xảy ra bên trong những vùng này được xem ảnh hưởng đến ái lực gắn với PI và làm thay đổi mức độ kháng thuốc với một số chất ức chế nhất định so với protease phân nhóm B

1.2.2 Hoạt tính phân cắt cơ chất của protease HIV-1

Protease HIV-1 có hoạt tính phân cắt các polyprotein tiền thân gag và pol của virus Nó cắt tất cả các vị trí dành cho proteolytic trên các protein của virus, ngoại trừ liên kết giữa gp120 và gp41 là của convertase furin hoặc protease giống furin (furin-like protease) của tế bào chủ Trung tâm xúc tác chính của protease bao gồm bộ ba Asp25, Thr26 và Gly27; nếu đột biến xảy ra tại Asp25 sẽ dẫn đến mất hoạt tính của protease HIV-1 Protease HIV-1 cũng có hoạt tính tự cắt xảy ra sau khi protein gag-pol hình thành dimer hóa, qua đó cho phép giải phóng chính nó ra khỏi polyprotein tiền thân Hoạt tính của protease HIV-1 là tuyệt đối cần thiết cho quá trình hình thành virus hoàn chỉnh dẫn đến vai trò quan trọng của protease trong liệu pháp dùng thuốc chống HIV-1 Một trong các chất ức chế hoạt tính protease HIV-1 được phát hiện sớm nhất là pepstatin A - chất ức chế protease aspartyl – làm mất hoạt tính của protease HIV-1 dẫn đến tạo ra các chủng virus không hoàn chỉnh

gag-và không có khả năng nhiễm gag-vào tế bào chủ (Seelmeier gag-và tập thể, 1988)

Cơ chế xúc tác của protease HIV-1 là tương tự với các protease aspartyl Cụ thể, protease sử dụng một phân tử H2O hoạt hóa để gắn với carbonyl trên liên kết amide của cơ chất Sự hoạt hóa phân tử H2O có được bởi cả hai nhóm -carboxy aspartyl tại trung tâm hoạt động (Brik và Wong, 2003) Dầu vậy, cơ chế xúc tác của protease HIV-1 vẫn còn là vấn đề gây nhiều tranh cãi Các protease của virus như các protease HIV-1 rất khác nhau về cấu trúc bậc ba và bậc bốn khi so sánh với protease của tế bào hay các protease giống pepsin khác Protease HIV-1 có hoạt tính

xúc tác khi ở dạng dimer với một phần Asp xúc tác và một phần mũ từ mỗi tiểu đơn

vị, còn protease giống pepsin hoạt động như một đơn phân với một phần Asp xúc tác từ một trong hai khu vực của một vùng mũ duy nhất Nhìn chung, phản ứng là xúc tác axit-bazơ gồm cả thay đổi vật lý (như sự tạo nếp gấp của các mũ xuống cơ chất) và hóa học (hình thành và tách ra cấu trúc tứ diện trung gian) Không giống như protease serine và protease cysteine, protease HIV-1 không có liên kết đồng hóa trị giữa acyl-enzyme trung gian được hình thành trong suốt quá trình này Hiệu quả của quá trình cắt phụ thuộc vào trình tự axit amin của cơ chất (Tie, 2006)

Trình tự các vị trí cắt của protease HIV-1 trên protein gag và gag-pol được thể hiện ở bảng 1.1 Tại vị trí P1 và P1’, các gốc kỵ nước kích thước lớn chiếm ưu thế nhưng không có Val và Ile Pro thường xuất hiện tại P1’, hầu như không có ở P1, trong khi đó Phe chủ yếu xuất hiện ở P1 Các gốc phân cực kích thước nhỏ thường xuất hiện ở P2, P2’; các gốc đa dạng hơn từ P3 trở đi và thường là glutamine hoặc các gốc axit amin cơ bản, P4 thường là axit amin nhỏ Vị trí cắt ưa thích của protease HIV-1 là liên kết Aro-Pro, trong đó Aro là Tyr, Phe hoặc Trp

Bảng 1.1 Trình tự các vị trí cắt của protease HIV-1 trên protein gag và gag-pol

(Tie, 2006)

Các vị trí cắt P4 P3 P2 P1 P1’ P2’ P3’

Trên protein gag

Trên protein pol

TFP-p6pol Asp Leu Ala Phe Leu Gln Gly

p6pol - PR Ser Phe Asn Phe Pro Gln Ile

RT-IN Arg Lys Ile Leu Phe Leu Asp

Năm 1987, Debouck và tập thể đã biểu hiện được ở vi khuẩn E coli gen

protease HIV-1 tạo ra protease có hoạt tính tự cắt Kết quả giải trình tự axit amin cho thấy trình tự đầu N của protease hoàn toàn trùng với trình tự phân cắt được giả định Pro-Gln-Ile-Thr-Leu Quá trình tự cắt từ polyprotein tiền thân để tạo protease trưởng thành cũng xảy ra tương tự trong các tế bào nhiễm HIV-1

1.2.3 Các phương pháp xác định hoa ̣t độ protease HIV-1

Vì protease HIV-1 không thủy phân các protein thông thường nên việc xác định hoạt độ của protease phải dựa trên các trình tự cắt của protease HIV-1 để tổng hợp các cơ chất phù hợp Tùy vào chất hóa học khác nhau gắn với chuỗi peptide cơ chất sẽ có phương pháp đo hoạt độ thích hợp, một số kỹ thuật đó bao gồm:

i) Phương pháp sắc ký lỏng cao áp (HPLC) với cơ chất sinh màu tổng hợp

có vị trí cắt đặc hiệu cho protease HIV-1, sản phẩm cắt được định lượng bằng HPLC Phương pháp tiêu tốn nhiều thời gian, không thích hợp khi làm với nhiều mẫu và không liên tục (Leuthardt và Roesel, 1993)

ii) Phương pháp quang phổ kế với cơ chất peptide có liên kết đặc hiệu của protease HIV-1 và hấp thụ cực đại tại bước sóng nhất định trong vùng tử ngoại Dưới tác dụng của protease, liên kết bị cắt và cho độ hấp thụ giảm dần tại bước sóng đó theo thời gian (Nashed và tâ ̣p thể , 1989; Richards và tâ ̣p thể , 1990) Dựa trên nguyên tắc này, năm 1990, Richard và tập thể đã tổng hợp 11 peptide dựa trên trình tự 7 axit amin tương ứng với vị trí phân cắt của liên kết giữa p17 và p24 trên polyprotein gag để phân tích hoạt độ protease HIV-1 11 cơ chất này có gốc P1 là norleucine (Nle), Met, Phe hoặc Tyr và gốc P1’ là Ala được thay thế bằng 4-NO2-phenylalanine (Nph) Liên kết P1-P1’ hấp thụ cực đại trong dải bước sóng 284-324

