Tài liệu hạn chế xem trước, để xem đầy đủ mời bạn chọn Tải xuống
1
/ 142 trang
THÔNG TIN TÀI LIỆU
Thông tin cơ bản
Định dạng
Số trang
142
Dung lượng
2,74 MB
Nội dung
1 TRƢƠ ̀ NG ĐA ̣ I HO ̣ C KHOA HO ̣ C TƢ ̣ NHIÊN Nguyễn Thị Hồng Loan NHÂN DÒNG, BIỂU HIỆN VÀ NGHIÊN CỨU MỘT SỐ TÍNH CHẤT CỦA PROTEASE TỪ HIV-1 TẠI VIỆT NAM LUẬN ÁN TIẾN SĨ NGÀNH SINH HỌC 2 MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Virus gây suy gim min dch i (Human immunodeficiency virus - HIV) là nguyên nhân chính gây ra hi chng suy gim min dch mc phi i (AIDS) và là mt trong s nhng virus gây bnh nghiêm trng nht hin nay. HIV bii liên tc v cu trúc và h kháng li các thuu tr và gây ra t l t vong cao. K t khi xut hin (t ng 60 trii trên hành tinh b nhing 25 trit do các bnh n AIDS (UNAIDS, 2010). Theo các tài li b, có ít nht hai type -1) và HIV type 2 (HIV-2), n-1 là nguyên nhân chính gây ra AIDS i trên toàn th gii. Trong chu trình sng ca HIV-1, 3 enzyme reverse transriptase, integrase và protease có vai trò quan trng không th thi thành virus hoàn chnh. Vì vy, các cht c ch cc nghiên cu, sn xu u tr cho bnh nhân nhiu tr c gi là liu pháp dùng thuc chng retrovirus (antiretroviral drug therapy, gi tt là ART). Trong s 3 enzyme nói trên, protc mã hóa bi gen pol ca virus có cht các - - t sinh sn nhanh ca HIV 1, có khong 10 triu ht virus m c to ra mi ngày và t l sai sót rt cao ca enzyme reverse transriptase (1/10.000 base) thu tr. Khi có ART, các chng t bin kháng thuc chn lc và tr thành ch (Hoffmann và tp th, 2007), (PI) 3 - Hin nay, trên th gi u công trình nghiên c sn xut protease ca HIV-1 (c gi tt là protease HIV-1) c t cho thy protease HIV-1 không d c biu hin trong t bào vt ch c tính gây c t c sau biu hing thp, trong mt s ng hp ch có th phát hic bn dch vi các quy trình biu hin, tinh sch gm nhic rt phc tp. Mt khác, các nghiên cu u sn xut protease HIV-1 phân lp t phân nhóm B là phân nhóm HIV ph bin gây bnh M, Australia c Tây Âu. Trong khi, phn lng hp nhim HIV-1 trên th gii và Vit Nam không thuc phân nhóm B. Nhng nghiên cu gy s khác nhau v cu trúc ca protease phân nhóm B so vi các phân nhóm khác dn hiu qu u tr thuc c ch protease (PI) và m kháng thuc có th khác nhau. -- công (Hoffmann -1 có vai Vit Nam, protease HIV-1 t các bnh nhân Vit Nam là v còn ít c nghiên cu. Các nghiên cu ch yu tnh nhóm virus gây bnh ch yu i Vit Nam và tìm ra mt s t bin liên quan kháng thuc. c biu nào v biu hin protease HIV-1 phân lp t các bnh i Vit Nam. “Nhân dòng, biểu hiện và nghiên cứu một số tính chất của protease từ HIV-1 tại Việt Nam” ch phm protease HIV-1 tái t hp s dng cho mc và phát 4 trin các cht c ch s nhân lên ca HIV, t phát trin thuc u tr HIV/AIDS. 2. Mục tiêu nghiên cứu của đề tài - Phát hin mt s t bin trong gen mã hóa protease HIV-1 i Vit Nam. - Thit lp quy trình hiu qu cho vic biu hin gen mã hóa protease HIV-1 vi khun E. coli và tinh sch protease HIV-1 tái t hp dng có hot tính. - Nghiên cu mt s tính cht protease HIV-1 và tìm hiu tác dng ca mt s cht c ch tìm kim và phát trin các PI mi có th ng dng trong u tr HIV/AIDS. 3. Đối tƣợng và nội dung nghiên cứu của đề tài Đối