Phần lớn các nghiên cứu trƣớc đây đều biểu hiện protease HIV-1 ở vi khuẩn
E. coli dƣới dạng tự cắt khỏi trình tự cắt đặc hiệu thƣờng là giữa Phe/Tyr–Pro để giải phóng protease HIV-1 mở đầu bằng axit amin Pro (Graves và tập thể , 1988; Danley và tập thể , 1989; Taylor và tâ ̣p thể , 1992; Mildner và tâ ̣p thể , 1994). Tuy nhiên, Leuthardt và Roesel (1993) đã nhân dòng và biểu hiện protease HIV-1 tái tổ hợp bằng hệ thống vector pDS56/3H-3H ở E. coli. Với hệ thống này, protease mở đầu bằng Met và đƣợc gắn thêm 3 gốc histidine (3xHis) ở đầu cùng N, đầu cuối C để thuận tiện cho quá trình tinh sạch; không cần thiết kế trình tự tự cắt. Dựa trên nghiên cứu của Leuthardt và Roesel (1993), điều kiện sẵn có của phòng thí nghiệm cùng với kinh nghiệm đã biểu hiện một protein khác ở vector pET28a, bƣớc đầu chúng tôi chọn vector pET28a để biểu hiện protease HIV-1 ở E. coli.
Hệ thống vector pET đƣợc xem là một trong các hệ thống vector mạnh nhất cho biểu hiện protein tái tổ hợp ở vi khuẩn hiện nay. Các gen đích khi đƣa vào vector pET đƣợc điều khiển dịch mã bằng promoter T7 của thực khuẩn thể cùng với T7 RNA polymerase; protein đích có thể đƣợc biểu hiện tới hơn 50% protein tổng số của tế bào chỉ sau vài giờ cảm ứng. Vector pET28a có 2 trình tự 6xHis ở phía trƣớc và sau của vùng nhân dòng đa điểm cắt (MCS). Tuy nhiên, với việc thiết kế mồi nhƣ đã nêu mục 3.1.1 thì gen mã hóa protease HIV-1 sau khi đƣa vào chỉ có một trình tự 6xHis ở đầu N của chuỗi polypeptide do mã kết thúc đã đƣa ngay vào trƣớc trình tự cắt của EcoRI. Nhƣ vậy sau biểu hiện, protease HIV-1 trong nghiên cứu của chúng tôi có dạng MGSSHHHHHHSSLVPGSHM-protease (trong đó SSLVPG là trình tự cắt của thrombin) gần giống với cách thiết kế (MRGSHHHGS- protease-RSHHH) trong nghiên cứu của Leuthard và Roesel (1993). Theo tính toán, protease HIV-1 biểu hiện trên hệ thống này có KLPT khoảng 13 kDa.
Trƣớc tiên, chúng tôi tiến hành xử lý đồng thời vector biểu hiện pET28a và vector nhân dòng pCR2.1-Prot (đã đƣợc tạo ra ở phần 3.1.2) bằng cặp enzyme giới hạn NdeI và EcoRI. Sản phẩm cắt sau đó điện di kiểm tra trên gel agarose 1%, tách và tinh sạch băng có kích thƣớc khoảng 5,3 kb của vector pET28a mạch thẳng và băng DNA khoảng 0,3 kb (theo tính toán là của gen mã hóa protease HIV-1). Kết quả điện di ở hình 3.6 cho thấy chúng tôi đã thu đƣợc 2 băng DNA rõ nét, 1 băng có
kích thƣớc khoảng 5,3 kb tƣơng ứng với kích thƣớc của vector pET28a (đƣờng chạy 2), 1 băng có kích thƣớc khoảng 0,3 kb tƣơng ứng với kích thƣớc của gen mã hóa protease HIV-1 (đƣờng chạy 3).