nm, khi bị cắt sẽ mất tính chất cho độ hấp thụ giảm dần theo thời gian trên máy quang phổ Phương pháp được thực hiện nhanh, không tiêu tốn thời gian, liên tục và cho số liệu đủ chính xác

iii) Quang phổ huỳnh quang sử dụng cơ chất gắn huỳnh quang Năm 1992, Taylor và tập thể đã tổng hợp cơ chất phát huỳnh quang (DABCYLS-SerGlnAsnTyrProIleValGln-EDANS) để đo hoạt độ protease HIV-1 Đối với cơ chất ban đầu, sự phát huỳnh quang của EDANS được dập tắt bởi sự chuyển năng lượng đến DABCYLS Khi phân cắt xảy ra trên chuỗi peptide tại liên kết Tyr-Pro

làm DABCYLS tách dần khỏi EDANS; mức độ giải phóng EDANS thể hiện qua cường độ huỳnh quang tăng lên phản ánh mức độ hoạt động của enzyme Phương pháp này tiến hành nhanh, dễ thao tác và có độ nhạy, độ đặc hiệu cao hơn khi sử dụng quang phổ thông thường với cơ chất tổng hợp và được xem là phương pháp hiện đại nhất hiện nay để xác định hoạt độ protease HIV-1

Hiện nay, trên thị trường có rất nhiều cơ chất tổng hợp sẵn của Sigma để xác định hoạt tính của protease HIV-1 bằng quang phổ kế và HPLC Hãng Anaspec (Mỹ) có kit protease HIV-1 Sensolyte 490 dùng để xác định hoạt độ protease HIV-1 bằng quang phổ huỳnh quang Ngoài ra, hãng còn có hai loại kit khác có bước sóng kích thích và phát ra trong vùng nhìn thấy thuận tiện cho xác định hoạt độ protease HIV-1

1.2.4 Chức năng sinh học của protease HIV-1

Protease có vai trò quan trọng trong quá trình nhân lên của HIV-1 Protease HIV-1 cắt các chuỗi polyprotein (gag, gag-pol) thành các protein cấu trúc và chức năng cần thiết cho virus hoàn chỉnh Cụ thể, protease HIV-1 nhận biết và cắt các

liên kết khác nhau trên polypeptide gag để tạo thành các protein cấu trúc: matrix

P17 (MA), capsid p24 (CA), nucleocapsid p7 (NC) có vai trò trong quá trình lắp ráp

và xác định hình thái của lớp vỏ virus trưởng thành cùng với 3 protein nhỏ (p6, p2

và p1) chưa rõ chức năng; thủy phân polypeptide gag-pol tạo thành 3 enzyme: protease, reverse transcriptase và integrase cần thiết cho quá trình sao chép của HIV (Darke và tâ ̣p thể , 1989; Alastair và Wood , 1998) Các thí nghiệm in vitro với

protease HIV-1 tinh sạch cũng khẳng định enzyme có khả năng cắt polypeptide gag tiền thân Hình 1.7 thể hiện các vị trí cắt của protease HIV-1 trên các polyprotein gag và gag-pol

Mặc dù, các tế bào ở động vật có vú cũng có protease aspartyl nhưng chúng không có khả năng cắt các polyprotein gag, gag-pol Cơ chất đặc hiệu của protease HIV-1 là gag, gag-pol và không phải là đích tác động của các protease ở động vật

có vú Ngược lại, protease HIV-1 không những cắt các polyprotein của chính nó mà còn thủy phân rất nhiều protein của vật chủ như actin, Bcl2 (B-cell lymphoma 2 – protein điều hòa apoptosis), procaspase 8 (Shedlock và tâ ̣p thể , 2008) Việc xác định cơ chất đặc hiệu của protease HIV-1 cho phép đo hoạt độ của enzyme

Khi ức chế hoạt tính của protease HIV-1 hoặc gây đột biến trên gen mã hóa protease HIV-1, virus không thể đóng gói để tạo thành virion hoàn chỉnh; vì vậy, chúng không có khả năng xâm nhiễm vào tế bào vật chủ (Darke và tâ ̣p thể, 1989).

Ngoài quá trình lây nhiễm, protease HIV-1 còn đóng vai trò trong quá trình phát sinh bệnh Khi vào tế bào người, protease HIV-1 gây độc và cắt nhiều protein của vật chủ Cụ thể, protease HIV-1 cắt procaspase 8 không hoạt hóa thành caspase 8 hoạt hóa dẫn đến cắt Bid thành tBid làm rối loạn quá trình thủy phân, tạo ra những rối loạn trong ty thể và kích thích khả năng thấm qua màng ty thể phụ thuộc Bax/Bak Kết quả làm ty thể giải phóng cytochrome c và phân mảnh nhân Hiện tượng này chỉ phát hiện thấy ở các tế bào lympho T CD4 và dẫn đến chết theo chương trình (apoptosis) phụ thuộc vào kích thích của caspase

8 Các nghiên cứu cũng khẳng định rằng sử dụng các chất ức chế protease có thể ngăn chặn hiện tượng chết theo chương trình do protease HIV-1 gây nên (Shedlock và tâ ̣p t hể, 2008)

1.2.5 Nhân dòng, biểu hiện và tinh sạch protease HIV-1

Do kháng nguyên HIV-1 biến đổi liên tục dẫn đến thất bại trong sản xuất vaccine nên bệnh nhân nhiễm HIV-1 muốn duy trì cuộc sống chỉ có con đường duy nhất là dùng thuốc Protease có vai trò không thể thiếu trong chu trình sống của

Hình 1.7 Các vị trí cắt của protease HIV-1 trên polyprotein gag và gag-pol

(Alastair và Wood, 1998)

HIV-1 nên được xem là một trong các đích quan trọng nhất trong liệu pháp điều chế thuốc ức chế protease chống HIV-1 Để phát hiện và tổng hợp các thuốc ức chế hiệu quả thì thu nhận một lượng lớn protease HIV-1 là rất cần thiết Tuy nhiên, các nhà nghiên cứu không thể tách chiết trực tiếp protease từ HIV-1 vì lượng này quá nhỏ, cũng không thể sử dụng các protease tương tự khác làm mô hình vì protease HIV-1 cắt cơ chất rất đặc hiệu Chính vì vậy, thiết lập hệ thống biểu hiện và tinh sạch protease HIV-1 tái tổ hợp có vai trò quan trọng trong tìm và phát triển các thuốc