tượng nghiên cứu của đề tài: Gen mã hóa protease HIV-1 t huyt thanh các bnh nhân nhim HIV-1 ti Bnh vin Bnh Nhi Nội dung nghiên cứu của đề tài: - Tinh sch RNA ca HIV-1 và tng hp cDNA ca mt s mu HIV-1 t các bnh nhân nhim HIV-1 ti Vit Nam. - Nhân bc trình t gen mã hóa protease HIV-1 ca các mu virus phân l sai khác v trình t gen mã hóa protease HIV-1 gia các ng bnh nhân nhim HIV-1 so vi trình t ng trên th gii. - Thit k h thu kin biu hin gen mã hóa cho protease HIV-1 E. coli. - Xây dng quy trình tinh sch protease HIV-1 tái t hp. - Nghiên cu mt s a protease HIV-1 tái t hc. - Tìm hiu tác dng c ch ca mt s hp cht tng hp và t nhiên lên protease HIV-1 tái t hp. 4. Địa điểm thực hiện đề tài Các nghiên cu ca luc thc hin ch yu ti Phòng Thí nghim trm Công ngh i hc Khoa hc T i hc Quc gia Hà Ni. 5. Đóng góp mới của đề tài 5 - Công trình nghiên cu có tính h thng t vic nhân bn, nhân dòng và biu hin E. coli gen mã hóa protease HIV-1 tái t hp thuc chng CRF01_AE ca Vit Nam; thit l tinh sch protease HIV-1 vi hiu sut thu nhi các nghiên cu trên th gii. - u tiên phát hin thy tác dng c ch protease HIV-1 bi axit asiatic, 8-hydroxyquinoline và menadione. 6. Ứng dụng thực tiễn của đề tài - Cách thc biu hin gen mã hóa protease HIV-1 và tinh sch protease tái t hp to ra trong công trình nghiên cu này có th d dàng c áp d sn xut mt s protease tái t hp khó tan và ch c hiu vi mt s ct nhnh. - Ch phm protease HIV-1 t cho vic tìm kim và phát trin các PI m có th ng du tr bnh nhân HIV/AIDS. CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. GIỚI THIỆU CHUNG VỀ HIV-1 1.1.1. HIV-1 nguyên nhân của AIDS Virus gây suy gim min dch i (HIV) lc Montagnier và tp th Vin Pasteur Paris phân li tên gu là virus liên quan ti viêm hch (LAV) c y ban Quc t thng nht gi tên HIV (Greene, 2007). Cùng thc mt virus mi t tên là HIVc ca HIV-type 1. Hai lou làm suy gim h thng min dch ca ngt tên chung là HIV. Mc dù HIV-type 2 có mt s m ging vi HIV- cách thc 6 truyn bnh, các hình thc nhim bu tr i nhim HIV-type 2 ít phát sinh bi nhim HIV-type 1 và HIV-type 2 thy ch yu các vùng ca Châu Phi (Hoffmann và tp th, 2007). Vì vy, HIV- type 1 (HIV-nh AIDS. HIV thuc h retrovirus, là h ng vt. HIV-1 có 3 nhóm chính là M (main), N (new), và O (outlier). Có ti 90% s lây nhim HIV trên toàn th gii thuc ký hiu bng các ch cái A-D, F-H, J, K và nhiu dng tái t hp khác c gi tt là các phân nhóm CRF (circulating recombinant forms). S khác nhau gia phân nhóm này vi phân nhóm khác là trình t axit amin ca protein v và có th t quá 30%. Phân nhóm B ph bin M, Tây Âu và Australia; trong khi các phân nhóm không phi nhóm B li phân b n c phn ln nhi b nhing. S ng ca virus có th thy vùng Sahara (châu Phi). Vi-1 phân lp t các bnh nhân nhim HIV-1 ch yu thuc nhóm CRF01_AE, bên cnh t s ít các phân nhóm B, C và các dng tái t hp khác (UNAIDS, 2010; Nguyen và tp th, 2003; Ishizaki và tp th, 2009; Phan và tp th, 2010). Phn ln vic nghiên c tìm ra thuu tr bu da trên phân nhóm B. Tuy nhiên g ng v trình t axit amin gia các ng nghiên cu quan trng kháng thuc PI (Bandaranayake và tp th, 2008). 