Trong nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành xác định Vmax, Km và Kcat của protease HIV-1 tái tổ hợp, sử dụng cơ chất tổng hợp đặc hiệu L6525 của Sigmaaldrich.
Để xác định Km, chúng tôi thực hiện phản ứng thủy phân của protease HIV-1 tái tổ hợp với các nồng độ cơ chất tăng dần, đến khi đạt giá trị tốc độ phản ứng cực đại (Vmax = (A300/t) cực đại), biểu diễn đồ thị phụ thuộc của A300/t theo [S]. Giá trị nồng độ cơ chất mà tại đó tốc độ phản ứng đạt (½ A300/t) max chính là Km.
Dựa trên kết quả thu đƣợc ở hình 3.28 và dựa vào phƣơng trình Lineweaver- Burk: 1/V = Km/Vmax.[S] + 1/Vmax, chúng tôi đã xác định đƣợc Km của protease HIV-1 là 61,3 µM và Vmax là 0,0275 µM/giây.
Sự phù hợp của enzyme và cơ chất còn đƣợc đánh giá bằng chỉ số Kcat. Kcat đƣợc định nghĩa là số phân tử cơ chất đƣợc biến đổi thành sản phẩm bởi một phân tử enzyme trong 1 giây ở điều kiện bão hòa cơ chất.
Áp dụng công thức, Kcat = Vmax/[Eo]. Trong đó [Eo] là nồng độ enzyme protease HIV-1 tham gia phản ứng, chúng tôi tính toán đƣợc Kcat của protease HIV- 1 trong nghiên cứu này là 2,86 giây-1.
Hình 3.28. Đồ thị sự phụ thuộc của tốc độ phản ứng thủy phân cơ chất tổng hợp của protease HIV-1 tái tổ hợp vào nồng độ cơ chất
So với Km, Kcat trong nghiên cứu của Richard và tập thể (1990) trên cùng một cơ chất tổng hợp, Km đƣợc xác định trong nghiên cứu của chúng tôi cao hơn 4 lần, Kcat thấp hơn 20 lần. Hay nói cách khác, ái lực với cơ chất của protease HIV-1 tái tổ hợp của chúng tôi thu đƣợc thấp hơn của protease HIV-1 trong nghiên cứu
của Richard và tập thể (1990), đồng thời hiệu suất xúc tác cũng thấp hơn. Sự