ức chế protease chống HIV/AIDS Ngay từ khi HIV được phát hiện cho đến nay

đã có nhiều công trình nghiên cứu để sản xuất protease HIV-1 tái tổ hợp bằng cách

biểu hiện trên vi khuẩn E coli hoặc trên nấm men Saccharomyces cerevisiae hoặc

bằng cách tổng hợp hóa học monomer 99 axit amin Tuy nhiên, quá trình sản xuất protease HIV-1 phải đối mặt với nhiều vấn đề khó khăn trong việc biểu hiện và

và khi gây đột biến thay Asp-25 thành Asn, protease chỉ còn 1% hoạt tính so với dạng protease nguyên bản ban đầu Tuy nhiên, protease HIV-1 biểu hiện thấp, chỉ chiếm 0,02% protein tổng số của tế bào, với hiệu suất thu hồi 7% ở bước tinh sạch cuối cùng và băng protease chỉ phát hiện được bằng thẩm tách miễn dịch với kháng thể đặc hiệu

Danley và tập thể (1989) cũng sử dụng promoter trp nhưng trên vector

pHIVexpo15, bổ sung tryptophan vào sau pha log trong nuôi cấy tế bào cùng với sử dụng môi trường M9 đã giúp tăng biểu hiện protease HIV-1 lên mức 0,1% protein tổng số của tế bào với hiệu suất thu hồi protease HIV-1 tái tổ hợp sau bước tinh sạch cuối cùng là 30% Tuy nhiên, quy trình tinh sạch protease HIV-1 khá phức tạp

bao gồm các bước sắc ký trao đổi anion DEAE-sepharose, S-sepharose Fast Flow, superose 12 và mono S cùng với các bước thẩm tách và đổi đệm giữa các cột

Năm 1990, Cheng và tập thể đã sử dụng tế bào E coli JM105 đồng nhiễm với phage αCE6 để biểu hiện và tinh sạch protease HIV-1 dưới promoter T7 ở hệ

thống vector pET3AM Protease HIV-1 thu được chủ yếu ở trong phân đoạn tủa tế bào, sau đó được hòa tan bằng urea 8 M, tinh sạch, hồi tính để thu được dạng hoạt động và thử hoạt tính với cơ chất tổng hợp Kết quả, protease HIV-1 được tinh sạch với hiệu suất 20 mg từ 1 lít môi trường nuôi cấy, có khả năng phân giải peptide với hoạt độ 450 nmol/phút/mg protein, một bước tinh sạch qua cột tiếp theo làm tăng hoạt độ lên 800 nmol/phút/mg Khi so sánh với protease HIV-1 thu được từ các điều kiện không biến tính cho thấy protease ở dạng biến tính sau đó sẽ được hồi tính hiệu quả Tuy nhiên, khi biểu hiện trên hệ thống bắt buộc phải nhiễm phage  mang T7 RNA polymerase vào tế bào vi khuẩn Sự có mặt của phage có thể không thích hợp cho các quá trình lên men để sản xuất lớn (Taylor và tâ ̣p thể, 1992)

Năm 1992, Rangwala và tập thể đã nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến quá

trình biểu hiện protease HIV-1 ở vi khuẩn E coli Theo nhóm tác giả này, trình tự

gen mã hóa protease HIV-1 ảnh hưởng đến mức độ biểu hiện proteae HIV-1 Nếu dùng thể nhân dòng cDNA, lượng protease HIV-1 biểu hiện thường thấp và chỉ có thể phát hiện được bằng thẩm tách miễn dịch Vấn đề có thể được giải quyết bằng

cách tổng hợp gen mã hóa protease với các codon mà E coli ưa thích và giàu A+T

Kết quả sử dụng trình tự gen giàu A+T đã giúp các tác giả tăng mức độ biểu hiện

protease lên 50-100 lần Biểu hiện bằng các promoter lacUV5 sẽ giảm tính độc và tăng mức độ biểu hiện protease HIV-1 hơn so với promoter recA Biểu hiện

protease dung hợp với các protein khác qua trình tự tự cắt dẫn tới tạo ra protease HIV-1 có hoạt tính với Pro mở đầu Với những cải tiến đó, lượng protease sau biểu hiện có thể tăng lên và chiếm từ 8-10% protein tổng số của tế bào Nghiên cứu cũng cho thấy rằng, protease HIV-1 tái tổ hợp không thể biểu hiện một cách đơn giản như

các protein tái tổ hợp khác ở vi khuẩn E coli

Leuthardt và Roesel (1993) đã nhân dòng, biểu hiện và tinh sạch protease

HIV-1 tái tổ hợp bằng hệ thống vector pDS56/3H-3H ở E coli Với hệ thống biểu

hiện này, protease được gắn thêm 3 gốc histidine (3xHis) ở đầu N và đầu C để

thuận tiện cho quá trình tinh sạch Nghiên cứu cho thấy 90% protease HIV-1 sau biểu hiện thu được ở phân đoạn tủa của tế bào vi khuẩn (pellet) và được hòa tan hiệu quả bằng đệm ly giải có guanidine 6 M Sau khi tinh sạch bằng cột sắc ký ái lực Ni-agarose, protease tái tổ hợp được hồi tính và có hoạt tính cắt cơ chất gag p55 của HIV-1 và cơ chất tổng hợp đặc hiệu giống như protease tự nhiên Protease tái tổ hợp bị ức chế hoàn toàn bởi pepstatin A ở nồng độ 11 M

Năm 2000, Rozzelle và tập thể đã biểu hiện các protease HIV-1 kiểu dại

(WT protease HIV-1 – không bị đột biến) và ở dạng đột biến trong E coli bằng

cách sử dụng vector pTacTac Protease HIV-1 được dung hợp với protein CheY tại đầu N giúp tăng cường tốc độ phiên mã nhờ ái lực cao của gen mã hóa CheY với các ribosome Để hiệu quả dịch mã cao, một liên kết bicistron được nối giữa protein CheY và protease HIV-1 Kết quả nghiên cứu cho thấy, sự liên kết giữa monomer protease HIV-1 bình thường với monomer đột biến tạo thành heterodimer protease HIV-1 không có hoạt tính Tương tác dimer tạo cấu trúc heterodimer bền nhiệt hơn,

ít gây độc tế bào hơn nhưng kém tan hơn so với dạng homodimer Hiểu rõ cơ chế hoạt động của chất ức chế với sự hình thành heterodimer là cơ sở để phát triển các chất ức chế liên quan đến tương tác hình thành dimer hóa giúp cản trở sự xuất hiện các chủng kháng thuốc hơn so với các PI hiện đang sử dụng

Năm 2007, Chen và tập thể đã sử dụng hệ thống biểu hiện bên ngoài tế bào

(E coli cell-free system của hãng Roche) để biểu hiện trực tiếp protease HIV-1 trong điều kiện in vitro Để nhân bản DNA cho biểu hiện protein in vitro, hai phản

ứng PCR đã được tiến hành Phản ứng PCR thứ nhất nhân bản đoạn gen mã hóa protease HIV-1 đặc hiệu Trong phản ứng PCR thứ hai, His-tag và các nhân tố điều hòa cần thiết cho biểu hiện protein ở hệ thống tế bào nhân sơ dựa trên T7

polymerase (promoter T7, vị trí liên kết ribosome vi khuẩn - RBS, terminator T7,

mã mở đầu, mã kết thúc) được bổ sung vào Sản phẩm PCR cuối cùng có thể biểu hiện trực tiếp protein không cần bất kỳ bước tinh sạch nào Phân tích phân đoạn hòa tan và không tan của hệ thống biểu hiện bằng điện di protein cho thấy thu nhận được protease mong muốn chủ yếu ở phân đoạn hòa tan Ưu điểm của phương pháp này là biểu hiện được những protein khó tan, gây độc với tế bào khi biểu hiện ở vi khuẩn (protein màng, protein ở người, protein có đặc tính kháng sinh…), không

phải tiêu tốn thời gian cho các bước nhân dòng, biểu hiện và tinh sạch Tuy nhiên, thể tích phản ứng nhỏ nên lượng protease HIV-1 thu nhận được sau khi kết thúc quy trình không cao, chưa đến 100 μg protein Mặt khác, nghiên cứu chưa kiểm tra hoạt tính của protease HIV-1 thu nhận được

Nhiều nhóm nghiên cứu đã thông báo biểu hiện được protease HIV-1 ở E coli

bằng cách thiết kế các vector khác nhau Tuy nhiên, tất cả các số liệu đều cho thấy biểu hiện protease HIV-1 có hoạt tính là gây độc giết chết tế bào vi khuẩn (Danley và

tâ ̣p thể, 1989; Baum và tâ ̣p thể , 1990; Cheng và tâ ̣p thể , 2006) Một trong các lý do được dự đoán là protease HIV-1 có thể đã thủy phân các protein chức năng của tế bào (Danley và tập thể, 1989) Phỏng đoán này đặt ra một thách thức cho nghiên cứu biểu hiện protease HIV-1 ở vi khuẩn Để hạn chế tính độc này, một vài nhóm nghiên cứu đã nhân dòng và biểu hiện protease HIV-1 bằng cách sử dụng các hệ thống và

quy trình biểu hiện khác nhau như sử dụng các promoter trp, λP L , T7, araBAD và tac

(Darke và tâ ̣p thể , 1989; Taylor và tâ ̣p thể , 1992; Komai và tâ ̣p thể , 1997) Nghiên cứu biểu hiện protease dưới dạng dung hợp với nhiều protein khác nhau để tăng tính tan của protease như -galactosidase, dihydrofolate reductase, -lactamase, maltose hoặc gắn với phân tử IgG (Taylor và tâ ̣p thể , 1992; Louis và tâ ̣p thể , 1994;

Dergousova và tâ ̣p thể, 1996)

Nhìn chung, các nghiên cứu về biểu hiện protease HIV-1 cho thấy quá trình sản xuất enzyme này gặp nhiều khó khăn do: i) protease gây độc với tế bào chủ, chủ yếu được biểu hiện ở dạng không hòa tan (90% ở dạng thể vùi) (Debouck và tâ ̣p thể, 1987; Cheng và tâ ̣p thể 1990; Tomasselli và tâ ̣p thể, 1990; Leuthardt và Roesel, 1993); ii) hàm lượng thu được chưa cao, một số nghiên cứu chỉ có thể phát hiện bằng phương pháp thẩm tách miễn dịch (Rangwala và tập thể , 1992); iii) phần lớn các nghiên cứu cũng cho thấy, protease HIV-1 tái tổ hợp chỉ có hoạt tính khi ở dạng dimer; đều biểu hiện protease ở dạng tự cắt khỏi trình tự cắt đặc hiệu thường là giữa Phe/Tyr – Pro để giải phóng protease HIV-1 mở đầu bằng axit amin Pro (Debouck

và tập thể, 1987; Graves và tập thể, 1988; Darke và tâ ̣p thể, 1989; Taylor và tâ ̣p thể, 1992; Mildner và tập thể , 1994) Chính vì vậy, một số nghiên cứu đã đưa plasmid

pLysS hoặc pLysE vào tế bào E coli để hạn chế tính độc và dung hợp protease với

các protein khác nhằm làm tăng hiệu suất biểu hiện, tăng tính tan và thuận tiện cho

tinh sạch nhưng vẫn đảm bảo hoạt tính (Louis và tâ ̣p thể , 1991; Taylor và tâ ̣p thể , 1992; Dergousova và tâ ̣p thể, 1996)

Từ năm 1995 trở lại đây, các nghiên cứu tập trung biểu hiện protease HIV-1 tái tổ hợp mang những đột biến đặc hiệu nhằm làm sáng tỏ cơ chế đột biến kháng thuốc, ái lực của protease đột biến với cơ chất, phân tích cấu trúc tinh thể của các dạng protease và trong phức hợp với các chất ức chế nhằm làm cơ sở tìm ra các chất

PI mới có hiệu lực cao (Rozzelle và tâ ̣p thể , 2000; Ohtaka và tâ ̣p thể , 2003; Yanchunas và tâ ̣p thể , 2005; Bandaranayake và tâ ̣p thể , 2008) Năm 2008, Bandaranayake đã biểu hiện và tinh sạch chế phẩm protease HIV-1 tái tổ hợp từ phân nhóm CRF01_AE cho nghiên cứu cấu trúc tinh thể của protease trong phức hợp với cơ chất và so sánh với cấu trúc protease HIV-1 phân nhóm B bằng cách sử dụng quy trình của Rose và tập thể (1993) Theo quy trình này, protease HIV-1 được biểu hiện từ vector pSOD/PR179, sau 3 bước tinh sạch (qua các hệ thống cột DEAE-sepharose, S-sepharose và pepstatin–agarose) đã thu được 5 mg protease HIV-1 từ 10

g tế bào E coli Tuy vậy, kết quả kiểm tra độ sạch trên SDS-PAGE, ngoài protease

HIV-1 vẫn còn lẫn 1 băng protein tạp nhiễm kích thước 14 kDa

Ở Việt Nam, protease là một trong số những enzyme được nghiên cứu nhiều nhất trong những thập kỷ qua và các nghiên cứu chủ yếu là điều tra, tách chiết và nghiên cứu một số tính chất trên đối tượng vi sinh vật Các nghiên cứu về protease HIV-1 thường tập trung vào xác định nhóm virus gây bệnh chủ yếu ở người Việt Nam và tìm ra một số đột biến liên quan đến tính kháng thuốc (Nguyen và tâ ̣p thể , 2003; Ishizaki và tâ ̣p thể, 2009; Liao và tâ ̣p thể, 2009; Phan và tập thể, 2010)