Hình 3.6. Điện di sản phẩm cắt vector pET28a và pCR2.1-Prot bằng EcoRI và
NdeI
1: Thang chuẩn DNA 1kb
2: pET28a đã xử lý với EcoRI, NdeI và tinh sạch 3: pCR2.1-Prot đã xử lý với EcoRI, NdeI và tinh sạch
Tiếp theo, đoạn gen mã hóa protease HIV-1 đƣợc gắn vào vector pET28a và biến nạp vào tế bào khả biến E. coli DH5α. Sự có mặt của vector tái tổ hợp trong khuẩn lạc đƣợc chúng tôi kiểm tra bằng phƣơng pháp PCR trực tiếp sử dụng cặp mồi T7 promoter và T7 terminator (gọi tắt là cặp mồi T7-F/T7-R) của hệ thống vector pET. Theo tính toán lý thuyết, các khuẩn lạc có chứa vector pET28a tái tổ hợp, khi PCR sử dụng cặp mồi T7-F/T7-R sẽ cho băng DNA kích thƣớc 630 bp bao gồm 320 bp của đoạn gen mã hóa protease HIV-1 và đoạn 310 bp của vector. Còn với các khuẩn lạc mang pET28a nguyên bản, khi PCR sử dụng cặp mồi này chỉ cho băng DNA có kích thƣớc 310 bp.
Kết quả điện di sản phẩm PCR hình 3.7 cho thấy khi sử du ̣ng thể biến nạp làm khuôn cho PCR chúng tôi đã thu nhận đƣợc băng DNA có kích thƣớc 630 bp (đƣờng chạy 3), còn khi dùng vector pET28a làm khuôn thì chỉ cho băng 310 bp (đƣờng chạy 2). Kết quả này chứng tỏ khuẩn lạc đƣợc lựa chọn mang vector
pET28a tái tổ hợp có đoạn chèn là gen mã hóa protease HIV-1. Vector pET28a tái tổ hơ ̣p này đƣợc go ̣i tắt là pET28a-Prot.
Hình 3.7. Điện di sản phẩm PCR kiểm tra vector pET 28a mang gen mã hóa cho protease HIV-1 với cặp mồi T7-F/T7-R
1: Thang chuẩn DNA 100 bp
2: Sản phẩm PCR plasmid pET28a nguyên bản 3: Sản phẩm PCR với khuôn là khuẩn lạc
Để khẳng định chắc chắn đoạn gen mã hóa protease HIV-1 đã đƣợc chèn vào pET28a đúng trình tự và đúng vị trí khung đọc mở, chúng tôi tiến hành tinh sạch plasmid và giải trình tự đoạn gen mã hóa protease HIV-1 trong vector pET28a-Prot, kết quả thu đƣợc (không nêu chi tiết ở đây) cho thấy đoạn gen mã hóa protease HIV- 1 đọc từ vector tái tổ hợp pET28a-Prot có độ tƣơng đồng 100% với đoạn gen mã hóa protease HIV-1 đọc từ vector tái tổ hợp pCR2.1-Prot và đã đƣợc đƣa vào vector pET28a đúng khung đọc.
Để biểu hiện gen mã cho protease HIV-1, chúng tôi đã biến nạp vector pET28a-Prot vào tế bào E. coli chủng BL21 (DE3) mang pLysS và cấy trải trên môi trƣờng LB có chứa kanamycin 50 g/ml và chloramphenicol 34 μg/ml. plysS là plasmid mang gen mã hóa cho T7 lysozyme, có khả năng ức chế sự biểu hiện trƣớc khi cảm ứng bằng IPTG của các gen ngoại lai do T7 RNA polymerase phiên mã và
có thể gây độc cho tế bào E. coli. Do đó, khi có mặt plysS và IPTG thì tế bào có thể biểu hiện cả những protein rất độc cho chính tế bào.
Tế bào vi khuẩn mang vector pET28a-Prot đƣợc nuôi cấy cảm biến biểu hiện gen bằng IPTG nồng độ 0,25 mM ở 37oC; thu nhận dịch chiết tế bào trong đệm A bằng cách siêu âm phá vỡ tế bào và ly tâm để thu di ̣ch chiết protein tổng số . Tiếp theo , dịch chiết tế bào đƣợc cho sắc ký qua cột ái lực Ni -agarose cũng đã đƣơ ̣c cân bằng trƣớc với đê ̣m A , rửa chiết phần protein gắn trên cột bằng imidazol 250 mM pha trong đệm A.
