Để nhân bản đoạn gen mã hóa cho protease HIV-1, chúng tôi đã dùng kỹ thuật RT-PCR lồng với cặp mồi ngoài ký hiệu là HIV-F1 và HIV-R1 cho phép nhân bản đoạn gen có kích thƣớc khoảng 800 bp (Lech và tâ ̣p thể , 1996) cùng với c ặp mồi trong ký hiệu HIV-F2 và HIV-R2 dựa trên trình tự đoạn gen 297 bp mã hóa cho protease HIV-1 đã công bố trên ngân hàng gen thế giới (Lech và tâ ̣p thể , 1996; Leuthardt và Roesel, 1993). Ngoài ra, để thuận lợi cho việc biểu hiện về sau, chúng tôi đã thiết kế thêm vị trí cắt giới hạn của enzyme EcoRI và NdeI trên trình tự cặp mồi trong HIV-F2 và HIV-R2. Bằng cách thiết kế này đoạn DNA nhân bản sẽ có kích thƣớc 320 bp.
Trƣớc tiên, tiến hành tinh sạch RNA virus từ các mẫu huyết thanh nhiễm và không nhiễm HIV-1 và chuyển thành cDNA bằng phản ứng có enzyme reverse transcriptase. Sau đó, đoạn cDNA này đƣợc sử dụng làm khuôn cho phản ứng PCR lồng với 2 cặp mồi đặc hiệu HIV-F1/HIV-R1 và HIV-F2/HIV-R2 nêu trên. Sau các thử nghiệm khác nhau, chúng tôi đã tìm đƣợc nồng độ mồi thích hợp để nhân bản đoạn gen mã hóa protease HIV-1 là 10 pmol/25 l thể tích phản ứng với 2 vòng PCR nối tiếp nhau; vòng 1 (cặp mồi HIV-F1/HIV-R1) gồm 35 chu kỳ của chế độ nhiệt là 94oC-40 giây để biến tính DNA, 45oC-60 giây để gắn mồi và 72oC-30 giây để kéo dài chuỗi. Sản phẩm PCR (1,5 µl) sau đó đƣợc dùng làm khuôn cho PCR vòng 2 (cặp mồi HIV-F2/HIV-R2) gồm 35 chu kỳ phản ứng: 94oC-40 giây để biến tính DNA, 53oC-30 giây để gắn mồi và 72oC-30 giây để kéo dài chuỗi.
Kết quả điện di sản phẩm RT-PCR trên gel agarose 2% (hình 3.1) cho thấy các mẫu máu dƣơng tính với HIV-1 (theo xét nghiệm của bệnh viện) đều có băng DNA nhân bản với kích thƣớc khoảng 0,32 kb. Trong khi đó, mẫu đối chứng âm, không nhiễm HIV-1 thì không xuất hiện băng DNA nào.
Hình 3.1. Điện di sản phẩm RT-PCR lồng các mẫu máu nhiễm và không nhiễm HIV
1: Thang chuẩn DNA 100 bp
2: Sản phẩm RT-PCR lồng đối chứng (-) không nhiễm HIV 3, 4: Sản phẩm RT-PCR lồng các mẫu máu nhiễm HIV
Nhƣ vậy, sản phẩm nhân bản thu đƣợc có kích thƣớc nhƣ tính toán lý thuyết. Kết quả này chứng tỏ việc sử dụng 2 cặp mồi đã thiết kế cho phép nhân bản thành công đoạn gen mã hóa protease HIV-1 từ huyết thanh bệnh nhân nhiễm HIV-1.