Ngoài ra , liên quan đến các nghiên cứu về protein của HIV có thể kể đến công trình của Phan Trọng Hoàng và tập thể (2007) đã nhân dòng và biểu hiện được

gen mã hóa tiểu đơn vị P66 của reverse transcriptase của HIV-1 ở E coli để dùng

cho các phản ứng tổng hợp cDNA từ RNA và tạo bộ kit chẩn đoán nhiễm retrovirus Tuy vâ ̣y, các tác giả chưa thu nhận được enzyme tái tổ hợp ở d ạng tinh sa ̣ch Đồng Văn Quyền và tập thể (2008), Bạch Thị Như Quỳnh và tập thể (2011) cũng đã biểu hiện thành công 3 gen mã hóa cho các kháng nguyên GP41, GP120 và P24 của HIV

ở E coli và bước đầu ứng dụng chúng trong phát hiện kháng thể kháng HIV trong

huyết thanh bệnh nhân bằng kỹ thuật phân tích miễn dịch

Tóm lại, mặc dầu đã có khá nhiều công trình nghiên cứu khác nhau ở trong nước về gen và protein của HIV, nhưng cho đến nay chưa có công trình nào công

bố về biểu hiện, tinh sạch và nghiên cứu tính chất của protease từ HIV-1 gây nhiễm trên các bệnh nhân ở Việt Nam

1.2.6 Các đô ̣t biến kháng thuốc ức chế protease HIV-1

Sự ra đời của các thuốc ức chế protease và thuốc ức chế reverse transcriptasekhông phải nucleoside vào năm 1995 đã bắt đầu kỷ nguyên trị liệu kháng retrovirus hiệu lực cao, tạo ra những tiến bộ vượt bậc về giảm tỷ lệ nhiễm và tử vong do HIV cũng như giảm rõ rệt các nhiễm trùng cơ hội và khối u Tuy nhiên, việc sử dụng ART trong thời gian dài với nồng độ cao dẫn đến sự xuất hiện các chủng virus kháng thuốc là một trong những nguyên nhân chính gây thất bại trong điều trị Nếu kháng với nhiều nhóm thuốc thì các phác đồ thay thế là rất hạn chế và tác dụng của thuốc chỉ duy trì được trong thời gian ngắn Sự xuất hiện nhanh chóng các chủng kháng thuốc còn do tốc độ sinh sản nhanh của HIV–1, có khoảng 10 triệu hạt virus mới được tạo ra mỗi ngày và tỷ lệ sai sót rất cao của reverse transcriptase (1/10.000 base) Điều này dẫn đến tốc độ đột biến rất cao của HIV và HIV luôn tạo ra những chủng mới, thậm chí cả khi không điều trị Khi có ART, các chủng mang đột biến kháng được chọn lọc và trở thành chủng ưu thế (Hoffmann và tập thể, 2007)

Các phương pháp xét nghiệm kháng thuốc

Có hai phương pháp xét nghiệm kháng thuốc hiện đang được lưu hành trên thị trường đó là: xét nghiệm kháng thuốc kiểu gen và xét nghiệm kháng thuốc kiểu hình (Wilson, 2003)

Xét nghiệm kháng thuốc kiểu gen dựa trên phân tích các đột biến liên quan tới kháng thuốc bằng cách giải trình tự gen của virus sau khi đã được nhân bản hoặc bằng các kỹ thuật lai đặc hiệu với các oligonucleotide kiểu dại hoặc kiểu kháng thuốc

Người ta chú ý nhất đến vùng pol mã hóa cho các enzyme của virus (protease, reverse transcriptase và integrase) và vùng env (mã hóa cho glycoprotein

vỏ với 2 tiểu phần gp41 và gp120) Các xét nghiệm kiểu gen chỉ phát hiện các chủng đột biến chiếm ít nhất 20-30% tổng số virus trong cơ thể và chỉ là một phép

đo kháng thuốc gián tiếp Các đột biến gây giảm ái lực với các chất ức chế enzyme

đã được mô tả rất rõ cho đa số các thuốc kháng HIV, nhưng do có nhiều loại hình đột biến khác nhau, có thể có các đột biến bù trừ, nên việc đánh giá mức độ kháng thuốc đối với 1 thuốc nhất định là khó

Xét nghiệm kháng thuốc kiểu hình là cách trực tiếp đo mức độ nhạy cảm với thuốc của virus Tốc độ nhân bản của virus được đo trên các môi trường nuôi cấy tế bào dưới áp lực chọn lọc của thuốc với nồng độ tăng dần và so sánh với tốc độ nhân bản của virus kiểu dại Nồng độ thuốc được biểu thị bằng giá trị IC50 - là nồng độ thuốc cần để ức chế 50% sự nhân bản của virus Độ nhạy của virus được tính bằng

tỷ số giữa IC50 của virus xét nghiệm và IC50 của virus kiểu dại tính theo số lần và so sánh với giá trị ngưỡng (cut-off value) Giá trị ngưỡng chính là giá trị cho phép của

tỷ số giữa IC50 của virus xét nghiệm và virus kiểu dại mà tại đó chủng HIV xét nghiệm vẫn còn nhạy Xác định giá trị ngưỡng rất quan trọng khi đánh giá kết quả kháng thuốc Hạn chế của phương pháp là thời gian kéo dài và giá thành đắt gấp đôi khi sử dụng xét nghiệm kháng thuốc kiểu gen

Nhược điểm của cả hai phương pháp là đều cần một lượng virus nhất định để xét nghiệm Nếu tải lượng virus dưới 500-1000 bản sao/ml thì cả hai phương pháp đều không thể phát hiện được virus

không phải B và bù lại sự suy giảm hoạt động của protease do đột biến chính gây ra (Nijhuis và tập thể, 1999; Johnson và tập thể, 2006)