Kết quả điện di SDS-PAGE ở hình 3.8A cho thấy dịch chiết tế bào và d ịch rửa chiết qua cột Ni-agarose ở nồng độ imidazol 250 mM đều cho băng protein KLPT khoảng 13 kDa. Kết quả thẩm tách miễn dịch sử dụng kháng thể đơn dòng kháng protease HIV-1 (hình 3.8B) cho thấy băng protein 13 kDa trong dịch chiết tế bào cũng nhƣ trong phân đoạn sau sắc ký cột Ni-agarose đƣợc nhận ra bởi kháng thể đơn dòng kháng protease HIV-1, điều này khẳng định gen mã hóa protease HIV-1 trong hệ thống vector pET28a đƣợc biểu hiện ở E. coli.
Kết quả của thí nghiệm cũng cho thấy phân đoạn protein tinh sạch qua cột Ni-agarose (hình 3.8A, đƣờng chạy 3), ngoài băng 13 kDa là của protease HIV-1 còn lẫn các băng protein khác.
Một số nghiên cứu tinh sạch protease HIV-1 tái tổ hợp của các tác giả khác (Darke và tâ ̣p thể , 1989; Danley và tâ ̣p thể , 1989; Taylor và tâ ̣p thể , 1992; Rose và tâ ̣p thể 1993; Ohtaka và tâ ̣p thể 2003) đã sử dụng cột trao đổi anion (DEAE- sepharose, DE-52 cellulose, mono Q-sepharose) bên cạnh các cột ái lực. Vì vậy, để loại bỏ các protein có ái lực với cột Ni-agarose còn tạp nhiễm trong phân đoạn protease HIV-1 sau khi tinh sạch, chúng tôi tiếp tục tiến hành cho sắc ký chế phẩm protease HIV-1 thu đƣợc qua cột trao đổi anion DE-52 cellulose. Cột gel kích thƣớc 1 x 3 cm đƣợc cân bằng với đệm D và đƣợc rửa chiết bằng NaCl 1M pha trong đệm D. Protein đƣợc cô và loại muối bằng centricon 3 kDa và đƣợc kiểm tra độ tinh sạch bằng điện di trên gel SDS-PAGE 15%.
Hình 3.8. SDS-PAGE (A) và thẩm tách miễn dịch (B) các phân đoạn tinh sạch dịch chiết tế bào E. coli BL21 (DE3) plysS mang pET28a- Prot qua cột Ni-agarose
1A, 1B: Thang chuẩn protein nhuộm sẵn
2A, 5B: Dịch chiết tế bào E. coli BL21 (DE3) plysS mang pET28a+IPTG
3A, 6B: Phân đoạn rửa chiết qua cột Ni-agarose
2B: Dịch chiết tế bào E. coli BL21 (DE3) plysS mang pET28a 3B: Dịch chiết tế bào E. coli BL21 (DE3) mang pET28a-Prot+IPTG 4B: Dịch chiết tế bào E. coli BL21(DE3)pLysS mang pET28a-Prot Kết quả điện di ở hình 3.9 cho thấy phân đoạn rửa chiết qua cột DE-52 cellulose có băng protein với KLPT khoảng 13 kDa (đƣờng chạy 4) tƣơng tự nhƣ phân đoạn rửa chiết qua cột Ni-agarose (đƣờng chạy 2). Tuy vậy, chế phẩm vẫn còn lẫn một số băng protein không mong muốn khác.
Chúng tôi cũng đã thử nghiệm khả năng thu nhận protease HIV-1 trong phân đoạn tủa tế bào bằng cách tƣơng tự, tuy vậy băng protein 13 kDa chỉ xuất hiện ở mức mờ nhạt.
Đồng thời với việc tìm cách tinh sạch protease HIV-1 biểu hiện đƣợc chúng tôi đã tiến hành xác định xem protease HIV-1 tái tổ hợp có hoạt tính cắt cơ chất đặc hiệu hay không. Kết quả xác định hoạt độ của chế phẩm protease HIV-1 thu đƣợc (hình 3.10) cho thấy enzyme biểu hiện ở hệ thống vector pET28a không thể
hiện hoạt tính phân cắt cơ chất tổng hợp (không làm giảm độ hấp thụ ở bƣớc 300 nm của cơ chất). Trong khi đó protease HIV-1 thƣơng mại (Anaspec) thể hiện rõ hoạt tính thủy phân cơ chất và bị ức chế bởi pepstatin A.