1.1.2.Tình hình nhiễm HIV-1 i dt thách thc to li vi tin trình phát trin xã hi. Sau 3 thp k phát hi u tiên là c phát trin, ng trên toàn th gic bit khu vc châu n nay va HIV hay thuc cha tr c hiu. Theo HIV/AIDS (UNAIDS, 2010), n cu i nhing trên th gii l hin nhim HIV/AIDc tính cao gp 3 l c tính khong 33,3 tri 7 b ng nhim mi là 2,6 trii và có khong 1,8 triu b - 1990; . T 30/9/2010 80.631 tr/AIDS. ( 2009; UNAIDS, Vietnam) Theo phân tích ca các chuyên gia, tng s i nhim HIV còn sng vn p t qu cng ch yu: S i mi nhim HIV u vn cao và do kt qu tích cc ca các liu tr kháng virus làm gim s i t vong, kéo dài s si bnh. 1.1.3. Sinh bệnh học của nhiễm HIV-1 1.1.3.1. Cấu trúc hình thể của HIV-1 Trên kính hin t, HIV-1 và HIV-2 có cu trúc gng nhau hoàn toàn. Chúng ch khác nhau khng ca c tr. C HIV-1 và HIV-u nhân bn trong t u gây bnh i, mc dù m suy gim min dch do HIV-2 gây ra (Hoffmann và tp th, 2007). HIV-c khong 120 nm, dng cu (hình 1.1). V ngoài ca virus là lp lipid kép vi nhiu protein gc ký hin là Env. Protein Env có phn chc to thành t 3 phân t glycoprotein có khng phân t là 120 kDa (gp120) và phc to thành bi 3 phân t gp41 gn vi nhau to thành các phân t p v ngoài ca virus; gp160 có th c phát hin trong huych huyt ca bnh nhân HIV. Trong quá trình ny chi, virus có th gn thêm các protein t màng ca t bào vt ch vào lp lipoprotein ca virus, ví d các protein HLA lp I và II, hoc các protein k-1 giúp virus gn vào t c gn vào mt trong ca màng lipoprotein. 8 Lõi có dng hình tr c bao bc bi lp capsid to thành t 2.000 bn sao ca protein p24 (Hare, 2006; Hoffmann và tp th, 2007). Hình 1.1. Cấu trúc của một hạt HIV-1 (Hoffmann và tp th, 2007) 1.1.3.2. Tổ chức hệ gen của virus H gen ca HIV-1 nm trong phn lõi ca virus và bao gm hai si RNA (+) i si có chiu dài khong 9,8 kb và có 9 gen mã hóa cho 15 protein khác nhau (hình 1.2). So vi các virus khác thuc h retrovirus thì h gen ca HIV-1 phc ti si RNA có 3 gen cu trúc là gag, pol và env; gag group-antig pol pol env là env). C a b gen retrovirus -gag-pol-env- long terminal rn lu cùng) là u ca b gen virus, ni vi DNA t bào vt ch sau khi tích hp và không mã hóa cho bt c protein nào ca virus. Các gen gag và env mã hóa cho nucleocapsid và glycoprotein ca màng virus; gen pol mã hóa cho 3 enzyme: reverse transcriptase, integrase và protease. Ngoài ra, HIV-1 còn có 6 gen (vif, vpu, vpr, tat, rev và nef) vùng RNA 9 kb (Hoffmann và tp th, 2007). 9 Hình 1.2. Cấu tạo hệ gen của HIV-1 (Hoffmann và tập thể, 2007) Hình 1.2. Cấu tạo hệ gen của HIV-1 (Hoffmann và tp th, 2007) 1.1.3.3. Chu trình nhân bản của nhiễm HIV-1 Quá trình nhim HIV-1 ca t bào vt ch bu bng vic gn mt phn virus lên b mt ca t c bu khi protein b mt v gp120 gn vào th th trên b mt t ng hp th th là CD4 có t bào lympho T hoc có mt s t i thc bào, bch cu bào lympho B. Các t bào này có vai trò rt quan trng trong h thng min dch c ; chúng nhn di ng và ng các t bào lympho tn công và tiêu dit vi sinh vt l . S liên k u tiên ca gp120 v l ra v trí khác ct vng th thng là th th chemokine CXCR4 hoc CCR5. Ti gp41 qua th th gn vào màng t -1 ci b lp v lipid t liu di truyn RNA ca nó cùng vi reverse transcriptase vào t