Sự lây truyền các chủng HIV-1 kháng thuốc

Tỷ lệ các đột biến xuất hiện ở bệnh nhân chưa điều trị rất khác nhau giữa các vùng địa lý Tỷ lệ cao tới 20% đã gặp ở các thành phố lớn của Mỹ, nơi có nhiều người đồng tính nam và ART đã được sử dụng trong thời gian dài (Hoffmann và tập thể, 2007) Trong nghiên cứu của Wensing và tập thể (2003) trên 2.208 bệnh nhân mới được phát hiện nhiễm HIV trong thời gian từ năm 1996 đến 2002 thì tỷ lệ kháng thuốc mang đột biến chính là 10,4% Trong đó, tỷ lệ đột biến NRTI giảm theo thời gian; tỷ lệ đột biến NNRTI tăng còn tỷ lệ đột biến PI vẫn duy trì ổn định Các đột biến được phát hiện chủ yếu ở HIV-1 phân nhóm B Tuy nhiên, tỷ lệ mang đột biến ở các virus không phải phân nhóm B có xu hướng tăng theo thời gian Các nghiên cứu từ 2002-2003 trên 1.050 bệnh nhân cho thấy 9,1% bệnh nhân mới được chẩn đoán nhiễm HIV đã mang virus kháng thuốc; dưới 1% bệnh nhân mang virus kháng với 2 nhóm thuốc (Wensing và tập thể, 2005) Trên thực tế, tỷ lệ lây truyền virus đột biến có thể cao hơn vì quần thể virus chiếm dưới 20-30% thường không phát hiện được bằng các kỹ thuật phát hiện đột biến thông thường

Các đột biến kháng thuốc ở HIV-1

Trong các đột biến kháng thuốc thì phổ các đột biến kháng PI rất rộng có thể

do sự đa hình xảy ra ở 49 gốc axit amin trong tổng số 99 axit amin của protease Mặc dù có sự kháng chéo từ mức độ vừa đến mức độ cao giữa các PI, các đột biến chính là tương đối đặc hiệu cho từng thuốc riêng biệt Phần lớn các dữ liệu về đột biến chính phát sinh từ các bệnh nhân điều trị PI không tăng cường (PI thế hệ thứ nhất) Đột biến chính rất hiếm gặp ở các phác đồ điều trị bằng PI tăng cường (Hoffmann và tập thể, 2007) Khi điều trị saquinavir không tăng cường chủ yếu xảy

ra đột biến G48V và làm giảm độ nhạy với saquinavir 10 lần; nếu kèm thêm đột biến L90M, mức độ nhạy cảm với saquinavir giảm rõ hơn trên 100 lần (Jacobsen

và tập thể, 1995) Trong khi đó, phải cần ít nhất 4 trong số các đột biến L10I/R/V, G48V, I54V/L, A71V/T, V77A, V82A, I84V và L90M mới có thể làm giảm hiệu lực của saquinavir tăng cường (SQV/r) (Valer và tập thể, 2002)

Sự đa hình giữa các phân nhóm cũng ảnh hưởng đến các đột biến kháng thuốc: đột biến điển hình đặc trưng của nelfinavir chủ yếu là D30N và các đột biến phụ khác, chỉ gây kháng chéo ở mức độ thấp với các PI khác Thất bại khi dùng nelfinavir cũng có thể xảy ra khi có đột biến L90M Đối với các virus phân nhóm B, điều trị bằng nelfinavir thường dẫn đến sự xuất hiện đột biến D30N hoặc M46I kết hợp với N88S Đối với virus phân nhóm C, G và AE, các đột biến L90M và I84V thường gặp hơn Lý do của sự khác biệt đó là tỷ lệ các đa hình tự nhiên: đột biến

đa hình M36I chỉ gặp ở 30% virus phân nhóm B, nhưng gặp ở 70-100% các virus không phải phân nhóm B Đối với virus phân nhóm C hoặc G, các con đường kháng thuốc chủ yếu là 82I/V + 63P + 36I/V hoặc 82I + 63P + 36I + 20I, đối với phân nhóm F các con đường kháng thuốc là 88S hoặc 82A + 54V (Hoffmann và tập thể, 2007)

Bảng 1.2 Các đột biến trong gen mã hóa protease HIV-1 liên quan đến

kháng thuốc PI (Johnson và tâ ̣p thể, 2010)

*Ghi chú: số in đậm đại diện cho các đột biến chính Đặc điểm kháng thuốc của atazanavir khác với các PI khác Ở bệnh nhân thất bại điều trị với phác đồ bậc 1 chứa atazanavir, đột biến I50L thường xuất hiện kèm với A71V, K45R và/hoặc G73S Tuy vậy, I50L lại làm tăng nhạy cảm với các PI khác Thậm chí khi có các đột biến chính và phụ khác, I50L vẫn có thể làm tăng nhạy cảm với các PI khác I50L xuất hiện ở 100% bệnh nhân đang điều trị bằng atazanavir nhưng thất bại và một nửa số đó cũng mang cả đột biến A71V Nghiên cứu cũng cho thấy A71V làm tăng cường chức năng enzyme của protease HIV-1 đã

bị suy yếu do đột biến chính I50L gây ra Sự tích lũy các đột biến như L10I/V/F, K20R/M/I, L24I, L33I/F/V, M36I/L/V, M46I/L, M48V, I54V/L, L63P, A71V/T/I, G73C/S/T/A, V82A/F/S/T, L90M và đặc biệt là I84V dẫn tới giảm nhạy cảm với atazanavir Trong chương trình mở rộng sử dụng atazanavir không tăng cường, số lượng các đột biến PI tương quan với thay đổi tải lượng virus Đối với atazanavir không tăng cường, ngưỡng kháng thuốc sẽ được đáp ứng khi có 3 hoặc 4 đột biến PI; với atazanavir tăng cường, kháng thuốc xảy ra khi có từ 6 đột biến trở lên (Hoffmann và tập thể, 2007) Bảng 1.2 chỉ ra các đột biến trên gen mã hóa protease HIV-1 liên quan đến kháng thuốc PI, số liệu mới được cập nhật tháng 12 năm 2010

Cơ chế phân tử của các đột biến kháng thuốc

Gần đây, các nghiên cứu về protease HIV-1 chủ yếu tập trung làm sáng tỏ cơ chế phân tử đột biến kháng thuốc, phân tích cấu trúc tinh thể của phức hợp protease HIV-1 mang đột biến với các PI đặc trưng Hiểu rõ cơ chế này sẽ làm cơ sở phát triển các chất ức chế protease mới hiệu quả (Ariyoshi và tâ ̣p thể , 2003; Ohtaka và

tâ ̣p thể, 2003; Abecasisa và tâ ̣p thể , 2005; Kantor và tâ ̣p thể , 2005; Yanchunas và

tâ ̣p thể, 2005; Bandaranayake và tâ ̣p thể, 2008)