Hình 3.9. SDS-PAGE kiểm tra độ sạch của protease HIV-1 biểu hiện trên pET28a-Prot sau khi sắc ký qua cột Ni-agarose và cột DE-52 cellulose
1: Thang chuẩn protein nhuộm sẵn
2: Phân đoạn rửa chiết qua cột Nickel-agarose 3: Dịch không gắn cột DE-52 cellulose
4: Phân đoạn rƣ̉a chiết qua cột DE-52 cellulose
Rangwala và tập thể (1992) khi thiết kế biểu hiện protease HIV-1 với các trình tự axit amin mở đầu khác nhau cho thấy protease HIV-1 chỉ mở đầu bằng Pro và ở dạng homodimer mới có hoạt tính, trong trƣờng hợp axit amin mở đầu là Met- Ala hoặc Ala, protease sẽ giảm hoặc không có hoạt tính. Cấu trúc dimer của protease HIV-1 liên quan đến trình tƣ̣ axit amin đầu N và C của sƣ̣ hình thành phiến gấp nếp . Vì vậy, sƣ̣ có mặt của các axit amin thêm tại đầu N hoặc đầu C có thể dẫn đến tƣơng tác giữa các axit amin làm cho không hình thành cấu trúc . Điều này có thể lý giải vì sao protea se biểu hiện trong hệ thống pET28a-Prot của chúng tôi không có hoạt tính. Hơn nữa, kết quả nghiên cứu ở trên cũng cho thấy lƣợng enzyme đƣợc biểu hiện còn rất thấp nên cần phải thay đổi giải pháp biểu hiện.
Hình 3.10. Hoạt tính cắt cơ chất tổng hợp của protease HIV-1 biểu hiện ở pET28a
(): Protease HIV-1 thƣơng mại , (): Protease HIV-1 tái tổ hợp, (): Protease HIV-1 thƣơng mại + pepstatin A, (): Protease HIV-1 tái tổ hợp bị xử lý nhiệt ở
95oC, 5 phút
3.2.2. Nghiên cứu biểu hiện gen mã hóa protease HIV-1 bằng vector pET32a và pET43a pET43a
Sự mở đầu bằng axit amin Pro tại đầu N của protease HIV-1 có vai trò rất quan trọng trong hình thành cấu trúc homodimer và quyết định hoạt tính của protease HIV-1. Vì vậy, nhiều nghiên cứu đã biểu hiện gen gag-pol ở vi khuẩn
E. coli và chứng minh rằng protease có chức năng tự cắt ở E. coli tƣơng tự nhƣ trong quá trình hình thành HIV-1 tự nhiên. Trong quá trình biểu hiện, protease HIV-1 sẽ cắt protein pol tại những vị trí đặc hiệu và giải phóng ra dạng protease có hoạt tính (Kräusslich và tâ ̣p thể , 1989; Danley và tập thể , 1989; Baum và tâ ̣p thể, 1990; Taylor và tâ ̣p thể , 1992; Mildner và tâ ̣p thể , 1994).
Vì vậy, chúng tôi đã lựa chọn giải pháp biểu hiện protease HIV-1 dƣới dạng dung hợp với protein khác qua phần trình tự nhận biết và phân cắt (trình tự tƣ̣ cắt ) của chính protease HIV-1. Khi protease dung hợp đƣợc tạo ra nếu có hoạt tính tự cắt thì sẽ giải phóng ra dạng mở đầu bằng Pro và có hoạt tính. Trình tự tƣ̣
cắt đƣơ ̣c ch ọn là 21 nucleotide GGAACTGTATCCTTTAACTTC mã hóa cho 7 axit amin GTVSFNF ở đầu C của protein gag có trong cấu trúc tự nhiên của HIV-1. Khi biểu hiện protease HIV-1 sẽ cắt tại liên kết giữa F (Phe) trên trình tự này với P (Pro) của protease để giải phóng ra protease HIV-1 mở đầu bằng Pro.
Ngoài ra, các nghiên cứu khác nhau cũng cho thấy sử dụng các gốc protein dung hợp với protein đích cho phép tăng hiệu suất biểu hiện và độ tan của protein tái tổ hợp tạo thành. Cho đến nay, các protein dung hợp làm tăng mức độ biểu hiện của protein đích đƣợc xếp loại là: TRX > SUMO ~ NusA > Ub ~ MBP ~ GST và thứ tự các protein làm tăng mức độ hòa tan của protein đích là: SUMO ~ NusA > Ub ~ GST ~ MBP ~ TRX (Chelur và tâ ̣p thể, 2008).