bào cht ca t bào vt ch. Nh reverse transcriptase, si RNA cc tng hp thành si DNA b sung (cDNA). Si RNA ca virus kt hp cDNA thành chui RNA/DNA chui lai này chuyn thành 2 si DNA xon mch th chuyn thành DNA xon d bào và nh enzyme integrase, DNA kép ca viruc chèn vào DNA nhim sc th ca t bào chc hp thành (hay gi là tin virus, phân bit nó vi dng virion) có th tn ti trng thái tim tàng trong nhiu gi hoc nhic khi tr thành dng hong mà có th không biu hin bnh (Hare, 2006). 10 Quá trình sao chép h gen cc thc hii s u khin phc tp ca mt s protein, bao gm Tat và các yu t sao chép DNA ca t bào. Chính vic gn vt cht di truyn ca virus vào h i cu trúc gen ca t bào vt ch. DNA ca virus s ch th cho t bào sn xut ra RNA ca virus nh c nhân lên, các protein ca c tng hp nh ribosome ca t bào vt ch, chúng di chuyn ra mi ni cht hoc màng t bào, tip theo là quá trình ny chi to thành các virion nm trên màng hoc tách ra khi t bào chi gn vào các t bào lympho T khác. S vn chuyn RNA cc sao chép ra khi nhân ph thuc vào mt s nhân t ca virus và vt ch c vn chuyi dng vt liu di truyn cho các virion mi hay có th c ni tng phn hoc toàn b nhm tng hp nên nhng protein khác nhau ca virus (Hare, 2006; Hoffmann và tp th, 2007). Hình 1.3. Chu kỳ sống của HIV-1 (Weiss, 2001) Các t bào lympho T CD4 + b nhim có th b git trc tip khi mng lc sn sinh và ny chi t b mt, phá v màng t bào hoc khi các protein và axit amin ca virus có mt bên trong t bào, cn tr s hong ca b máy t bào. Mt khác, các t bào lympho T CD4 + b nhim có th ng Bản sao DNA của HIV [...]... tiên mô tả cấu trúc tinh thể của protease HIV- 1 Từ đó đến nay, nhiều protease HIV- 1 khác nhau đã đƣợc nghiên cứu về chức năng, tính đặc hiệu cơ chất và vị trí gắn của các chất ức chế Cấu trúc của một số phức hợp protease HIV- 1 kháng thuốc với các chất ức chế đặc hiệu cũng đã đƣợc làm sáng tỏ (King và tâ ̣p thể , 2000) Protease HIV- 1 đƣợc mã hóa bởi hệ gen của HIV- 1 và là một protease aspartyl, họ retropepsin... lƣợng protease sau biểu hiện có thể tăng lên và chiếm từ 8 -10 % protein tổng số của tế bào Nghiên cứu cũng cho thấy rằng, protease HIV- 1 tái tổ hợp không thể biểu hiện một cách đơn giản nhƣ các protein tái tổ hợp khác ở vi khuẩn E coli Leuthardt và Roesel (19 93) đã nhân dòng, biểu hiện và tinh sạch protease HIV- 1 tái tổ hợp bằng hệ thống vector pDS56/3H-3H ở E coli Với hệ thống biểu hiện này, protease. .. và tâ ̣p thể , 19 89; Baum và tâ ̣p thể , 19 90; Cheng và tâ ̣p thể , 2006) Một trong các lý do đƣợc dự đoán là protease HIV- 1 có thể đã thủy phân các protein chức năng của tế bào (Danley và tập thể, 19 89) Phỏng đoán này đặt ra một thách thức cho nghiên cứu biểu hiện protease HIV- 1 ở vi khuẩn Để hạn chế tính độc này, một vài nhóm nghiên cứu đã nhân dòng và biểu hiện protease HIV- 1 bằng cách sử dụng... S-sepharose và pepstatin–agarose) đã thu đƣợc 5 mg protease HIV- 1 từ 10 g tế bào E coli Tuy vậy, kết quả kiểm tra độ sạch trên SDS-PAGE, ngoài protease HIV- 1 vẫn còn lẫn 1 băng protein tạp nhiễm kích thƣớc 14 kDa Ở Việt Nam, protease là một trong số những enzyme đƣợc nghiên cứu nhiều nhất trong những thập kỷ qua và các nghiên cứu chủ yếu là điều tra, tách chiết và nghiên cứu một số tính chất trên đối... thể , 2008) Năm 2008, Bandaranayake đã biểu hiện và tinh sạch chế phẩm protease HIV- 1 tái tổ hợp từ phân nhóm CRF 01_ AE cho nghiên cứu cấu trúc tinh thể của protease trong phức hợp với cơ chất và so sánh với cấu trúc protease HIV- 1 phân nhóm B bằng cách sử dụng quy trình của Rose và tập thể (19 93) Theo quy trình này, protease HIV- 1 đƣợc biểu hiện từ vector pSOD/PR179, sau 3 bƣớc tinh sạch (qua các hệ... quan trọng của protease trong liệu pháp dùng thuốc chống HIV- 1 Một trong các chất ức chế hoạt tính protease HIV- 1 đƣợc phát hiện sớm nhất là pepstatin A - chất ức chế protease aspartyl – làm mất hoạt tính của protease HIV- 1 dẫn đến tạo ra các chủng virus không hoàn chỉnh và không có khả năng nhiễm vào tế bào chủ (Seelmeier và tập thể, 19 88) Cơ chế xúc tác của protease HIV- 1 là tƣơng tự với các protease. .. lực gắn của PI với protease bình thƣờng và protease mang đột biến I50L/A71V Kết quả nghiên cứu cho thấy đột biến I50:A và I50:B (I50 trên hai tiểu đơn vị A và B của protease HIV- 1) nằm giữa vị trí liên kết S1/S2’, S2/S1’ và tƣơng tác với các nhóm P1/P2’ và P2/P1’ trên chất ức chế protease Các nhóm t-butyl của atazanavir tại P2 và P2’ (hình 1. 8) tạo liên kết van der Waals với I50:B và I50:A trên protease. .. nguyên GP 41, GP120 và P24 của HIV 30 ở E coli và bƣớc đầu ứng dụng chúng trong phát hiện kháng thể kháng HIV trong huyết thanh bệnh nhân bằng kỹ thuật phân tích miễn dich ̣ Tóm lại, mặc dầu đã có khá nhiều công trình nghiên cứu khác nhau ở trong nƣớc về gen và protein của HIV, nhƣng cho đến nay chƣa có công trình nào công bố về biểu hiện, tinh sạch và nghiên cứu tính chất của protease từ HIV- 1 gây nhiễm... phản ứng nhỏ nên lƣợng protease HIV- 1 thu nhận đƣợc sau khi kết thúc quy trình không cao, chƣa đến 10 0 μg protein Mặt khác, nghiên cứu chƣa kiểm tra hoạt tính của protease HIV- 1 thu nhận đƣợc Nhiều nhóm nghiên cứu đã thông báo biểu hiện đƣợc protease HIV- 1 ở E coli bằng cách thiết kế các vector khác nhau Tuy nhiên, tất cả các số liệu đều cho thấy biểu hiện protease HIV- 1 có hoạt tính là gây độc giết... để sản xuất lớn (Taylor và tâ ̣p thể , 19 92) Năm 19 92, Rangwala và tập thể đã nghiên cứu các yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình biểu hiện protease HIV- 1 ở vi khuẩn E coli Theo nhóm tác giả này, trình tự gen mã hóa protease HIV- 1 ảnh hƣởng đến mức độ biểu hiện proteae HIV- 1 Nếu dùng thể nhân dòng cDNA, lƣợng protease HIV- 1 biểu hiện thƣờng thấp và chỉ có thể phát hiện đƣợc bằng thẩm tách miễn dịch Vấn đề . Loan NHÂN DÒNG, BIỂU HIỆN VÀ NGHIÊN CỨU MỘT SỐ TÍNH CHẤT CỦA PROTEASE TỪ HIV-1 TẠI VIỆT NAM LUẬN ÁN TIẾN SĨ NGÀNH SINH HỌC 2 MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài. hin protease HIV-1 phân lp t các bnh i Vit Nam. Nhân dòng, biểu hiện và nghiên cứu một số tính chất của protease từ HIV-1. tƣợng và nội dung nghiên cứu của đề tài Đối tượng nghiên cứu của đề tài: Gen mã hóa protease HIV-1 t huyt thanh các bnh nhân nhim HIV-1 ti Bnh vin Bnh Nhi Nội dung nghiên