Yanchunas và tập thể (2005)đã chỉ ra vai trò quan trọng của protease HIV-1 mang đột biến I50L/A71V, tương tác phân tử của nó với atazanavir và một số PI

khác bằng cách xác định ái lực gắn của PI với protease bình thường và protease mang đột biến I50L/A71V Kết quả nghiên cứu cho thấy đột biến I50:A và I50:B (I50 trên hai tiểu đơn vị A và B của protease HIV-1) nằm giữa vị trí liên kết S1/S2’, S2/S1’ và tương tác với các nhóm P1/P2’ và P2/P1’ trên chất ức chế protease Các nhóm t-butyl của atazanavir tại P2 và P2’ (hình 1.8) tạo liên kết van der Waals với I50:B và I50:A trên protease Tuy nhiên, sự thay thế I50L sẽ chuyển tương tác này thành dạng không gian nhỏ hơn cản trở nhóm t-butyl tại P2 và không gian lớn cho nhóm P2’ (hình 1.9) làm cho chất ức chế không thể bám vào protease Cản trở không gian nhỏ giữa atazanavir hoặc saquinavir, indinavir và nelfinavir (hình 1.8)

sẽ được giảm bớt ngay nhờ một thay đổi cấu hình trong vùng mũ protease có L50:B Tuy nhiên để giảm bớt cản trở không gian lớn với nhóm t-butyl thứ hai chỉ

có ở atazanavir, vùng mũ A phải trải qua một thay đổi cấu hình lớn hơn để tạo vị trí cho atazanavir Trong khi đó, đối với ritonavir và lopinavir, I50L tiến gần vào vị trí nhóm dimethyl tại P2’ thuận tiện hơn cho I50 gắn với chất ức chế Trong phức hợp, protease với saquinavir, indinavir, nefinavir và aprenavir, L50 tiến lại gần nhóm amide tại P2’ Như vậy, đột biến thay thế I50L dẫn đến giảm ái lực của protease với atazanavir nhưng lại giúp tăng nhạy với các PI khác

1.2.6.6 Các nghiên cứu khác về đột biến kháng thuốc PI

Hình 1.8 Công thức hóa học của các chất ức chế với các gốc cơ chất P1/P1’ va ̀ vị trí gắn của chúng S1/S1’ (Yanchunas và tập thể, 2005)

Antazanavir (ATV), ritonavir (RTV), saquinavir (SQV), lopinavir (LPV), indinavir (IDV), nelfinavir (NFV) và aprenavir (APV)

Hình 1.9 Cơ chế kha ́ ng thuốc của đô ̣t biến I50L (Yanchunas và tập thể, 2005)

(A và B) atazanvir (carbon màu xanh biển); (C và D) ritonavir (carbon màu ngọc lam); (A và C) protease bình thường (carbon màu xám); (B và D) protease mang đột biến thay thế I50L/A71V (carbon màu vàng) Lực van der Waal giữa I50 và nhóm tert-butyl tại P2’ trở thành cản trở không gian không thích hợp với đột biến thay thế I50L Trong khi đó lực van der Waals yếu và xa giữa I50 và dimethyl tại P2’ trở nên gần và thuận tiện với L50 Màu của các nguyên tử không phải carbon bao gồm: hidro – màu trắng, oxy – màu đỏ, nitro - màu xanh, sunfua – vàng tối

Hướng nghiên cứu về đột biến kháng thuốc gần đây rất được quan tâm là kiểu gen và con đường kháng thuốc ở các phân nhóm HIV-1 khác nhau liệu có

giống nhau hay không Do trình tự nucleotide trong gen pol có sự đa dạng khác

nhau từ 10 đến 15% giữa các phân nhóm, đột biến axit amin có thể nhanh chóng dẫn đến sự thay thế hoặc kháng thuốc trong ART nên các HIV-1 không phải phân nhóm B có thể được cho rằng đã tiến hóa khác phân nhóm B và mô hình hay con đường kháng thuốc có thể khác nhau (Ariyoshi và tâ ̣p thể , 2003; Abecasisa và tâ ̣p thể, 2005; Kantor và tâ ̣p thể, 2005; Bandaranayake và tâ ̣p thể, 2008) Tuy nhiên, các nghiên cứu sản xuất thuốc và cơ chế di truyền kháng thuốc PI chủ yếu dựa trên HIV-1 thuộc phân nhóm B phổ biến ở Mỹ, Tây Âu và Australia chỉ gây ra sự truyền nhiễm HIV-1 chiếm tỷ lệ khoảng 12% trên toàn thế giới còn lại là do các virus không phải phân nhóm B gây ra nhưng các nghiên cứu vẫn còn nhiều hạn chế (Ariyoshi và tâ ̣p thể , 2003) Do hầu hết thông số kháng thuốc ở HIV cho đến nay chủ yếu liên quan đến phân nhóm B, nên gần đây các nghiên cứu tập trung nhiều vào sự khác nhau trong trình tự axit amin liên quan đến mức độ kháng thuốc PI ở các phân nhóm khác nhằm tối ưu hóa điều trị kháng thuốc ở các bệnh nhân nhiễm HIV-1 phân nhóm này (Ariyoshi và tâ ̣p thể , 2003; Abecasisa và tâ ̣p thể , 2005; Kantor và tâ ̣p thể, 2005; Bandaranayake và tâ ̣p thể, 2008) Số liệu từ các nghiên cứu

đã cho thấy kiểu gen kháng thuốc ở phân nhóm B không phải luôn luôn có thể áp dụng cho các phân nhóm khác B

Năm 2003, Ariyoshi và tâ ̣p thể ở trung tâm nghiên cứu AIDS Nhật Bản đã tiến hành so sánh các đột biến kháng thuốc ở các virus thuộc phân nhóm CRF01_AE với phân nhóm B trên các bệnh nhân nhiễm HIV-1 thất bại với phác đồ điều trị bằng ART Kết quả cho thấy các đột biến đã biết tại các vị trí L10F, K20I, L33I và N88S xuất hiện ở protease HIV-1 của các bệnh nhân nhiễm HIV-1 phân nhóm CRF01_AE nhiều hơn so với phân nhóm B N88S có vai trò quan trọng trong kháng thuốc nelfinavir ở các bệnh nhân nhiễm HIV-1 phân nhóm CRF01_AE trong nghiên cứu Tuy nhiên, N88S đã được thông báo kháng với các thuốc nelfinavir, indinavir và BMS-232632 ở phân nhóm B (Gong và tâ ̣p thể , 2000) Thêm nữa, các bệnh nhân mang N88S ở phân nhóm CRF01_AE lại luôn có đột biến L10F, trong khi ở phân nhóm B không có bệnh nhân nào mang cả hai đột biến liên kết này