Dựa trên tất cả các tiêu chí cần thiết để thiết kế hệ thống biểu hiện protease HIV-1 có hoạt tính, chúng tôi lựa chọn hai hệ thống vector pET32a và pET43a cho biểu hiện protease HIV-1 trong các nghiên cứu tiếp theo. Cả hai hệ thống vẫn sử dụng promoter T7 và T7 RNA polymerase đƣợc xem là hai công cụ điều khiển biểu hiện protein mạnh nhất hiện nay, giống nhƣ hệ thống vector pET28a.
Vector pET32a có kích thƣớc 5,9 kb, có protein dung hợp Thioredoxin (TRX) ở đầu N làm tăng mức độ biểu hiện của protease HIV-1 và 6xHis ở đầu C ngay trƣớc mã kết thúc để thuận tiện cho quá trình tinh sạch bằng cột ái lực. Tƣơng tự, pET43a có protein dung hợp NusA ở đầu N làm tăng độ hòa tan của protease HIV-1 và 6xHis ở đầu C ngay trƣớc mã kết thúc.
Để biểu hiện protease HIV-1 trên hai hệ thống này, chúng tôi đã thiết kế lại trình tự mồi nhƣ ở hình 3.11. Trong đó, ngoài phần trình tự bắt cặp với gen mã hóa protease HIV-1 giống với cặp mồi HIV-F2/HIV-R2, trên mồi HIV-F3 còn có: i) trình tự cắt giới hạn của cả BamHI và SpeI để biểu hiện đồng thời protease HIV-1 trên cả hai hệ thống pET32a và pET43a; ii) 21 nucleotide mã hóa cho 7 axit amin đầu C của protein gag mang trình tự tự cắt của protease HIV-1. Trên mồi HIV-R3 có trình tự cắt giới hạn của XhoI, khi đƣa gen mã hóa protease HIV-1 vào pET32a và pET43a tại vị trí này sẽ tạo cho đầu C của protease đƣợc dung hợp với 6xHis ngay trƣớc bộ ba kết thúc dịch mã. Với cặp mồi này đoạn gen mã hóa protease HIV-1 nhân bản đƣợc bằng PCR sẽ có kích thƣớc khoảng 345 bp.
Hình 3.11. Trình tự mồi HIV-F3 và HIV-Rv3 để biểu hiện gen mã hóa protease HIV-1 trên hai hệ thống vector pET32a và pET43a
Theo thiết kế nêu trên, ở hệ thống pET32a nếu không xảy ra hoạt tính tự cắt của protease HIV-1 tại liên kết Phe-Pro; protease HIV-1 tái tổ hợp đƣợc tạo thành sẽ có KLPT khoảng 31 kDa. Tƣơng tự ở hệ thống pET43a, protease HIV-1 tái tổ hợp nếu không tự cắt sẽ có KLPT 67 kDa. Nếu tự cắt xảy ra tại vị trí Phe-Pro, ở cả hai vector đều giải phóng protease tái tổ hợp (protease-His) có KLPT khoảng 12 kDa. Nhƣ vậy, nếu có sự xuất hiện của protease HIV-1 với KLPT khoảng 12 kDa thì chứng tỏ enzyme này có hoạt tính tự cắt in vivo ở tế bào vật chủ E. coli và là dấu hiệu chứng tỏ enzyme có hoạt tính. Ngoài ra, protease HIV-1 tái tổ hợp này có đuôi 6xHis, thuận lợi cho quá trình tinh sạch bằng cột sắc ký ái lực.
Đầu tiên, chúng tôi sử dụng cặp mồi HIV-F3/HIV-R3 để tiến hành nhân bản đoạn gen mã hóa protease HIV-1 trong vector pCR2.1-Prot bằng PCR nhằm cài thêm các trình tự bổ sung vào đoạn gen. Sản phẩm PCR sau đó đƣợc nhân dòng vào vector pGEM-T (hình thành pGEM-Prot) và xác định trình tự để khẳng định chính xác cấu trúc gen thiết kế. Kết quả xác định trình tự gen (hình 3.12) cho thấy đoạn gen mã hóa protease HIV-1 trong pGEM-Prot có độ tƣơng đồng 100% so với đoạn gen mã hóa protease HIV-1 từ vector pCR2.1-Prot. Ngoài ra, trên trình tự gen mã