Không có bệnh nhân nào kháng PI nhiễm HIV-1 phân nhóm CRF01_AE mang các đột biến D30N, A71V hoặc N88D, trong khi những đột biến này thường xuất hiện ở phân nhóm B kháng PI Các kết quả được khẳng định thêm cùng với các số liệu so sánh đột biến kháng thuốc trên gen mã hóa reverse transcriptase Nhóm tác giả khẳng định rằng các nghiên cứu đã biết về kiểu gen gây đột biến kháng thuốc ở phân nhóm B không phải lúc nào cũng có thể đúng với phân nhóm CRF01_AE, đặc biệt trong trường hợp các bệnh nhân nhiễm HIV-1 phân nhóm CRF01_AE được điều trị bằng nelfinavir

Năm 2005, để trả lời hai câu hỏi: i) các đột biến gây kháng thuốc ở phân nhóm B có áp dụng được với các phân nhóm khác B hay không; ii) liệu có các đột biến mới dẫn đến thất bại trong điều trị HIV-1 ở các phân nhóm khác B nhưng có trong phân nhóm B hay không; Kanto và tập thể đã nghiên cứu các đột biến trong gen mã hóa protease và reverse transcriptase phân lập từ các bệnh nhân nhiễm HIV-

1 đang điều trị bằng PI và các thuốc ức chế reverse transcriptase trong 14 phòng thí nghiệm tại 12 nước trên thế giới Kết quả cho thấy, 1 trong 55 đột biến kháng thuốc

ở phân nhóm B đã biết xảy ra ít nhất một lần ở các phân nhóm không phải B Trong

đó, 80% đột biến có vai trò quan trọng trong liệu pháp điều trị ART ở các bệnh nhân nhiễm HIV-1 không phải phân nhóm B Có 11 đột biến không phổ biến ở phân nhóm B nhưng lại có trong tất cả các phân nhóm khác B và rất khó để xác định xem chúng có vai trò trong điều trị hay không Nghiên cứu cũng cho thấy không có đột biến nào gây kháng thuốc ở các phân nhóm không phải B mà không liên quan đến kháng thuốc ở phân nhóm B Nhóm tác giả khẳng định, các nỗ lực giải quyết hiện tượng kháng thuốc trong điều trị HIV/AIDS trước hết nên tập trung vào các đột biến

ở phân nhóm B đã biết

Tuy nhiên, cùng năm 2005, Abecasis và tập thể đã phát hiện thấy rằng đột biến M89I/V ở các bệnh nhân điều trị thất bại với thuốc PI mang HIV-1 thuộc các phân nhóm C, F và G nhưng không gây đột biến kháng thuốc ở các phân nhóm B Ở các virus mang đột biến L90M, việc xuất hiện thêm M89I/V đã dẫn đến kháng với thuốc nelfinavir

Cùng quan điểm với các nhóm nghiên cứu của Ariyoshi và tâ ̣p thể (2005), Abecasis và tâ ̣p thể (2005); Bandaranayake và tập thể (2008) đã phân tích cấu trúc

tinh thể của phức hợp protease HIV-1 phân nhóm CRF01_AE với cơ chất p1-p6 và

so sánh với cấu trúc của protease HIV-1 phân nhóm B Kết quả cho thấy phần khớp nối giữa vùng mũ và vùng lõi protease phân nhóm CRF01_AE có sự sắp xếp lại và có

ý nghĩa quan trọng so với cấu trúc protease phân nhóm B Nhóm tác giả khẳng định rằng sự thay đổi cấu trúc này có thể ảnh hưởng đến tương tác của protease phân nhóm CRF01_AE với các PI và do đó mức độ kháng thuốc với các chất ức chế có thể khác so với protease phân nhóm B Tóm lại, dù còn nhiều tranh cãi nhưng HIV-1 thuộc các phân nhóm không phải nhóm B gây ra HIV-1 chủ yếu trên thế giới cần được nghiên cứu nhiều hơn nữa nhằm có phác đồ điều trị hợp lý và hiệu quả cho các bệnh nhân nhiễm HIV-1 nhóm này

Ở Việt Nam, ART được Bộ Y tế và Tổ chức quốc tế WHO bắt đầu đưa vào sử dụng năm 2003 và trung bình số lượng bệnh nhân điều trị bằng ART đã tăng từ 1% năm 2003 lên 11% năm 2005 và 28,4% năm 2007 Do ART được đưa vào Việt Nam nhanh chóng nên dẫn đến sự lan truyền các chủng kháng thuốc HIV-1 Tỷ lệ kháng ART nói chung trong số các bệnh nhân chưa điều trị ART ở thành phố Hồ Chí Minh năm 2003 là 6,5%; ở Hà Nội là 5% năm 2006 và 2,9% ở Hải Phòng năm 2009 (Phan

và tập thể , 2010) Năm 2009, Ishizaki và tập thể đã phân tích gen mã hóa protease trên 294 bệnh nhân nhiễm HIV-1 chưa dùng ART ở Hải Phòng và phát hiện được 0,3% trường hợp mang đột biến M46I kháng thuốc kiểu hình với PI, 99% và 99,3% trường hợp mang lần lượt các đột biến M36I và H69K Ngoài ra nghiên cứu cũng phát hiện được tỷ lệ mang đột biến không kháng thuốc E35E_E (thêm một axit amin glutamic ở vị trí 35), R41K và L89M tương ứng là 0,3%; 99% và 98,6% Đến năm

2010, Phan và tập thể cũng đã phân tích gen mã hóa protease trên 174 bệnh nhân chưa dùng ART ở một số tỉnh phía Bắc (Hà Nội, Nam Định và Thái Bình) và đã phát hiện được 1,7% trường hợp mang các đột biến kháng thuốc chính bao gồm L33F, M46I, M46L và I50V So với các nghiên cứu trước đây ở Hà Nội thì tỷ lệ đột biến là 5% năm 2006 và 0,39% ở Hải Phòng năm 2009 Các nghiên cứu này cũng cho thấy đột biến PI thường xuất hiện chậm và ít hơn so với các thuốc ức chế NRTI và NNRTI trong ART Mặc dầu, đã có một số nghiên cứu trên đây về tình hình đột biến kháng thuốc PI ở Việt Nam, tuy nhiên vẫn còn ít thông tin về tình trạng kháng thuốc hiện